Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Podsumowanie

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Streszczenie

Liczba istotnych powiązań genetycznych z powszechnymi złożonymi cechami stale rośnie. Jednak większość tych powiązań nie została jeszcze wyjaśniona na poziomie molekularnym. Jednym z mechanizmów pośredniczących w oddziaływaniu wariantów DNA na fenotypy jest ekspresja genów, która – jak wykazano – ma szczególne znaczenie w przypadku cech złożonych¹.

Metoda ta pozwala przetestować w kontekście komórkowym wpływ specyficznych sekwencji DNA na ekspresję genów. Zasada polega na pomiarze względnej ilości transkryptów pochodzących z dwóch alleli genu poprzez analizę komórek posiadających jedną kopię sekwencji DNA związanych z chorobą (wariantów ryzyka)^2,3. W związku z tym komórki wykorzystywane w tej metodzie powinny spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe: muszą być heterozygotyczne zarówno pod kątem wariantów ryzyka DNA, jak i markerów DNA, zazwyczaj polimorfizmów kodujących, które umożliwiają rozróżnienie transkryptów na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego (Rysunek 1). Warianty ryzyka DNA oraz markery DNA nie muszą mieć tej samej częstotliwości alleli, jednak relacja fazowa (haplotypowa) markerów genetycznych musi być znana. Istotny jest również wybór typów komórek, które wykazują ekspresję analizowanego genu. Niniejszy protokół odnosi się konkretnie do procedury przyjętej w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych z fibroblastów, jednak metoda ta jest równie zastosowalna do innych typów komórek, w tym do komórek pierwotnych.

Z wybranych linii komórkowych ekstrahuje się DNA i RNA, a następnie syntetyzuje cDNA. DNA i cDNA analizuje się za pomocą testu wydłużania starterów, zaprojektowanego tak, aby celować w kodujące markery DNA⁴. Test wydłużania starterów przeprowadza się na platformie MassARRAY (Sequenom)⁵ zgodnie ze specyfikacjami producenta. Produkty wydłużania starterów są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas z detekcją czasu przelotu i jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF/MS). Ponieważ wybrane markery są heterozygotyczne, wygenerują one dwa piki na profilach MS. Pole każdego piku jest proporcjonalne do ilości transkrypcyjnej i może być mierzone za pomocą funkcji oprogramowania MassARRAY Typer w celu obliczenia stosunku allelicznego (allel 1: allel 2). Stosunek alleliczny uzyskany dla cDNA jest normalizowany przy użyciu wartości zmierzonej dla genomowego DNA, gdzie oczekiwany stosunek alleliczny wynosi 1:1, aby skorygować artefakty techniczne. Markery z znormalizowanym stosunkiem allelicznym znacząco różniącym się od 1 wskazują, że ilość transkrypcyjnej generowanej z dwóch chromosomów w tej samej komórce jest różna, co sugeruje, że warianty DNA związane z fenotypem wpływają na ekspresję genów. W celu potwierdzenia wyników należy zastosować kontrole eksperymentalne.

Protokół

1) Hodowla komórkowa

1. Wybrać typy komórek wykazujące ekspresję badanego genu.
2. Wybrać linie komórkowe heterozygotyczne zarówno pod względem wariantów ryzyka DNA, jak i transkrybowanego polimorfizmu kodującego w badanym genie (Rysunek 1).
3. Hodować wybrane linie komórkowe zgodnie ze specyfikacją dostawcy i przygotować dwie szalki Petriego o średnicy 10 cm odpowiednio do ekstrakcji DNA oraz RNA.
4. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, rozpocząć procedurę zbioru komórek i izolacji DNA oraz RNA, postępując zgodnie z opisaną poniżej procedurą lub korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów.

2) Ekstrakcja DNA

1. Usunąć pożywkę z naczynia, przemyć roztworem PBS i dodać do naczynia 500 μL roztworu lizującego (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA i 50 μg/ml RNazy A).
2. Delikatnie kołysać płytką przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Zebrać lizat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi i inkubować w temperaturze 37°C °Inkubować przez noc w temperaturze C.
4. Dodać proteinazę K do stężenia końcowego 100 μg/ml i inkubować w temperaturze 37°C °inkubować w temperaturze C przez noc.
5. Przeprowadź ekstrakcję DNA równą objętością fenolu z chloroformem o pH 8, powtórz czynność, a następnie wykonaj ekstrakcję równą objętością chloroformu z alkoholem izoamylowym.
6. Wytrąć DNA za pomocą 1/10^th objętość 3 M NaCl oraz 2,5 objętości 100% etanolu.
7. Pozostawić na lodzie przez 5 min, a następnie wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 30 min w temperaturze 4°C. °C.
8. Przepłucz DNA 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zawieś ponownie w 200 μL buforu TE.
9. Inkubować w temperaturze 65°C °inkubować w temperaturze C przez 10 min, a następnie pozostawić na 2 dni w temperaturze pokojowej.
10. Przechowywać w temperaturze 4°C °C lub długoterminowo w temperaturze -20°C °C.

3) Izolacja RNA

1. Usunąć pożywkę z naczynia, przemyć PBS, dodać 1 mL TRIzol i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
2. Zeskrobać komórki, pipetować kilka razy, przenieść do probówki do mikrocentryfugi i inkubować przez 5 min.
3. Wirować przez 10 min przy 10,000 rpm w temperaturze 4°C.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać 200 μL chloroformu.
5. Wstrząsnąć i wirować przez 10 min przy 10,000 rpm w temperaturze 4°C.
6. Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość 70% etanolu.
7. Nanieść roztwór na 1 lub 2 (w zależności od objętości) kolumny RNeasy i wirować przez 30 sec z maksymalną prędkością.
8. Dalsze kroki przeprowadzić zgodnie z instrukcją zestawu RNeasy (Qiagen).

4) Przygotowanie próbek kwasów nukleinowych

1. Oznaczyć stężenie DNA i RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific).
2. Przygotować cDNA z 500-1000 ng RNA, wykorzystując przypadkowe dekamery oraz odwrotną transkryptazę SuperScript III (Invitrogen), zgodnie z instrukcjami producenta.

5) PCR i test rozszerzania starterów

1. Zaprojektuj dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji genomowego DNA i drugą parę do amplifikacji cDNA (Ryc. 2). Umieść startery bezpośredni i odwrotny do amplifikacji cDNA w różnych egzonach, aby uniknąć kontaminacji genomowej. Zaprojektuj starter tak, aby uzyskać produkt PCR o długości w zakresie 100-500 bp.
2. Przygotuj 10 μL reakcji PCR zawierającej 0,5 U Immolase Taq (Bioline), 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl₂, po 0,2 M każdego startera oraz 20 ng cDNA lub DNA. Amplifikuj każdą próbkę w czterech niezależnych reakcjach.
3. Przeprowadź reakcję PCR w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary starterów, utrzymując liczbę cykli w fazie liniowej amplifikacji.
4. Usuń nadmiar starterów PCR i dNTPs poprzez inkubację produktu PCR z egzonukleazą I oraz krewetkową fosfatazą alkaliczną (SAP) w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
5. Naniesienie każdego produktu PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, tak aby dla każdej próbki dostępnych było 8 pomiarów.
6. Zaprojektuj starter wydłużający za pomocą oprogramowania Assay Design (Sequenom) w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla genomowych, jak i cDNA produktów PCR. Określ długość startera w zakresie 14-18 bp oraz mieszaninę wydłużającą zawierającą kombinacje 3ddNTPs (Ryc. 2).
7. Przeprowadź reakcję wydłużania starterów oraz analizę MALDI-TOF/MS przy użyciu systemu MassARRAY (Sequenom) zgodnie z instrukcją producenta.
8. Typowa reakcja wydłużania starterów obejmuje krok początkowy w 94 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli w 94 °C przez 5 s, 52 °C przez 5 s i 72 °C przez 5 s.
9. Produkty wydłużania starterów są oczyszczane za pomocą żywicy SpectroCLEAN i przenoszone na mikrotablicę (chip) za pomocą nanolitrowego dozownika SpectroPOINT.
10. Wydłużone oligonukleotydy są ilościowane metodą MALDI-TOF przy użyciu spektrometru mas SpectroREADER.

6) Analiza statystyczna

1. Zweryfikuj wyniki MALDI-TOF/MS za pomocą oprogramowania MassARRAY Typer, aby ocenić ogólną jakość eksperymentu.
2. Wygeneruj raport z allelotypowania, który zawiera dane o powierzchniach pików.
3. Dla każdego pojedynczego widma oblicz stosunek powierzchni piku allelu 1 do powierzchni piku allelu 2 (stosunek powierzchni pików).
4. Dla każdej próbki cDNA oblicz średnią i odchylenie standardowe stosunku powierzchni pików dla 8 pomiarów, korzystając z odpowiedniej funkcji w programie Excel.
5. Oblicz analogiczną średnią stosunku powierzchni pików dla 8 pomiarów w przypadku genomicznego DNA.
6. Podziel średni stosunek dla cDNA przez średni stosunek dla DNA genomicznego, aby ocenić odchylenie od oczekiwanego stosunku 1:1.

7) Kontrole eksperymentalne

1. Aby wykluczyć artefakty eksperymentalne, powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.
2. W miarę możliwości opracuj testy dla dodatkowych markerów DNA.
3. Zaprojektuj wiele par starterów do PCR oraz starterów wydłużających, które hybrydyzują zarówno z nicią sensowną, jak i antysensowną.
4. W miarę możliwości w ramach kontroli negatywnych przetestuj linie komórkowe heterozygotyczne pod kątem markerów DNA, które nie posiadają wariantów ryzyka DNA związanych z danym fenotypem (Ryc. 1 i Ryc. 3)

8) Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy ekspresji specyficznej dla alleli przedstawiono na Rysunku 3 wraz z przykładami śladów spektrometrii masowej. Rysunek obrazuje wyniki analizy 4 produktów wydłużania starterów specyficznych dla alleli, przeprowadzonych na 4 różnych matrycach. Górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, z których obie są heterozygotami w odniesieniu do transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygotą dla wariantu DNA ryzyka (Rysunek 1). Dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych. W wyniku artefaktu eksperymentalnego pierwszy pik jest zawsze wyższy od drugiego piku, nawet w analizie genomicznej. Dlatego wyniki analizy genomicznej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Po normalizacji stosunek alleli w linii komórkowej A różni się znacząco od 1 (gdzie drugi pik wydaje się niższy w porównaniu z pozostałymi widmami), podczas gdy w linii komórkowej B jest on bardzo bliski 1. Dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA, znajdujący się w fazie z allelem mierzoną przez drugi pik, który redukuje ekspresję analizowanego genu. Linia komórkowa B stanowi bardzo wygodną kontrolę negatywną.

Rysunek 1. Strategia wyboru linii komórkowych. Linie komórkowe A i B są heterozygotyczne pod kątem transkrybowanego markera kodującego (trójkąt), ale tylko linia komórkowa A jest heterozygotyczna pod kątem wariantu DNA ryzyka (koło). Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się (poprzez bezpośredni efekt lub ze względu na bliską korelację z rzeczywistym wariantem funkcjonalnym) z niższym poziomem transkrypcji.

Rysunek 2. Analiza specyficznego dla allelu przedłużania starterów. Na rysunku przedstawiono schemat procedury eksperymentalnej przeprowadzonej zarówno dla matryc cDNA (lewo), jak i DNA genomowego (prawo). Startery PCR (szare prostokąty) zostały zaprojektowane w celu amplifikacji heterozygotycznego polimorfizmu kodującego (trójkąt). Aby uniknąć kontaminacji genomowej, startery PCR przyłączają się do sekwencji znajdujących się w różnych egzonach (jasnoniebieskie paski) w przypadku amplifikacji na matrycy cDNA. Produkt PCR jest następnie wykorzystywany jako matryca w reakcji przedłużania startera, przeprowadzonej z użyciem startera przedłużającego, który przyłącza się w odległości jednej zasady od polimorfizmu, oraz odpowiedniej mieszaniny trzech terminatorów dideoksynukleotydowych (ddNTPs) (kwadraty) i jednego deoksynukleotydu (koło), aby przedłużyć starter odpowiednio o jedną lub dwie zasady. Powstające produkty przedłużenia starterów mają różne masy, co umożliwia ich rozdzielenie i ilościowe oznaczenie za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Ilość produktu odpowiadającego niebieskiemu allelowi markera DNA jest relatywnie niższa niż w przypadku allela czerwonego.

Rysunek 3. Wyniki analizy ekspresji allelospecyficznej. Rysunek przedstawia wyniki spektrometrii mas z analizy przeprowadzonej na DNA genomowym oraz cDNA linii komórkowej A i linii komórkowej B (Rysunek 1).

Dyskusja

Metoda ta umożliwia ocenę wpływu wariantów DNA związanych z chorobą na ekspresję genów poprzez analizę różnic allelicznych w poziomie transkryptu in vivo. W niniejszym protokole względną obfitość transkryptu mierzy się za pomocą MALDI-TOF, jednak można zastosować inne technologie umożliwiające kwantyfikację allelocyficzną, takie jak TaqMan^6,7. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest dostępność transkrybowanych markerów kodujących. Opisano metody oparte na przedstawionej tutaj zasadzie, lecz wykorzystujące inne klasy polimorfizmów. Test haploChip mierzy ekspresję allelocyficzną przy użyciu markerów zlokalizowanych w odległości 1 kb od miejsca startu lub końca transkrypcji genu, które byłyby obecne w materiale po immunoprecypitacji chromatyny wyizolowanym za pomocą przeciwciał specyficznych dla polimerazy RNA II⁸. Alternatywnie, gdy matrycą jest heteronuklearne RNA, można wykorzystać SNP intronowe⁹.

Opisany tutaj konkretny protokół, w połączeniu z analizą haploChip, został z sukcesem wykorzystany do zidentyfikowania genu kandydującego w przypadku dysleksji (lub zaburzeń czytania). Początkowo badanie asocjacji genetycznej zidentyfikowało sekwencję DNA powiązaną z dysleksją, która obejmowała trzy geny¹⁰. Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów wykazała, że w obecności wariantów DNA powiązanych z dysleksją zmienność ekspresji zaobserwowano tylko dla jednego z trzech genów, a nie dla pozostałych dwóch¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Sigma-Aldrich	P-4417-100TAB
SDS	Bio-Rad	161-0416
NaCl	VWR international	27788.366
Tris	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
RNaza A	Qiagen	19101
Proteinaza K	Sigma-Aldrich	P2308-500MG
Fenol: chloroform	Sigma-Aldrich	77617
Chloroform	VWR international	100777C
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
Trizol	Invitrogen	15596-018
Zestaw RNeasy	Qiagen	74104
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-044
Immolase Taq	Bioline	BIO-21048
dNTP	Sigma-Aldrich	DNTP100A
Egzonukleaza 1	New England Biolabs	M0293S
Krewetkowa fosfataza alkaliczna	GE Healthcare	E70092Z
Żywica SpectroCLEAN	Sequenom	10053
Mieszanina MassEXTEND ddNTP/dNTP	Sequenom		Zmienna w zależności od projektu analizy
MassEXTEND thermosequenase	Sequenom	10052
Sprzęt
Chłodzona mikrocentryfuga	Eppendorf
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nanolitrowy dozownik SpectroPOINT	Sequenom
Spektrometr masowy SpectroREADER	Sequenom