Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Streszczenie

Neurobiolodzy badają funkcje mózgu, analizując sposób komunikacji między neuronami. Wielu badaczy przygląda się zmianom w aktywności elektrycznej jednego lub kilku neuronów w odpowiedzi na kontrolowany eksperymentalnie bodziec. Aktywność elektryczną neuronów można rejestrować w wyizolowanych skrawkach mózgu, stosując techniki patch clamp z wykorzystaniem szklanych mikropipet. Tradycyjnie eksperymentatorzy mogą naśladować wejście neuronalne poprzez bezpośrednią iniekcję prądu przez pipetę, stymulację elektryczną innych komórek lub pozostałych połączeń aksonalnych w skrawku, bądź manipulację farmakologiczną receptorów znajdujących się w błonie neuronalnej rejestrowanej komórki.

Wstrzykiwanie prądu stałego charakteryzuje się zaletami takimi jak możliwość wprowadzenia z góry określonej formy przebiegu prądu z wysoką precyzją czasową w miejscu rejestracji (zazwyczaj w somie). Jednak metoda ta nie zmienia oporności błony neuronalnej, ponieważ nie dochodzi do fizycznego otwarcia kanałów jonowych. Wstrzykiwanie prądu zazwyczaj wykorzystuje impulsy prostokątne, przez co nie modeluje kinetyki kanałów jonowych. Wreszcie, wstrzykiwanie prądu nie pozwala na odtworzenie zmian chemicznych w komórce, które występują podczas otwierania kanałów jonowych.

Receptory mogą być aktywowane fizycznie poprzez stymulację elektryczną lub farmakologiczną. W przypadku stymulacji elektrycznej skrawka badacz dysponuje wysoką precyzją czasową aktywacji receptorów. Istnieje jednak ograniczona precyzja przestrzenna aktywacji, a dokładny charakter elementów aktywowanych podczas stymulacji pozostaje nieznany. Ten drugi problem można częściowo rozwiązać za pomocą specyficznych czynników farmakologicznych. Niestety, przebieg czasowy aktywacji czynników farmakologicznych jest zazwyczaj powolny, a precyzja przestrzenna sygnałów wejściowych do rejestrowanej komórki nie jest znana.

Technika dynamicznego zacisku (dynamic clamp) pozwala eksperymentatorowi na zmianę prądu podawanego bezpośrednio do komórki w oparciu o sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym dotyczące potencjału błonowego komórki (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; przegląd patrz: Prinz et al. 2004). Umożliwia to odwzorowanie zmian elektrycznych występujących w miejscu pomiaru w odpowiedzi na aktywację receptora. Zmiany prądu przyłożonego w czasie rzeczywistym są wyznaczane przez równanie matematyczne zaimplementowane w sprzęcie.

Niedawno wykorzystaliśmy technikę dynamicznego zacisku (dynamic clamp) do zbadania generowania serii potencjałów czynnościowych poprzez fazową aktywację receptorów NMDA w neuronach dopaminergicznych istoty czarnej części rozp𝓇zadzonej (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). W tym filmie prezentujemy procedury niezbędne do wprowadzenia konduktancji receptora NMDA do neuronu dopaminergicznego.

Protokół

1. Przygotowanie skrawków

1. Wyciąć skrawki mózgu za pomocą wibrotomu. Przygotowaliśmy poziome skrawki śródmózgowia o grubości 240 μm od szczura Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) znieczulonego izofluranem, używając wibrotomu (Microm HM 650V) zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.
2. Przechowywać skrawki w komorze inkubacyjnej do momentu rozpoczęcia rejestracji. Użyliśmy pojemnika inkubacyjnego podgrzanego do 32°C i wypełnionego sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF; w mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 4 MgCl₂, 2 CaCl₂, 10 dekstrozy, 25 NaHCO₃, 1.3 kwasu askorbinowego, 2.4 pirogronianu sodu oraz 0.05 glutationu.

2. Rejestracja elektrofizjologiczna

1. Przenieś skibek do zestawu do rejestracji wewnątrzkomórkowej, w którym perfundowany jest sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) o temperaturze 35°C. Stosujemy ten sam aCSF co w punkcie 1.2, z wyjątkiem zastosowania 2mM MgCl₂ oraz pominięcia glutationu. W przypadku skibków przygotowanych poziomo, zazwyczaj przecinamy je wzdłuż linii środkowej.
2. Zlokalizuj docelowy neuron. Pojedyncze neurony dopaminergiczne istoty czarnej wizualizowaliśmy za pomocą systemu obrazowania gradientowego.
3. Wytocz elektrodę za pomocą elektronicznego wytaczarki do elektrod. Elektrody o oporności końcówki 4-10 MΩ wytaczamy przy użyciu wytaczarki P97 Micropipette (Sutter Instrument Company).
4. Wypełnij elektrodę odpowiednim roztworem wewnętrznym. Stosujemy roztwór zawierający (w mM): 138 K-gluconate, 10 HEPES, 2 MgCl₂, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl₂, 4 Na-ATP, 0.4 Na-GTP. pH roztworu wewnętrznego skorygowano do poziomu 7.3 za pomocą 1M KOH, a osmolalność do 270-275 mOsms.
5. Utwórz uszczelnienie gigaohmowe (gigaohm seal) na wybranym neuronie. Przerwij uszczelnienie za pomocą ssania. Stanowi to rejestrację z całej komórki (whole cell recording). W naszej konfiguracji wykorzystano wzmacniacz Multiclamp 700B. Wzmacniacz należy następnie ustawić w trybie clamp prądowy „I=0”.

3. Zastosowanie konduktancji z dynamicznym zaciskiem (Dynamic Clamp)

1. Program RTXI (www.rtxi.org) został uruchomiony na komputerze do dynamicznego zacisku (dynamic clamp). Do pamięci wczytano specjalnie opracowany model zawierający receptor NMDA. Prąd wstrzykiwany do komórki w czasie rzeczywistym jest obliczany według następującego równania:
   I_NMDA = -g_NMDA * [1/(1+([Mg]/3.57) * e(^-V_m^*0.062))] * (V_m - E_NMDA) gdzie g_NMDA to pożądana przewodność (w nS; domyślnie ustawiona na 0 nS), [Mg] to stężenie magnezu (w naszym przykładzie poniżej ustawione na 1.5 mM), E_NMDA to potencjał odwracania dla receptora NMDA (ustawiony na 0 mV), a V_m to potencjał błonowy komórki mierzony przez wzmacniacz (w miliwoltach).
2. Wyjście z komputera do dynamicznego zacisku zostało podłączone do wejścia Command wzmacniacza poprzez przetwornik analogowo-cyfrowy.
3. Wzmacniacz został ustawiony w trybie zacisku prądowego „IC”.
4. Wprowadź pożądaną przewodność receptora NMDA do programu RTXI (np. 40nS). Powinien pojawić się fazowy wybuch potencjałów czynnościowych. Alternatywnie, przewodność może być dostarczona do RTXI poprzez wyjście analogowe (Rysunek 1A, „g(t)”). W programie RTXI należy zastosować odpowiedni współczynnik skalujący, aby przeliczyć sygnał z woltów na Siemensy.

4. Reprezentatywne wyniki

Prawidłowa konfiguracja do aplikacji przewodnictwa przy użyciu dynamicznej klamry (dynamic clamp) została przedstawiona na rysunku 1A. Wykorzystując ten układ, wykonaliśmy rejestrację somatyczną z całej komórki neuronu dopaminergicznego w części zwartej istoty czarnej (substantia nigra pars compacta). Komórki dopaminergiczne zazwyczaj wykazują spontaniczną aktywność o niskiej częstotliwości z wzorcem przypominającym rozrusznik. Serię potencjałów czynnościowych można wywołać poprzez fazową aplikację przewodnictwa receptora NMDA za pomocą dynamicznej klamry (rysunek 1B).

Rycina 1: Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA z wykorzystaniem techniki dynamicznego zaciskania (dynamic clamp). A. Konfiguracja sprzętowa przedstawiająca połączenia między układem do rejestracji wewnątrzkomórkowej a komputerem dynamicznego zaciskania. B. Seria potencjałów czynnościowych wywołana zastosowaniem przewodnictwa receptora NMDA o wartości 40nS w rejestracji z całej komórki (whole cell) neuronu dopaminergicznego z części zwartej istoty czarnej (substantia nigra pars compacta).

Dyskusja

Przedstawiona tutaj technika dynamicznego zaciskania (dynamic clamp) ulepsza tradycyjną metodę bezpośredniej iniekcji prądu, umożliwiając eksperymentatorowi symulowanie efektów elektrycznych wynikających z aktywacji receptora. W tym filmie pokazaliśmy, że do spontanicznej aktywności neuronu dopaminergicznego można dodać efekty aktywacji receptora NMDA, co wywołuje serię potencjałów czynnościowych.

Dzięki elastyczności implementacji sprzętowej i programowej można zastosować szereg rozszerzeń. Znak wstrzykiwanego prądu może zostać zmieniony z ujemnego na dodatni, co odzwierciedla scenariusz, w którym efekty aktywacji receptora w neuronie zostają zniesione. Neurony modelowe, przedstawione w postaci układu równań różniczkowych, mogą być również rozwiązywane numerycznie, co pozwala eksperymentatorowi na badanie niewielkich sieci.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
K-glukonian bezwodny	Odczynnik	Sigma-Aldrich
HEPES	Odczynnik	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Odczynnik	Fisher Scientific
Kwas etylenoglikol-bis(B-amino–etylowy eteru)-N,N,N’,N’-tetraoctowy	Odczynnik	Sigma-Aldrich
MgATP	Odczynnik	MP Biomedicals
NaGTP	Odczynnik	MP Biomedicals
MgCl2	Odczynnik	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Odczynnik	Sigma-Aldrich
KCl	Odczynnik	Fisher Scientific
NaH2PO4, bezwodny	Odczynnik	Fisher Scientific
Glukoza	Odczynnik	Acros Organics
NaCl	Odczynnik	Fisher Scientific
CholCl	Odczynnik	Sigma-Aldrich
Pirowinian sodu	Odczynnik	Fisher Scientific
Kwas askorbinowy	Odczynnik	Acros Organics
Glutation	Odczynnik	Sigma-Aldrich
Mikroskop Olympus BX51WI (z obiektywem 40x)	Mikroskop	Olympus Corporation
2 przetworniki A/C	Sprzęt	Dowolny dostawca
Multiclamp 700B z głowicą CV-7B	Sprzęt	Molecular Devices
Wytwornica mikroelektrod P-97 Flaming/Brown	Sprzęt	Sutter Instrument Co.
Igły do strzykawek Microfil	Sprzęt	World Precision Instruments, Inc.
Mikromanipulator	Sprzęt	Siskiyou, Inc.
Monitor	Sprzęt	Triview