Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Podsumowanie

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Streszczenie

Pszczoły miodne (Apis mellifera) są znane ze swoich umiejętności komunikacyjnych i orientacyjnych oraz z imponującej zdolności uczenia się^1,2. Ponieważ przetrwanie kolonii pszczół zależy od eksploatacji źródeł pożywienia, pszczoły zbieraczki uczą się i zapamiętują zmienne lokalizacje kwiatów, a także ich opłacalność. Pszczoły zbieraczki można łatwo trenować w warunkach naturalnych, gdzie żerują w miejscu karmienia i uczą się powiązanych z nim sygnałów, takich jak zapach lub kolor. Apetytywne uczenie się asocjacyjne można badać również w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych poprzez warunkowanie odruchu wysuwania trąbki (PER) u indywidualnie unieruchomionych pszczół miodnych^3,4. Ten paradygmat uczenia się umożliwia badanie mechanizmów neuronalnych i molekularnych leżących u podstaw uczenia się i formowania pamięci w sposób prosty i wysoce niezawodny^5-12. Do badania mechanizmów molekularnych stosuje się podejście farmakologii behawioralnej. Leki są wstrzykiwane systemowo, aby zakłócić funkcję konkretnych cząsteczek w trakcie lub po procesie uczenia się i formowania pamięci^13-16.

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak trenować przywiązane pszczoły miodne w warunkowaniu PER oraz jak podawać leki systemowo poprzez wstrzykiwanie ich do mięśnia latającego pszczoły.

Protokół

1. Odławianie pszczół z ula

1. Na jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu, między godziną 14:00 a 16:00, odławia się pszczoły opuszczające ul. W tym celu przed wylotkiem ula, w odległości 20-30 cm, trzyma się piramidę z pleksiglasu przepuszczającego światło UV (wysokość = 30 cm, wierzchołek 3,5 x 3,5 cm, podstawa 18 x 18 cm), która jest zamykana na górze i na dole, z otwartą podstawą i zamkniętym wierzchołkiem, tak aby pszczoły opuszczające ul wpadały do podstawy piramidy. Następnie zamyka się podstawę, a odłowione pszczoły przenosi do laboratorium w celu dalszych czynności.

2. Przenoszenie pszczół z piramidy do szklanych fiolek

1. W laboratorium piramidę ustawia się na podstawie. Ściany piramidy zostają zaciemnione (np. za pomocą ręcznika), natomiast wierzchołek pozostaje odsłonięty. Ze względu na pozytywny fototaksyz pszczoły opuszczą piramidę przez wierzchołek po jego otwarciu. Pszczoły są przenoszone jedna po drugiej z piramidy do szklanych fiolek poprzez trzymanie fiolek nad otwartym wierzchołkiem. Do każdej pszczoły używa się jednej fiolki. Wierzchołek jest zamykany w momencie, gdy jedna pszczoła dostanie się do fiolki.

3. Unieruchamianie pszczół w probówkach

1. Pszczoły unieruchamia się poprzez chłodzenie ich w szklanych fiolkach na lodzie przez 2,5–3,5 min. Zaleca się obserwowanie pszczoły i wyjęcie jej z lodu natychmiast po zaprzestaniu ruchu.
2. Pojedynczą unieruchomioną pszczołę mocuje się w małej plastikowej rurce za pomocą taśmy klejącej w taki sposób, aby mogła ona swobodnie poruszać trąbką, ale nie głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest, aby nie uciskać szyi.
3. Każdą pszczołę utrwaloną w plastikowej rurce umieszcza się w ponumerowanym otworze na stojaku, co ułatwia obsługę i identyfikację. Po wyjęciu rurki w celu kondycjonowania lub odzyskiwania pamięci, należy ją zawsze zwrócić do tego samego otworu.

4. Karmienie pszczół

1. Pierwszego wieczoru (godz. 16:00–18:00), po odłowieniu, pszczoły są karmione do sytości roztworem sacharozy (0,88 M, biały rafinowany cukier spożywczy rozpuszczony w wodzie z kranu). Aby nakarmić pszczołę, wywołuje się jej PER poprzez dotknięcie czułków roztworem sacharozy, a zwierzęciu pozwala się spożyć jedną kroplę (4 μL) roztworu sacharozy. Pszczoły są karmione jedna po drugiej wielokrotnie, aż przestaną wykazywać szybką i niezawodną reakcję PER po dotknięciu czułków roztworem sacharozy.
2. Każdego kolejnego wieczoru (godz. 16:00–18:00) trwania eksperymentu pszczoły są karmione jedna po drugiej czterokrotnie jedną kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie został rozmazany na czułkach lub trąbce pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone roztworem sacharozy. Pszczół nie należy karmić w miejscu warunkowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego ze bodźcem w postaci sacharozy.

5. Przechowywanie uprzężonych pszczół przez noc

1. Pszczoły przechowuje się przez noc w plastikowej misce w temperaturze pokojowej. Miska jest napełniona wodą z kranu (na wysokość około 0,5-1 cm). Statywy z przymocowanymi pszczołami umieszcza się w misce ponad poziomem wody, wykorzystując płytki ELISA jako platformę. Na koniec miskę przykrywa się tekturą.

6. Warunkowanie węchowe

Pierwszego dnia eksperymentu rano (o godzinie 10:00) przeprowadza się warunkowanie węchowe. Bodźcem warunkowym (CS) jest zapach, a bodźcem bezwarunkowym (US) roztwór sacharozy.

1. 4 μL zapachu (np. olejku goździkowego) pipetuje się na okrągły papier filtracyjny (średnica 1,3 cm), który następnie wkłada się do strzykawki 20 mL. Zapach pipetuje się pod dygestorium, używając końcówek z filtrem, aby zapobiec zanieczyszczeniu pipety.
2. Kasetę z unieruchomionymi pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania 30 min przed rozpoczęciem procedury, lecz w odległości od miejsca przed rurą wydechową, gdzie warunkowane są poszczególne pszczoły.
3. Warunkowanie polega na trzech parach zapachu (bodziec warunkowy, CS) i roztworu sacharozy (bodziec bezwarunkowy, US, 1,25 M) z odstępem między próbami (ITI) wynoszącym 10 min. Sygnał akustyczny przekazywany eksperymentatorowi za pomocą odtwarzacza audio zapewnia precyzyjny czas rozpoczęcia bodźca, zakończenia bodźca, czasu trwania bodźca oraz umieszczania zwierzęcia. Próba nabywania rozpoczyna się od 10 s umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Krótko przed końcem tych 10 s strzykawkę zawierającą zapach umieszcza się 3 cm przed pszczołą, kierując ją w stronę czułków. Następnie zapach prezentuje się przez 5 s, przepychając przez strzykawkę 20 mL powietrza. Po pierwszych 3 s dystalne człony biczikawa obu czułków są dotykane wykałaczką zwilżoną roztworem sacharozy, a zwierzętom pozwala się lizać zwilżoną wykałaczkę przez 4 s. 13 s po zakończeniu stymulacji CS pszczoły są wyjmowane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w kasecie. Łącznie jedna próba treningowa trwa 28 s.
   Ważne jest, aby po warunkowaniu ani czułki, ani aparat gębowy pszczoły nie były pokryte sacharozą. Należy zatem upewnić się, że wykałaczka jest jedynie zwilżona roztworem sacharozy i że na wykałaczce nie tworzą się krople roztworu sacharozy.
4. Po warunkowaniu kasety umieszcza się z powrotem w pojemniku.
5. Zachowanie zwierząt podczas eksperymentu, tj. wystąpienie PER podczas umieszczania oraz prezentacji CS i US, jest monitorowane i odnotowywane przez eksperymentatora.

7. Utrwalenie pamięci

1. Testy retencji można przeprowadzać w dowolnych odstępach czasu (od minut do dni). Kasetę z pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania na 30 min przed rozpoczęciem testu pamięci.
2. Test pamięci polega na 5-sekundowej prezentacji CS bez prezentacji US. Test rozpoczyna się od 10-sekundowego umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Następnie, zgodnie z powyższym opisem, zapach jest prezentowany przez 5 s. Podczas eksperymentu odnotowuje się zachowanie zwierzęcia, tzn. wystąpienie PER podczas umieszczania oraz prezentacji CS.
3. Na koniec eksperymentu ponownie wywołuje się odruch wysunięcia trąbki (proboscis extension response) poprzez dotknięcie czułków roztworem sacharozy, aby upewnić się, że zwierzę nadal jest zdolne do wysunięcia trąbki.

8. Iniekcja systemiczna

Moment wykonania iniekcji systemowej zależy od projektu eksperymentalnego.

1. Za pomocą jednorazowej igły podskórnej (21 G) wykonuje się mały otwór w kutykuli tylnej części scutum, obok szczeliny scutalnej, powyżej mięśnia lotnego¹⁷.
2. Przy użyciu szklanej kapilary wstrzykuje się 1 μL roztworu przez otwór w kutykuli do mięśnia lotnego. Doświadczeni eksperymentatorzy są w stanie wstrzyknąć preparat jednej pszczoły co 30 sec, co pozwala na precyzyjne określenie czasu iniekcji i warunkowania.

9. Karmienie pszczół podczas eksperymentu

1. Wieczorem (między 16:00 a 18:00) po kondycjonowaniu pszczoły są karmione czterokrotnie, jedna po drugiej, 1 kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie dostał się na czułki lub aparat gębowy pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone roztworem sacharozy. Pszczół nie należy karmić w miejscu kondycjonowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego ze bodźcem w postaci sacharozy.

10. Gromadzenie i analiza danych

1. Monitorowane jest wystąpienie reakcji wysunięcia trąbki podczas eksperymentu. Pszczoła jest oceniana jako dodatnia, jeśli wysunie trąbkę między rozpoczęciem CS a prezentacją US (podczas treningu) lub podczas prezentacji CS (podczas fazy testowej), przekraczając wirtualną linię między otwartymi żuwaczkami.
2. Aby zwierzęta zostały uwzględnione w analizie, muszą spełnić dwa kryteria: muszą przeżyć cały eksperyment oraz wykazać bezwarunkową reakcję wysunięcia trąbki (PER) na roztwór sacharozy na koniec eksperymentu. Procent pszczół wykazujących PER podczas testów nabywania i retencji jest naniesiony na wykres dla każdej prezentacji CS.

11. Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym opracowaniu przedstawiono dwa eksperymenty.

W pierwszym eksperymencie zbadaliśmy wpływ systemowej iniekcji soli fosforanowo-buforowanej (PBS; w mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na₂HPO₄, 1,8 KH₂PO₄, pH 7,2) na uczenie się i formowanie pamięci długotrwałej. Trzy grupy pszczół zostały poddane treningowi składającemu się z trzech parowań CS-US z 10 min odstępem między próbami: grupę niepoddaną działaniu preparatów, grupę, której 30 min przed treningiem wstrzyknięto 1 μL PBS, oraz grupę z iniekcją pozorowaną (sham), traktowaną analogicznie jak grupa z PBS, lecz bez podania roztworu. 24 h po treningu przetestowano pamięć we wszystkich trzech grupach za pomocą jednej prezentacji CS. Procent zwierząt wykazujących reakcję warunkową podczas warunkowania wzrastał istotnie w trakcie trzech prób treningowych (Ryc.1, ANOVA z powtarzanymi pomiarami dla czynnika czasu F_2,378=340,456, p < 0,05). Podczas warunkowania nie zaobserwowano różnic w PER pomiędzy trzema grupami (ANOVA z powtarzanymi pomiarami dla czynnika grup F2, 189 = 1,299, p > 0,05). Wynik ten utrzymał się w teście retencji po 24 h (F2, 187 = 0,752, p>0,05) przy porównaniu zwierząt niepoddanych działaniu preparatów ze zwierzętami po iniekcji PBS oraz iniekcji pozorowanej.

W drugim eksperymencie wykazaliśmy hamowanie utrwalania pamięci trzy i cztery dni po treningu, gdy inhibitor syntezy białek anisomycyna (10 mM) została wstrzyknięta systemowo 30 min po trzech sparowaniach CS-US. Porównanie grupy po iniekcji anisomycyny z grupą po iniekcji PBS ujawniło istotną różnicę między grupami podczas testu retencji (Ryc. 2, ANOVA dla pomiarów powtarzanych dla czynnika grupa F1, 94=8,86, p < 0,05). Znaczącą różnicę można zaobserwować podczas testu pamięci w dniu 3. i 4. Wyniki te są zbliżone do rezultatów Wüstenberga et al.¹⁸, którzy również warunkowali pszczoły przy użyciu trzech sparowań CS-US, choć z zastosowaniem innego protokołu.

Rycina 1. Uszkodzenie kutykuli lub wstrzyknięcie PBS nie zmienia procesu nabywania i utrzymywania pamięci. Zwierzęta trenowano za pomocą trzech par CS-US (nabywanie). Po 24 h przetestowano pamięć (utrzymywanie pamięci). Na trzydzieści minut przed treningiem w kutykuli dwóch grup wykonano otwór (lesion, PBS), a jednej z tych grup wstrzyknięto 1 μL PBS (PBS). Trzecią grupę pozostawiono nienaruszoną (brak traktowania). Przedstawiono procent zwierząt w każdej grupie reagujących na prezentację zapachu za pomocą PER. Analiza ANOVA nie wykazała istotnych różnic między grupami w fazie nabywania (F2, 189 = 1,299, p > 0,05) ani w utrzymywaniu pamięci (F2, 187 = 0,752, p > 0,05).

Rycina 2. Iniekcja anisomycyny 40 min po ostatnim sparowaniu CS-US zmniejsza retencję pamięci trzy i cztery dni po treningu. Zwierzęta zostały poddane treningowi z trzema sparowaniami CS-US (nabywanie), a następnie otrzymały iniekcję 1 μL 10 mM anisomycyny (Aniso) lub 1 μL PBS 1 h po pierwszej próbie treningowej. Pamięć była testowana (Retencja Pamięci) odpowiednio 24 h, 48 h, 72 h i 96 h później. Przedstawiono procent zwierząt w grupie reagujących na prezentację zapachu odruchem PER. Iniekcja anisomycyny prowadzi do istotnego zmniejszenia retencji pamięci 72 h i 96 h po treningu (F1, 94=8.86, p < 0.05), co wykazano za pomocą analizy ANOVA.

Dyskusja

1. Odławianie pszczół: Aby zebrać doświadczone pszczoły zbieraczki, odławia się je rano lub po południu, unikając pory, w której młode pszczoły odbywają loty orientacyjne¹⁹. Zbieraczki gromadzą albo pyłek, albo nektar. Zaobserwowano różnice między zbieraczkami pyłku a nektaru w zakresie ich reaktywności na cukier oraz zdolności uczenia się²⁰. Aby odłowić wyłącznie zbieraczki nektaru, w pobliżu ula można ustawić sztuczne źródło pokarmu wypełnione roztworem sacharozy i tam zbierać owady. Zbieraczki pyłku powracające do ula można zidentyfikować po koszyczkach pyłkowych na odnóżach tylnych²⁰.
2. Unieruchamianie i obchodzenie się z pszczołami: Należy unikać przedłużonego chłodzenia pszczół na lodzie, ponieważ może to wpłynąć na ich zdolność uczenia się i przeżywalność do końca eksperymentu. Tarsy należy ostrożnie unieruchomić w probówce, aby uniknąć przypadkowej stymulacji roztworem sacharozy. Jest to istotne, ponieważ wykazano, że pszczoły uczą się poprzez stymulację tarsów roztworem sacharozy^3,21.
3. Warunkowanie węchowe: Liczbę prób warunkowania, odstęp między próbami oraz punkt czasowy testu można zmieniać w zależności od celu badania^3,22.
4. Karmienie: Znane jest, że poziom nasycenia pszczół wpływa na ich efektywność uczenia się i retencję pamięci^3,23. Należy to uwzględnić podczas planowania eksperymentów.
5. Iniekcja: W klatce piersiowej pszczoły miodnej znajdują się worki powietrzne¹⁷. Te kluczowe elementy układu oddechowego są niezbędne do przeżycia. Dlatego podczas iniekcji należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić worków powietrznych. Wydostanie się pęcherzyków powietrza świadczy o uszkodzeniu worków powietrznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka Omnifix 20 ml	B. Braun Medical	4616200 V
Biały rafinowany cukier spożywczy	Kaisers Supermarket, Berlin, Niemcy
Olejek goździkowy	Bombastus, Freital, Niemcy
Multipette plus	Eppendorf	4981 000.019
Statyw na 30 probówek dla pszczół	Własny wyrób
Probówki plastikowe	Własny wyrób
Piramida z pleksiglasu przepuszczającego światło UV	Własny wyrób		wysokość = 30cm, wierzchołek 3,5 x 3,5cm, podstawa 18x18cm
Taśma klejąca	Tesa, Hamburg, Niemcy
Kapilary 1-5μl	Selzer
Koniec kapilarne 1-5μl	Selzer
Papier filtracyjny o grubości 0,16-0,2 mm	Macherey-Nagel	MN 616 lub MN615	Przycięty do okrągłych fragmentów o średnicy 1,3 cm
Jednorazowa igła podskórna	B. Braun Medical	4657683	średnica 0,45 mm