W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurobiolodzy badają funkcje mózgu, analizując sposób komunikacji między neuronami. Wielu badaczy przygląda się zmianom w aktywności elektrycznej jednego lub kilku neuronów w odpowiedzi na kontrolowany eksperymentalnie bodziec. Aktywność elektryczną neuronów można rejestrować w wyizolowanych skrawkach mózgu, stosując techniki patch clamp z wykorzystaniem szklanych mikropipet. Tradycyjnie eksperymentatorzy mogą naśladować wejście neuronalne poprzez bezpośrednią iniekcję prądu przez pipetę, stymulację elektryczną innych komórek lub pozostałych połączeń aksonalnych w skrawku, bądź manipulację farmakologiczną receptorów znajdujących się w błonie neuronalnej rejestrowanej komórki.
Wstrzykiwanie prądu stałego charakteryzuje się zaletami takimi jak możliwość wprowadzenia z góry określonej formy przebiegu prądu z wysoką precyzją czasową w miejscu rejestracji (zazwyczaj w somie). Jednak metoda ta nie zmienia oporności błony neuronalnej, ponieważ nie dochodzi do fizycznego otwarcia kanałów jonowych. Wstrzykiwanie prądu zazwyczaj wykorzystuje impulsy prostokątne, przez co nie modeluje kinetyki kanałów jonowych. Wreszcie, wstrzykiwanie prądu nie pozwala na odtworzenie zmian chemicznych w komórce, które występują podczas otwierania kanałów jonowych.
Receptory mogą być aktywowane fizycznie poprzez stymulację elektryczną lub farmakologiczną. W przypadku stymulacji elektrycznej skrawka badacz dysponuje wysoką precyzją czasową aktywacji receptorów. Istnieje jednak ograniczona precyzja przestrzenna aktywacji, a dokładny charakter elementów aktywowanych podczas stymulacji pozostaje nieznany. Ten drugi problem można częściowo rozwiązać za pomocą specyficznych czynników farmakologicznych. Niestety, przebieg czasowy aktywacji czynników farmakologicznych jest zazwyczaj powolny, a precyzja przestrzenna sygnałów wejściowych do rejestrowanej komórki nie jest znana.
Technika dynamicznego zacisku (dynamic clamp) pozwala eksperymentatorowi na zmianę prądu podawanego bezpośrednio do komórki w oparciu o sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym dotyczące potencjału błonowego komórki (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; przegląd patrz: Prinz et al. 2004). Umożliwia to odwzorowanie zmian elektrycznych występujących w miejscu pomiaru w odpowiedzi na aktywację receptora. Zmiany prądu przyłożonego w czasie rzeczywistym są wyznaczane przez równanie matematyczne zaimplementowane w sprzęcie.
Niedawno wykorzystaliśmy technikę dynamicznego zacisku (dynamic clamp) do zbadania generowania serii potencjałów czynnościowych poprzez fazową aktywację receptorów NMDA w neuronach dopaminergicznych istoty czarnej części rozp𝓇zadzonej (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). W tym filmie prezentujemy procedury niezbędne do wprowadzenia konduktancji receptora NMDA do neuronu dopaminergicznego.
Protokół
1. Przygotowanie skrawków
- Przygotuj skrawki mózgu za pomocą wibrotomu. Przygotowaliśmy poziome skrawki śródmózgowia o grubości 240 μm od szczura linii Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) znieczulonego izofluranem, używając wibrotomu (Microm HM 650V) zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.
- Przechowuj skrawki w komorze inkubacyjnej do momentu rozpoczęcia rejestracji. Użyliśmy pojemnika inkubacyjnego podgrzanego do 32°C i wypełnionego sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF; w mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 2 CaCl2, 10 dekstrozy, 25 NaHCO3, 1.3 kwasu askorbinowego, 2.4 pirogronianu sodu oraz 0.05 glutationu.
2. Rejestracja elektrofizjologiczna
- Przenieś skrawek do zestawu do rejestracji wewnątrzkomórkowej, w którym perfundowany jest sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) o temperaturze 35°C. Stosujemy ten sam aCSF co w punkcie 1.2, z wyjątkiem zastosowania 2mM MgCl2 oraz pominięcia glutationu. W przypadku skrawków przygotowanych poziomo, zazwyczaj przecinamy skrawek wzdłuż linii środkowej.
- Wizualizuj neuron docelowy. Wizualizowaliśmy poszczególne neurony dopaminergiczne istoty czarnej za pomocą systemu obrazowania gradientowego kontrastu.
- Wytnij elektrodę za pomocą elektronicznego wyciągacza elektrod. Wytnigamy elektrody o oporności końcówki od 4-10 MΩ, używając wyciągacza mikropipet P97 (Sutter Instrument Company).
- Napełnij elektrodę odpowiednim roztworem wewnętrznym. Stosujemy roztwór zawierający (w mM): 138 K-glukonianu, 10 HEPES, 2 MgCl2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. pH roztworu wewnętrznego dostosowano do wartości 7,3 za pomocą 1M KOH, a osmolarność do poziomu 270-275 mOsms.
- Utwórz uszczelnienie gigaohmowe (giga-seal) na wybranym neuronie. Przerwij uszczelnienie za pomocą ssania. Czynność ta stanowi rozpoczęcie rejestracji z całej komórki (whole cell recording). W naszej konfiguracji wykorzystano wzmacniacz Multiclamp 700B. Wzmacniacz należy następnie przełączyć w tryb zacisku prądowego „I=0”.
3. Zastosowanie konduktancji z dynamicznym zaciskiem (Dynamic Clamp)
- Program RTXI (www.rtxi.org) został uruchomiony na komputerze do dynamicznego zacisku (dynamic clamp). Do pamięci załadowano stworzony na zamówienie model zawierający receptor NMDA. Prąd wstrzykiwany do komórki w czasie rzeczywistym jest obliczany według następującego równania:
INMDA = -gNMDA * [1/(1+([Mg]/3.57) * e(-Vm*0.062))] * (Vm - ENMDA) gdzie gNMDA to pożądana przewodność (w nS; domyślnie ustawiona na 0 nS), [Mg] to stężenie magnezu (w naszym poniższym przykładzie ustawione na 1.5 mM), ENMDA to potencjał odwracania dla receptora NMDA (ustawiony na 0 mV), a Vm to potencjał błonowy komórki mierzony przez wzmacniacz (w milivoltach). - Wyjście z komputera do dynamicznego zacisku zostało podłączone do wejścia Command wzmacniacza za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego.
- Wzmacniacz został ustawiony w trybie zacisku prądowego (current clamp) „IC”.
- Wprowadź w RTXI pożądaną przewodność receptora NMDA (np. 40nS). Powinien pojawić się fazowy wybuch potencjałów czynnościowych. Alternatywnie, wartość przewodności może zostać przekazana do RTXI poprzez wyjście analogowe (Rysunek 1A, „g(t)”). W programie RTXI należy zastosować odpowiedni czynnik skalujący, aby przeliczyć sygnał z woltów na Siemensy.
4. Reprezentatywne wyniki
Prawidłowa konfiguracja do aplikacji konduktancji z użyciem dynamic clamp przedstawiona jest na rysunku 1A. Korzystając z tego układu, wykonaliśmy rejestrację z całego somy neuronu dopaminergicznego w istocie czarnej części zwartej (substantia nigra pars compacta). Komórki dopaminergiczne zazwyczaj wykazują spontaniczną aktywność o niskiej częstotliwości z wzorcem przypominającym rozrusznik. Serię potencjałów czynnościowych można wywołać poprzez fazową aplikację konduktancji receptora NMDA za pomocą dynamic clamp (rysunek 1B).
Rycina 1: Symulacja przewodnictwa receptora NMDA z wykorzystaniem techniki dynamic clamp. A. Konfiguracja sprzętowa ilustrująca połączenia między zestawem do rejestracji wewnątrzkomórkowej a komputerem dynamic clamp. B. Seria potencjałów czynnościowych wywołana zastosowaniem przewodnictwa receptora NMDA o wartości 40nS w rejestracji whole-cell z neuronu dopaminergicznego istoty czarnej części zwartej.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj technika dynamicznego zaciskania (dynamic clamp) ulepsza tradycyjną metodę bezpośredniej iniekcji prądu, umożliwiając eksperymentatorowi symulowanie efektów elektrycznych wynikających z aktywacji receptora. W tym filmie pokazaliśmy, że do spontanicznej aktywności neuronu dopaminergicznego można dodać efekty aktywacji receptora NMDA, co wywołuje serię potencjałów czynnościowych.
Dzięki elastyczności implementacji sprzętowej i programowej można zastosować szereg rozszerzeń. Znak wstrzykiwanego prądu może zostać zmieniony z ujemnego na dodatni, co odzwierciedla scenariusz, w którym efekty aktywacji receptora w neuronie zostają zniesione. Neurony modelowe, przedstawione w postaci układu równań różniczkowych, mogą być również rozwiązywane numerycznie, co pozwala eksperymentatorowi na badanie niewielkich sieci.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty MH084494 (CJL) oraz MH079276 i NS060658 (CAP).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| K-glukonian bezwodny | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| Kwas etylenoglikol-bis(B-amino–etylowy eteru)-N,N,N’,N’-tetraoctowy | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Odczynnik | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Odczynnik | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, bezwodny | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| Glukoza | Odczynnik | Acros Organics | ||
| NaCl | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| Pirowinian sodu | Odczynnik | Fisher Scientific | ||
| Kwas askorbinowy | Odczynnik | Acros Organics | ||
| Glutation | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| Mikroskop Olympus BX51WI (z obiektywem 40x) | Mikroskop | Olympus Corporation | ||
| 2 przetworniki A/C | Sprzęt | Dowolny dostawca | ||
| Multiclamp 700B z głowicą CV-7B | Sprzęt | Molecular Devices | ||
| Wytwornica mikroelektrod P-97 Flaming/Brown | Sprzęt | Sutter Instrument Co. | ||
| Igły do strzykawek Microfil | Sprzęt | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Mikromanipulator | Sprzęt | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Sprzęt | Triview |
Bibliografia
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
Przedruki i uprawnienia
