Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.
Artykuł metodologiczny
Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczba istotnych powiązań genetycznych z powszechnymi złożonymi cechami stale rośnie. Jednak większość tych powiązań nie została jeszcze wyjaśniona na poziomie molekularnym. Jednym z mechanizmów pośredniczących w oddziaływaniu wariantów DNA na fenotypy jest ekspresja genów, która – jak wykazano – ma szczególne znaczenie w przypadku cech złożonych1.
Metoda ta pozwala przetestować w kontekście komórkowym wpływ specyficznych sekwencji DNA na ekspresję genów. Zasada polega na pomiarze względnej ilości transkryptów pochodzących z dwóch alleli genu poprzez analizę komórek posiadających jedną kopię sekwencji DNA związanych z chorobą (wariantów ryzyka)2,3. W związku z tym komórki wykorzystywane w tej metodzie powinny spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe: muszą być heterozygotyczne zarówno pod kątem wariantów ryzyka DNA, jak i markerów DNA, zazwyczaj polimorfizmów kodujących, które umożliwiają rozróżnienie transkryptów na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego (Rysunek 1). Warianty ryzyka DNA oraz markery DNA nie muszą mieć tej samej częstotliwości alleli, jednak relacja fazowa (haplotypowa) markerów genetycznych musi być znana. Istotny jest również wybór typów komórek, które wykazują ekspresję analizowanego genu. Niniejszy protokół odnosi się konkretnie do procedury przyjętej w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych z fibroblastów, jednak metoda ta jest równie zastosowalna do innych typów komórek, w tym do komórek pierwotnych.
Z wybranych linii komórkowych ekstrahuje się DNA i RNA, a następnie syntetyzuje cDNA. DNA i cDNA analizuje się za pomocą testu wydłużania starterów, zaprojektowanego tak, aby celować w kodujące markery DNA4. Test wydłużania starterów przeprowadza się na platformie MassARRAY (Sequenom)5 zgodnie ze specyfikacjami producenta. Produkty wydłużania starterów są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas z detekcją czasu przelotu i jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF/MS). Ponieważ wybrane markery są heterozygotyczne, wygenerują one dwa piki na profilach MS. Pole każdego piku jest proporcjonalne do ilości transkrypcyjnej i może być mierzone za pomocą funkcji oprogramowania MassARRAY Typer w celu obliczenia stosunku allelicznego (allel 1: allel 2). Stosunek alleliczny uzyskany dla cDNA jest normalizowany przy użyciu wartości zmierzonej dla genomowego DNA, gdzie oczekiwany stosunek alleliczny wynosi 1:1, aby skorygować artefakty techniczne. Markery z znormalizowanym stosunkiem allelicznym znacząco różniącym się od 1 wskazują, że ilość transkrypcyjnej generowanej z dwóch chromosomów w tej samej komórce jest różna, co sugeruje, że warianty DNA związane z fenotypem wpływają na ekspresję genów. W celu potwierdzenia wyników należy zastosować kontrole eksperymentalne.
Protokół
1) Hodowla komórek
- Wybrać typy komórek wykazujące ekspresję badanego genu.
- Wybrać linie komórkowe heterozygotyczne zarówno pod kątem wariantów ryzyka DNA, jak i polimorfizmu kodującego w transkrypcie badanego genu (Rysunek 1).
- Hodować wybrane linie komórkowe zgodnie ze specyfikacją dostawcy i przygotować odpowiednio 2 szalki Petriego o średnicy 10 cm do ekstrakcji DNA i RNA.
- Po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji rozpocząć procedurę zbioru komórek oraz izolacji DNA i RNA, stosując procedurę opisaną poniżej lub korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów.
2) Ekstrakcja DNA
- Usunąć pożywkę z naczynia, przemyć PBS i dodać do naczynia 500 μL roztworu lizującego (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA oraz 50 μg/mL RNaza A).
- Delikatnie kołysz płytką przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Przenieś lizat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
- Dodać proteinazę K do stężenia końcowego wynoszącego 100 μg/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
- Wyekstrahować DNA równą objętością fenolu z chloroformem o pH 8, powtórzyć czynność, a następnie wyekstrahować równą objętością chloroformu z alkoholem izoamylowym.
- Wytrącić DNA przy użyciu 1/10th objętość 3 M NaCl oraz 2,5 objętości 100% etanolu.
- Pozostawić na lodzie przez 5 min, a następnie wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 30 min w temperaturze 4 °C.
- Przemyć DNA 70% etanolem, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu i resuspender w 200 μL TE.
- Inkubować w 65 °C przez 10 min, a następnie pozostawić na 2 dni w temperaturze pokojowej.
- Przechowywać w temperaturze 4 °C lub długoterminowo w temperaturze -20 °C.
3) Izolacja RNA
- Usunąć medium z naczynia, przemyć PBS, dodać 1 mL TRIzol i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Zeskrobać komórki, kilka razy pipetować, przenieść do probówki do mikrocentryfugi i inkubować przez 5 min.
- Wirować przez 10 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C.
- Przenieść nadsącz do nowej probówki i dodać 200 μL chloroformu.
- Wstrząsnąć i wirować przez 10 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C.
- Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość 70% etanolu.
- Nanieść roztwór na 1 lub 2 (w zależności od objętości) kolumny RNeasy i wirować przez 30 sec z maksymalną prędkością.
- Następnie postępować zgodnie z instrukcją zestawu RNeasy (Qiagen).
4) Przygotowanie próbki kwasów nukleinowych
- Oznacz stężenie DNA i RNA przy użyciu spektrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific).
- Przygotuj cDNA z 500-1000 ng RNA, wykorzystując random decamers oraz odwrotną transkryptazę SuperScript III (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta.
5) PCR i test wydłużania starterów
- Zaprojektuj dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji DNA genomowego i drugą parę do amplifikacji cDNA (Rys. 2). W przypadku amplifikacji cDNA umieść startery forward i reverse w różnych egzonach, aby uniknąć kontaminacji DNA genomowym. Zaprojektuj startery tak, aby produkt PCR miał długość w zakresie 100-500 bp.
- Przygotuj 10 μL reakcji PCR zawierającej 0.5 U Immolase Taq (Bioline), 0.8 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, po 0.2 M każdego startera oraz 20 ng cDNA lub DNA. Amplifikuj każdą próbkę w czterech niezależnych reakcjach.
- Przeprowadź reakcję PCR w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary starterów, utrzymując liczbę cykli w liniowej fazie amplifikacji.
- Usuń nadmiar starterów PCR i dNTPs poprzez inkubację produktu PCR z egzonukleazą I i fosfatazą alkaliczną krewetkową (SAP) w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Nanieś każdy produkt PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, tak aby dla każdej próbki dostępne było 8 pomiarów.
- Zaprojektuj starter wydłużający za pomocą oprogramowania Assay Design (Sequenom) w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla produktów PCR z DNA genomowego, jak i z cDNA. Określ długość startera w zakresie 14-18 bp oraz mieszaninę wydłużającą zawierającą kombinacje 3ddNTPs (Rys. 2).
- Przeprowadź reakcję wydłużania starterów oraz analizę MALDI-TOF/MS przy użyciu systemu MassARRAY (Sequenom) zgodnie z instrukcją producenta.
- Typowa reakcja wydłużania starterów obejmuje etap wstępny w 94 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli: 94 °C przez 5 s, 52 °C przez 5 s i 72 °C przez 5 s.
- Produkty wydłużania starterów są oczyszczane za pomocą żywicy SpectroCLEAN i przenoszone na matrycę (chip) przy użyciu nanolitrowego dyspensera SpectroPOINT.
- Wydłużone oligonukleotydy są kwantyfikowane metodą MALDI-TOF przy użyciu spektrometru mas SpectroREADER.
6) Analiza statystyczna
- Sprawdź wyniki MALDI-TOF/MS w oprogramowaniu MassARRAY Typer, aby ocenić ogólną jakość eksperymentu.
- Wyeksportuj raport z allelotypowania, który zawiera dane dotyczące pól powierzchni pików.
- Dla każdego pojedynczego widma oblicz stosunek pola powierzchni piku allelu 1 do pola powierzchni piku allelu 2 (stosunek pól powierzchni pików).
- Dla każdej próbki cDNA wyznacz średnią i odchylenie standardowe stosunku pól powierzchni pików dla 8 pomiarów, korzystając z odpowiedniej funkcji w programie Excel.
- Wyznacz analogiczną średnią stosunku pól powierzchni pików dla 8 pomiarów w przypadku genomowego DNA.
- Podziel średni stosunek dla cDNA przez średni stosunek dla DNA genomowego, aby ocenić odchylenie od oczekiwanego stosunku 1:1.
7) Kontrole eksperymentalne
- Aby wykluczyć artefakty eksperymentalne, powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.
- W miarę możliwości opracuj testy dla dodatkowych markerów DNA.
- Zaprojektuj wiele par starterów PCR oraz starterów do elongacji, które hybrydyzują zarówno z nicią sensowną, jak i antysensowną.
- W miarę możliwości w charakterze kontroli negatywnych przetestuj linie komórkowe, które są heterozygotyczne pod kątem markerów DNA, ale nie posiadają wariantów ryzyka DNA związanych z danym fenotypem (Ryc. 1 i Ryc. 3)
8) Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy ekspresji specyficznej dla alleli przedstawiono na rysunku 3 wraz z przykładami śladów spektrometrii mas. Rysunek obrazuje wyniki analizy 4 produktów przedłużania starterów specyficznych dla alleli, przeprowadzonych na 4 różnych matrycach. Górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, które są heterozygotyczne pod kątem transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygotyczna pod kątem wariantu DNA ryzyka (rysunek 1). Dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych. W wyniku artefaktu eksperymentalnego pierwszy pik jest zawsze wyższy od drugiego piku, nawet w analizie genomowej. Dlatego wyniki analizy genomowej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Po normalizacji stosunek alleli w linii komórkowej A znacząco różni się od 1 (gdzie drugi pik wydaje się niższy w porównaniu z pozostałymi spektrami), podczas gdy w linii komórkowej B jest on bardzo bliski 1. Dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA, znajdujący się w fazie z allelem mierzonym przez drugi pik, który obniża ekspresję analizowanego genu. Linia komórkowa B stanowi bardzo dogodną kontrolę negatywną.
Rycina 1. Strategia wyboru linii komórkowych. Linie komórkowe A i B są heterozygotyczne w obrębie transkrybowanego markera kodującego (trójkąt), ale tylko linia komórkowa A jest heterozygotyczna w obrębie wariantu ryzyka DNA (koło). Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się (poprzez bezpośredni efekt lub ze względu na ścisłą korelację z rzeczywistym wariantem funkcjonalnym) z niższym poziomem transkrypcji.
Rycina 2. Test przedłużania starterów allelospecyficznych. Na rycinie przedstawiono schemat procedury eksperymentalnej przeprowadzonej dla matryc cDNA (po lewej) oraz genomowego DNA (po prawej). Startery PCR (szare prostokąty) zostały zaprojektowane tak, aby amplifikować heterozygotyczny polimorfizm kodujący (trójkąt). Aby uniknąć kontaminacji genomowej, podczas amplifikacji z matrycy cDNA startery PCR przyłączają się do sekwencji znajdujących się w różnych egzonach (jasnoniebieskie paski). Produkt PCR jest następnie wykorzystywany jako matryca w reakcji przedłużania startera, przeprowadzonej z użyciem startera przedłużającego, który przyłącza się w pozycji jednej zasady obok polimorfizmu, oraz odpowiedniej mieszaniny trzech terminatorów dideoksynukleotydowych (ddNTPs) (kwadraty) i jednego deoksynukleotydu (koło), aby przedłużyć starter odpowiednio o jedną lub dwie zasady. Powstałe produkty przedłużania starterów mają różne masy, co umożliwia ich rozdzielenie i ilościowe oznaczenie za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Ilość produktu odpowiadająca niebieskiemu allelowi markera DNA jest relatywnie niższa w porównaniu do allela czerwonego.
Rycina 3. Wyniki analizy ekspresji specyficznej dla allelu. Na rycinie przedstawiono wyniki spektrometrii mas z analizy przeprowadzonej na DNA genomicznym oraz cDNA linii komórkowej A i linii komórkowej B (Rycina 1).
Dyskusja
Metoda ta umożliwia ocenę wpływu wariantów DNA związanych z chorobą na ekspresję genów poprzez analizę różnic allelicznych w poziomie transkryptu in vivo. W niniejszym protokole względną obfitość transkryptu mierzy się za pomocą MALDI-TOF, jednak można zastosować inne technologie umożliwiające kwantyfikację allelocyficzną, takie jak TaqMan6,7. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest dostępność transkrybowanych markerów kodujących. Opisano metody oparte na przedstawionej tutaj zasadzie, lecz wykorzystujące inne klasy polimorfizmów. Test haploChip mierzy ekspresję allelocyficzną przy użyciu markerów zlokalizowanych w odległości 1 kb od miejsca startu lub końca transkrypcji genu, które byłyby obecne w materiale po immunoprecypitacji chromatyny wyizolowanym za pomocą przeciwciał specyficznych dla polimerazy RNA II8. Alternatywnie, gdy matrycą jest heteronuklearne RNA, można wykorzystać SNP intronowe9.
Opisany tutaj konkretny protokół, w połączeniu z analizą haploChip, został z sukcesem wykorzystany do zidentyfikowania genu kandydującego w przypadku dysleksji (lub zaburzeń czytania). Początkowo badanie asocjacji genetycznej zidentyfikowało sekwencję DNA powiązaną z dysleksją, która obejmowała trzy geny10. Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów wykazała, że w obecności wariantów DNA powiązanych z dysleksją zmienność ekspresji zaobserwowano tylko dla jednego z trzech genów, a nie dla pozostałych dwóch11.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez Wellcome Trust w ramach grantów przyznanych A.P.M [076566/Z/05/Z], J.C.K. [074318] oraz podstawowej dotacji dla Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS | Sigma-Aldrich | P-4417-100TAB | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| NaCl | VWR international | 27788.366 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| RNaza A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinaza K | Sigma-Aldrich | P2308-500MG | |
| Fenol: chloroform | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Chloroform | VWR international | 100777C | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Zestaw RNeasy | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | |
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich | DNTP100A | |
| Egzonukleaza 1 | New England Biolabs | M0293S | |
| Krewetkowa fosfataza alkaliczna | GE Healthcare | E70092Z | |
| Żywica SpectroCLEAN | Sequenom | 10053 | |
| Mieszanina MassEXTEND ddNTP/dNTP | Sequenom | Zmienna w zależności od projektu analizy | |
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | |
| Sprzęt | |||
| Chłodzona mikrocentryfuga | Eppendorf | ||
| Spektrofotometr NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nanolitrowy dozownik SpectroPOINT | Sequenom | ||
| Spektrometr masowy SpectroREADER | Sequenom |
Bibliografia
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
Przedruki i uprawnienia
