Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Podsumowanie

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Streszczenie

Pszczoły miodne (Apis mellifera) są znane ze swoich umiejętności komunikacyjnych i orientacyjnych oraz z imponującej zdolności uczenia się^1,2. Ponieważ przetrwanie kolonii pszczół zależy od eksploatacji źródeł pożywienia, pszczoły zbieraczki uczą się i zapamiętują zmienne lokalizacje kwiatów, a także ich opłacalność. Pszczoły zbieraczki można łatwo trenować w warunkach naturalnych, gdzie żerują w miejscu karmienia i uczą się powiązanych z nim sygnałów, takich jak zapach lub kolor. Apetytywne uczenie się asocjacyjne można badać również w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych poprzez warunkowanie odruchu wysuwania trąbki (PER) u indywidualnie unieruchomionych pszczół miodnych^3,4. Ten paradygmat uczenia się umożliwia badanie mechanizmów neuronalnych i molekularnych leżących u podstaw uczenia się i formowania pamięci w sposób prosty i wysoce niezawodny^5-12. Do badania mechanizmów molekularnych stosuje się podejście farmakologii behawioralnej. Leki są wstrzykiwane systemowo, aby zakłócić funkcję konkretnych cząsteczek w trakcie lub po procesie uczenia się i formowania pamięci^13-16.

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak trenować przywiązane pszczoły miodne w warunkowaniu PER oraz jak podawać leki systemowo poprzez wstrzykiwanie ich do mięśnia latającego pszczoły.

Protokół

1. Odławianie pszczół z ula

1. Na jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu, między godziną 14:00 a 16:00, odławia się pszczoły opuszczające ul. W tym celu przed wylotkiem ula, w odległości 20-30 cm, trzyma się przepuszczającą światło UV piramidę z pleksiglasu (wysokość = 30 cm, wierzchołek 3,5 x 3,5 cm, podstawa 18 x 18 cm), która jest zamykana na górze i na dole, z otwartą podstawą i zamkniętym wierzchołkiem, tak aby wylatujące z ula pszczoły wpadały do podstawy piramidy. Następnie zamyka się podstawę, a odłowione pszczoły przenosi do laboratorium w celu dalszej obróbki.

2. Przenoszenie pszczół z piramidy do szklanych fiolek

1. W laboratorium piramidę ustawia się na podstawie. Ściany piramidy zostają zaciemnione (np. za pomocą ręcznika), natomiast wierzchołek pozostaje odkryty. Ze względu na swój dodatni fototaksis, pszczoły opuszczą piramidę przez wierzchołek po jego otwarciu. Pszczoły przenosi się pojedynczo z piramidy do szklanych fiolek, trzymając fiolki nad otwartym wierzchołkiem. Jedna fiolka przypada na jedną pszczołę. Wierzchołek jest zatem zamykany w momencie, gdy jedna pszczoła wleci do fiolki.

3. Unieruchamianie pszczół w probówkach

1. Pszczoły unieruchamia się poprzez chłodzenie ich w szklanych probówkach na lodzie przez 2,5-3,5 min. Zaleca się obserwowanie pszczoły i wyjęcie jej z lodu natychmiast po ustaniu ruchów.
2. Pojedynczą unieruchomioną pszczołę mocuje się w małej plastikowej rurce za pomocą taśmy klejącej w taki sposób, aby owad mógł swobodnie poruszać proboscidosem, ale nie głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest, aby nie uciskać okolicy szyi.
3. Każda pszczoła utrwalona w plastikowej rurce jest umieszczana w ponumerowanym otworze na statywie w celu łatwiejszej obsługi i identyfikacji. Po wyjęciu pszczoły w celu kondycjonowania lub odzyskiwania pamięci, rurka jest zawsze zwracana do dokładnie tego samego otworu.

4. Karmienie pszczół

1. Pierwszego wieczoru (godz. 16:00–18:00), po odłowieniu, pszczoły są karmione do sytości roztworem sacharozy (0,88 M, biały rafinowany cukier domowy rozpuszczony w wodzie z kranu). Aby nakarmić pszczołę, wywołuje się jej PER poprzez dotknięcie anten roztworem sacharozy, a następnie pozwala się zwierzęciu spożyć jedną kroplę (4 μL) roztworu sacharozy. Pszczoły są karmione jedna po drugiej wielokrotnie, aż do momentu, gdy przestaną wykazywać szybką i niezawodną reakcję PER po dotknięciu anten roztworem sacharozy.
2. Podczas każdego kolejnego wieczoru (godz. 16:00–18:00) trwania eksperymentu pszczoły są karmione jedna po drugiej czterokrotnie jedną kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie został rozprowadzony na antenach lub na aparat gębowym (proboscis) pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone roztworem sacharozy. Pszczoły nie powinny być karmione w miejscu warunkowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego z bodźcem w postaci sacharozy.

5. Przechowywanie uwiązanych pszczół przez noc

1. Pszczoły przechowuje się przez noc w plastikowej misce w temperaturze pokojowej. Miska jest napełniona wodą z kranu (na wysokość około 0,5-1 cm). Statywy z unieruchomionymi pszczołami umieszcza się w misce powyżej poziomu wody, wykorzystując płytki ELISA jako platformę. Na koniec miskę przykrywa się tekturą.

6. Warunkowanie węchowe

Pierwszego dnia eksperymentu o godzinie 10:00 przeprowadza się warunkowanie węchowe. Bodźcem warunkowanym (CS) jest zapach, a bodźcem bezwarunkowym (US) roztwór sacharozy.

1. 4 μL zapachu (np. olejku goździkowego) pipetuje się na okrągły papier filtracyjny (średnica 1,3 cm), który następnie wkłada się do strzykawki 20 mL. Zapach jest pipetowany pod wyciągiem, a w celu zapobiegania zanieczyszczeniu pipety stosuje się końcówki z filtrem.
2. Kasetkę z unieruchomionymi pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania na 30 min przed rozpoczęciem procedury, jednak w odległości od miejsca przed rurą wylotową, gdzie warunkowane są pojedyncze pszczoły.
3. Warunkowanie polega na trzech sparowaniach zapachu (bodziec warunkowy, CS) i roztworu sacharozy (bodziec bezwarunkowy, US, 1,25 M) z odstępem między próbami (ITI) wynoszącym 10 min. Sygnał akustyczny przekazywany eksperymentatorowi za pomocą odtwarzacza audio zapewnia precyzyjne czasowanie początku bodźca, końca bodźca, czasu trwania bodźca oraz momentu umieszczenia zwierzęcia. Próba nabywania rozpoczyna się od 10-sekundowego umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Krótko przed końcem tych 10 s strzykawka zawierająca zapach jest umieszczana 3 cm przed pszczołą, celując w jej czułki. Następnie zapach jest prezentowany przez 5 s poprzez przepchnięcie 20 mL powietrza przez strzykawkę. Po pierwszych 3 s dystalne człony biczików obu czułków są dotykane wykałaczką zwilżoną roztworem sacharozy, a zwierzęta mogą lizać zwilżoną wykałaczkę przez 4 s. 13 s po zakończeniu stymulacji CS pszczoły są wyjmowane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w kasetce. Łącznie jedna próba treningowa trwa 28 s.
   Ważne jest, aby po warunkowaniu ani czułki, ani aparat gębowy pszczoły nie były pokryte sacharozą. Należy zatem upewnić się, że wykałaczka jest jedynie zwilżona roztworem sacharozy i że na wykałaczce nie tworzą się krople roztworu.
4. Po warunkowaniu kasetki są umieszczane z powrotem w naczyniu.
5. Zachowanie zwierząt podczas eksperymentu, tj. występowanie PER podczas umieszczania oraz prezentacji CS i US, jest monitorowane i zapisywane przez eksperymentatora.

7. Utrwalanie pamięci

1. Testy retencji można przeprowadzać w dowolnych odstępach czasu (od minut do dni). Stelaż z pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania na 30 min przed rozpoczęciem testu pamięci.
2. Test pamięci polega na 5-sekundowej prezentacji CS bez prezentacji US. Test rozpoczyna się od 10-sekundowego umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Następnie, zgodnie z powyższym opisem, przez 5 s prezentowany jest zapach. Podczas eksperymentu odnotowuje się zachowanie zwierzęcia, tzn. wystąpienie PER podczas umieszczania oraz w trakcie prezentacji CS.
3. Na koniec eksperymentu ponownie wywołuje się reakcję wysuwania proboscis poprzez dotknięcie czułków roztworem sacharozy, aby upewnić się, że zwierzę nadal jest zdolne do wysuwania proboscis.

8. Iniekcja systemowa

Moment wykonania wstrzyknięcia ogólnoustrojowego zależy od projektu eksperymentalnego.

1. W kutykuli tylnej części scutum, obok szczeliny scutalnej nad mięśniem lotnym¹⁷, wykonuje się niewielki otwór za pomocą jednorazowej igły hipodermicznej (21 G).
2. Przy użyciu szklanej kapilary wstrzykuje się 1 μL roztworu przez otwór w kutykuli do mięśnia lotnego. Doświadczeni eksperymentatorzy są w stanie wstrzyknąć preparat jednej pszczole co 30 sec, co pozwala na precyzyjne zsynchronizowanie czasu wstrzyknięcia i warunkowania.

9. Karmienie pszczół podczas eksperymentu

1. Wieczorem (między 16:00 a 18:00) po warunkowaniu pszczoły są karmione jedna po drugiej czterokrotnie jedną kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie rozmazał się na czułkach lub proboscis pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone tym roztworem. Karmienie pszczół nie powinno odbywać się w miejscu warunkowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego z bodźcem w postaci sacharozy.

10. Gromadzenie i analiza danych

1. Monitoruje się występowanie odruchu wysuwania aparatu gębowego (proboscis extension response) w trakcie eksperymentu. Pszczołę uznaje się za pozytywną, jeśli wysunie aparat gębowy pomiędzy początkiem bodźca warunkowanego (CS) a prezentacją bodźca bezwarunkowego (US) (podczas treningu) lub podczas prezentacji CS (w fazie testowej), przekraczając wirtualną linię między otwartymi żuwaczkami.
2. Aby zwierzęta zostały włączone do analizy, muszą spełnić dwa kryteria: muszą przeżyć cały eksperyment oraz wykazać bezwarunkowy odruch wysuwania aparatu gębowego (PER) w odpowiedzi na roztwór sacharozy na koniec eksperymentu. Dla każdej prezentacji CS wykreśla się procent pszczół wykazujących PER podczas testów nabytego odruchu oraz testów retencji.

11. Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym materiale przedstawiono dwa eksperymenty.

W pierwszym eksperymencie badamy wpływ systemowej iniekcji soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; w mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na₂HPO₄, 1,8 KH₂PO₄, pH 7,2) na uczenie się i formowanie pamięci długotrwałej. Trzy grupy pszczół zostały przeszkolone przy użyciu trzech par CS-US z 10 min interwałem między próbami: grupa nietraktowana, grupa, której 30 min przed treningiem wstrzyknięto 1 μL PBS, oraz grupa z iniekcją pozorowaną (sham), traktowana w ten sam sposób co grupa z PBS, ale bez podania PBS. Po 24 h od treningu przetestowano pamięć we wszystkich trzech grupach poprzez jedną prezentację CS. Procent zwierząt wykazujących reakcję warunkową podczas warunkowania wzrastał znacząco w trzech próbach treningowych (Ryc. 1, ANOVA dla pomiarów powtarzanych dla czynnika czasu F_2,378=340,456, p < 0,05). Podczas warunkowania nie zaobserwowano różnic w PER pomiędzy trzema grupami (ANOVA dla pomiarów powtarzanych dla czynnika grup F2, 189 = 1,299, p > 0,05). Pozostaje to aktualne dla testu retencji po 24 h (F2, 187 = 0,752, p>0,05) przy porównaniu zwierząt nietraktowanych ze zwierzętami po iniekcji PBS i iniekcji pozorowanej.

W drugim eksperymencie wykazano zahamowanie utrwalania pamięci trzy i cztery dni po treningu, gdy inhibitor syntezy białek, anisomycyna (10 mM), została wstrzyknięta systemowo 30 min po trzech sparowaniach CS-US. Porównanie grupy po wstrzyknięciu anisomycyny z grupą po wstrzyknięciu PBS ujawniło istotną różnicę między grupami podczas testu utrwalania (Ryc. 2, ANOVA dla pomiarów powtarzanych dla czynnika grupa F1, 94=8,86, p < 0,05). Znaczną różnicę zaobserwowano podczas testu pamięci w dniu 3. i 4. Wyniki te są zbliżone do rezultatów uzyskanych przez Wüstenberga et al.¹⁸, którzy również warunkowali pszczoły przy użyciu trzech sparowań CS-US, choć zastosowano inny protokół.

Rysunek 1. Uszkodzenie kutykuli lub wstrzyknięcie PBS nie zmienia nabywania i retencji pamięci. Zwierzęta były trenowane przy użyciu trzech par CS-US (nabywanie). Po 24 h przetestowano pamięć (retencja pamięci). Na trzydzieści minut przed treningiem w kutykuli dwóch grup wykonano otwór (lesion, PBS), a jednej z tych grup wstrzyknięto 1 μL PBS (PBS). Trzecią grupę pozostawiono w stanie nienaruszonym (brak zabiegu). Przedstawiono procent zwierząt w każdej grupie reagujących na prezentację zapachu za pomocą PER. Analiza ANOVA nie wykazuje istotnych różnic między grupami w fazie nabywania (F2, 189 = 1.299, p > 0.05) ani w retencji pamięci (F2, 187 = 0.752, p>0.05).

Rycina 2. Wstrzyknięcie anisomycyny 40 min po ostatnim parowaniu CS-US zmniejsza retencję pamięci trzy i cztery dni po treningu. Zwierzęta zostały poddane treningowi z trzema parowaniami CS-US (nabywanie), a następnie wstrzyknięto im 1 μL 10 mM anisomycyny (Aniso) lub 1 μL PBS 1 h po pierwszej próbie treningowej. Pamięć została przetestowana (retencja pamięci) po 24 h, 48 h, 72 h i 96 h. Przedstawiono procent zwierząt w grupie reagujących na prezentację zapachu poprzez PER. Wstrzyknięcie anisomycyny prowadzi do istotnego zmniejszenia retencji pamięci 72 h i 96 h po treningu (F1, 94=8.86, p < 0.05), co wykazano za pomocą analizy ANOVA.

Dyskusja

1. Odławianie pszczół: Aby zebrać doświadczone pszczoły zbieraczki, odławia się je rano lub po południu, unikając pory, w której młode pszczoły odbywają loty orientacyjne¹⁹. Zbieraczki gromadzą albo pyłek, albo nektar. Zaobserwowano różnice między zbieraczkami pyłku a nektaru w zakresie ich reaktywności na cukier oraz zdolności uczenia się²⁰. Aby odłowić wyłącznie zbieraczki nektaru, w pobliżu ula można ustawić sztuczne źródło pokarmu wypełnione roztworem sacharozy i tam zbierać owady. Zbieraczki pyłku powracające do ula można zidentyfikować po koszyczkach pyłkowych na odnóżach tylnych²⁰.
2. Unieruchamianie i obchodzenie się z pszczołami: Należy unikać przedłużonego chłodzenia pszczół na lodzie, ponieważ może to wpłynąć na ich zdolność uczenia się i przeżywalność do końca eksperymentu. Tarsy należy ostrożnie unieruchomić w probówce, aby uniknąć przypadkowej stymulacji roztworem sacharozy. Jest to istotne, ponieważ wykazano, że pszczoły uczą się poprzez stymulację tarsów roztworem sacharozy^3,21.
3. Warunkowanie węchowe: Liczbę prób warunkowania, odstęp między próbami oraz punkt czasowy testu można zmieniać w zależności od celu badania^3,22.
4. Karmienie: Znane jest, że poziom nasycenia pszczół wpływa na ich efektywność uczenia się i retencję pamięci^3,23. Należy to uwzględnić podczas planowania eksperymentów.
5. Iniekcja: W klatce piersiowej pszczoły miodnej znajdują się worki powietrzne¹⁷. Te kluczowe elementy układu oddechowego są niezbędne do przeżycia. Dlatego podczas iniekcji należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić worków powietrznych. Wydostanie się pęcherzyków powietrza świadczy o uszkodzeniu worków powietrznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka Omnifix 20 ml	B. Braun Medical	4616200 V
Biały rafinowany cukier spożywczy	Kaisers Supermarket, Berlin, Niemcy
Olejek goździkowy	Bombastus, Freital, Niemcy
Multipette plus	Eppendorf	4981 000.019
Statyw na 30 probówek dla pszczół	Własny wyrób
Probówki plastikowe	Własny wyrób
Piramida z pleksiglasu przepuszczającego światło UV	Własny wyrób		wysokość = 30cm, wierzchołek 3,5 x 3,5cm, podstawa 18x18cm
Taśma klejąca	Tesa, Hamburg, Niemcy
Kapilary 1-5μl	Selzer
Koniec kapilarne 1-5μl	Selzer
Papier filtracyjny o grubości 0,16-0,2 mm	Macherey-Nagel	MN 616 lub MN615	Przycięty do okrągłych fragmentów o średnicy 1,3 cm
Jednorazowa igła podskórna	B. Braun Medical	4657683	średnica 0,45 mm