Artykuł metodologiczny

Krystalizacja białek w krystalografii rentgenowskiej

DOI:

10.3791/2285

⸱

16 stycznia 2011

 , 
1Molecular Biochemistry and Biophysics, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura 3D cząsteczki dostarcza unikalnego zrozumienia jej funkcjonowania. Główną metodą określania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowi jest krystalografia rentgenowska. W tym miejscu demonstrujemy aktualne metody otrzymywania trójwymiarowych kryształów dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do określania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych do wnioskowania o ich funkcjonowaniu jest jedną z najważniejszych dziedzin współczesnej biologii. Dostępność atomowych struktur rozdzielczych zapewnia głębokie i unikalne zrozumienie funkcji białek i pomaga rozwikłać wewnętrzne funkcjonowanie żywej komórki. Do tej pory 86% wpisów w Banku Danych o Białkach (rcsb-PDB) to struktury makromolekularne, które zostały określone za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Aby uzyskać kryształy odpowiednie do badań krystalograficznych, makrocząsteczka (np. białko, kwas nukleinowy, kompleks białko-białko lub kompleks białko-kwas nukleinowy) musi zostać oczyszczona do jednorodności lub jak najbardziej zbliżonej do jednorodności. Jednorodność preparatu jest kluczowym czynnikiem w otrzymywaniu kryształów, które ulegają dyfrakcji z wysoką rozdzielczością (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).

Krystalizacja wymaga doprowadzenia makrocząsteczki do przesycenia. Próbka powinna być zatem zagęszczona do najwyższego możliwego stężenia, nie powodując agregacji lub wytrącania makrocząsteczki (zwykle 2-50 mg/ml). Wprowadzenie próbki do środka strącającego może sprzyjać zarodkowaniu kryształów białka w roztworze, co może skutkować wyrastaniem dużych trójwymiarowych kryształów z roztworu. Istnieją dwie główne techniki otrzymywania kryształów: dyfuzja parowa i krystalizacja okresowa. W dyfuzji pary kropla zawierająca mieszaninę roztworów strącających i białkowych jest zamykana w komorze z czystym środkiem strącającym. Para wodna następnie dyfunduje z kropli, aż osmolarność kropli i środka strącającego będą równe (rysunek 1A). Odwodnienie kropli powoduje powolne stężenie zarówno białka, jak i środka strącającego, aż do osiągnięcia równowagi, najlepiej w strefie zarodkowania kryształów na diagramie fazowym. Metoda okresowa polega na wprowadzeniu białka bezpośrednio do strefy zarodkowania poprzez zmieszanie białka z odpowiednią ilością środka strącającego (ryc. 1B). Ta metoda jest zwykle wykonywana w mieszaninie parafiny i oleju mineralnego, aby zapobiec dyfuzji wody z kropli.

Tutaj zademonstrujemy dwa rodzaje eksperymentalnych ustawień dyfuzji pary, wiszące krople i siedzące krople, a także krystalizację wsadową pod olejem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materiały:

  • Próbka białka - lizozym (50 mg/mL)
  • Wisząca taca 24-dołkowa
  • Taca 24-dołkowa z opadem do siedzenia
  • Krystalizacja mikropartii 96-dołkowa taca
  • Roztwory krystalizacyjne (dostępne na rynku lub domowej roboty)
  • Smar silikonowy
  • Strzykawka 5 ml bez Luer-lock
  • Silikonowane szkiełka osłonowe
  • Optyczna taśma uszczelniająca
  • parafina
  • Mikropipeta 0,1-2 μl z końcówkami o niskiej retencji
  • pęseta
  • Profesjonalne chusteczki

1. Procedura upuszczania w pozycji wiszącej/siedzącej:

  1. Do badania początkowego można użyć dostępnych na rynku ekranów, które wykorzystują metodę niekompletnej silni macierzy rzadkiej w warunkach próbnych. Metoda niekompletnej silni o rzadkiej matrycy jest obciążona i wybrana ze znanych warunków krystalizacji makrocząsteczek (Carter i Carter, 1979; Cudney i wsp., 1994; Jancarik i Kim, 1991; Jancarik i wsp., 1991). Jeśli warunek krystalizacji jest już znany, można zmontować wąskie sito, zmieniając stężenie osadu i pH wokół pierwotnego uderzenia. Najczęściej skutecznym środkiem strącającym jest glikol polietylenowy (PEG), a następnie siarczan amonu. Razem te dwa czynniki strącające stanowią około 60% wszystkich zarejestrowanych makromolekularnych środków strącających stosowanych do krystalizacji (Gilliland i wsp., 1994; Kimber i wsp., 2003; Page i wsp., 2003).
  2. Przygotuj roztwory krystalizacyjne. Zwykle warunki te są łączone ze środka strącającego, jakiejś soli i buforu do ustawiania pH. W niektórych przypadkach dodatki mogą być dodawane specjalnie dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Cały roztwór podstawowy należy przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm. Niektóre roztwory podstawowe mogą być bardzo lepkie (50% PEG, glicerol, PEG-MME itp.).
    • Przygotować 1,5 ml po 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl każdy w 0,1 M NaOAc pH 4,0, 4,3, 4,6 i 4,9 (razem 24 roztwory)
  3. Rozmrozić próbkę białka i trzymać na lodzie. Zapasy białka należy przechowywać w temperaturze -80°C, chyba że białko będące przedmiotem zainteresowania jest wrażliwe na cykle zamrażania/rozmrażania (jeśli tak, należy przechowywać w temperaturze 4°C). Typowe stężenia białek mieszczą się w zakresie 5-50 mg/ml, przy czym wyższe stężenia zwykle dają lepsze wyniki.
  4. Zawiruj próbkę 15 minut/18 000 x g / 4°C - niektóre białka mają tendencję do częściowej agregacji i wytrącania się po etapie rozmrażania. Agregaty te mogą sprzyjać amorficznemu wytrącaniu się pozostałych cząsteczek białka, dlatego dokładne odwirowanie zapewni, że w próbce będą tylko rozpuszczalne cząsteczki. Trzymaj białko na lodzie do momentu ustawienia tacki.
  5. Oznaczyć stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV. Stężenie białka można obliczyć na podstawie odczytu absorbancji i współczynnika ekstynkcji białka. Współczynnik ekstynkcji można obliczyć za pomocą narzędzia ProtParam na stronie Expasy: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
  6. Napełnij studzienki 24-dołkowej wiszącej/siedzącej tacki wrzutowej 500 μl roztworu strącającego zgodnie ze schematem ustawienia tacy (Rysunek 2B). Utwórz silikonowy pierścień smarowy wokół krawędzi studni. Pierścień powinien mieć niewielką szczelinę, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza podczas uszczelniania studni. W przypadku kropli do siedzenia nie ma potrzeby stosowania smaru, ponieważ studzienka jest uszczelniona taśmą (rysunek 2A).
  7. Weź szkiełko nakrywkowe i wyczyść je sprayem skondensowanego powietrza lub profesjonalną chusteczką - unikanie kurzu ułatwi interpretację kropli krystalizacji i wyeliminuje zanieczyszczenia. W przypadku zrzutów do siedzenia nie stosuje się szkiełek pokrywowych. Zamiast tego w studni znajduje się półka, na której miesza się białko i osad.
  8. Umieścić równe objętości próbki białka i roztworu rezerwuarowego na szkiełku nakrywkowym. W ramach procesu optymalizacji można wypróbować różne objętości białka i środka strącającego. Użycie większej ilości białka niż strącającego powoduje stężenie netto białka w kropli po zrównoważeniu, co może być pożądane w przypadku rozcieńczonych próbek białek oraz w celu spowolnienia zarodkowania lub wzrostu kryształów. Każda inna substancja nielotna w roztworze kroplowym będzie również zagęszczona przez ten sam czynnik. Podczas pipetowania roztworów białkowych i zbiornikowych na szkiełko przykrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Dzieje się tak często, gdy powietrze jest wydmuchiwane z pipety.
    • Wisząca kropla: Załadować 2 μl lizozymu 50 mg/ml w 0,02 M NaOAc o pH 4,9 do środka szkiełka przykrywkowego i dodać do niego 2 μl roztworu zbiornika.
    • Kropla do siedzenia: Załaduj 2 μl 50 mg/ml roztworu lizozymu na środek półki i dodaj do niego 2 μl roztworu rezerwuarowego.
  9. Delikatnie odwróć szkiełko pokrywy i połóż je na pierścieniu smarowym na górze studzienki. Delikatnie dociśnij, aby powietrze mogło wydostać się ze studni przez nacięcie w smarze, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza w studni i utrzymać dobrze uszczelnioną studnię. Wzrost ciśnienia powietrza w studni może podnieść suwak pokrywy, zagrażając uszczelnieniu studni. W metodzie siedzącej do zakrycia studzienek używa się optycznie przezroczystej przezroczystej taśmy. Stąd w tej metodzie uszczelnianie będzie odbywać się w każdym rzędzie/kolumnie.
  10. Przejdź do następnej studzienki, aż taca będzie kompletna.
  11. Sprawdź tacę po ustawieniu - wyeliminowanie cząsteczek kurzu i innych zanieczyszczeń może zmniejszyć liczbę fałszywie dodatnich wyników identyfikacji kryształów białek.
  12. Użyj arkusza punktacji, aby udokumentować swój eksperyment.
  13. Umieść tacę w żądanej temperaturze inkubacji, zwykle między 4°C a temperaturą pokojową. Najczęściej udaje się to w 20°C. Uważaj, aby delikatnie obchodzić się z tacą i unikać potrząsania. Zachowaj ostrożność podczas otwierania i zamykania drzwi inkubatora. Wibracje lub zmiany temperatury podczas transferu lub inkubacji mogą zapobiegać wzrostowi kryształów lub negatywnie wpływać na ich jakość. Materiał amortyzujący wstrząsy (np. pianka do pakowania) może być użyty jako wyściółka pod tacami kryształowymi.
  14. Następnego dnia sprawdź, czy na tacce nie ma kryształów, a następnie co kilka dni, zawsze ostrożnie obchodząc się z tacami. Udokumentuj wszelkie wyniki i morfologie upuszczenia w arkuszu punktacji specyficznym dla tacy. Kryształy pojawiają się zazwyczaj po 2-5 dniach, chociaż czasami pojawiają się znacznie wcześniej (prawie natychmiast) lub później (do kilku miesięcy!). Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu tempa wzrostu kryształów, najlepiej pozostawić tace w spokoju, dopóki kryształy nie pojawią się i nie urosną do co najmniej połowy ich ostatecznego rozmiaru. Pozostawienie tac w spokoju może zmniejszyć liczbę zdarzeń zarodkowania kryształów, a tym samym wytwarzać mniejszą liczbę większych kryształów.

2. Procedura mikroporcji:

  1. Próbka białka i preparat strącający są opisane powyżej.
  2. Spryskaj powietrzem nową tackę na mikrobaty, aby uniknąć kurzu i innych dużych cząstek.
  3. W tacce na mikrobaty wlej olej parafinowy o wysokości do 3 mm (tylko tyle, aby przykryć studzienki). Usuń dostęp oleju.
  4. Załaduj 1 μl roztworu białkowego (50 mg/ml lizozymu) do wstępnie napełnionej studzienki olejowej - upewnij się, że roztwór jest pipetowany bezpośrednio na dno studzienki (ryc. 2A).
  5. Załaduj 1 μl roztworu strącającego do studzienki zgodnie ze schematem ustawienia tacy (rysunek 2B) - upewnij się, że kropla opada na dno studzienki i łączy się z kroplą białka.
  6. Przejdź do następnej studzienki, aż taca będzie kompletna.
  7. Postępuj zgodnie z krokami 11-14 procedury upuszczania w pozycji wiszącej/siedzącej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalizacja jest zwykle określana jako wąskie gardło krystalografii rentgenowskiej. Rzadki matrycowy, niekompletny ekran czynnikowy warunków wytrącania zazwyczaj wytwarza wiele różnych rodzajów agregacji i wytrącania białek, w tym duże monokryształy. Jeśli stężenie białka lub strącania jest zbyt wysokie, można zobaczyć brunatną materię bez wyraźnego kształtu i wielkości (wytrącanie amorficzne). Gdy roztwór jest nienasycony, kropla często będzie całkowicie przejrzysta i pozbawiona jakichkolwiek opadów. Rysunek 3 przedst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy i demonstrujemy ogólne aktualne protokoły krystalizacji białek. Ponieważ jest to procedura wieloetapowa, należy pamiętać o kilku kwestiach. Podczas pracy z bardzo małymi objętościami (0,5-2 μl) wysuszenie kropli w wyniku parowania jest poważnym problemem. Dlatego zaleca się pracę w dobrze kontrolowanym środowisku (z niskim przepływem powietrza, wysoką wilgotnością i ścisłą kontrolą temperatury) oraz przyjęcie techniki, która minimalizuje ekspozycję kropli na świeże powietrze. Z tego powodu niezbę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Burroughs Wellcome Investigator Award dla YM oraz przez Brown-Coxe Postdoctoral Fellowship z Uniwersytetu Yale dla lekarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LysozymeSigma-aldrichL6876-1G
24-dołkowa płytaHampton researchHR3-142
24-dołkowa płyta Cryschem HamptonresearchHR3-158
Dow Corning Vacuum GreaseHampton researchHR3-510
Silikonowane szklane szkiełkaHampton researchHR3-231
100% olejHampton researchHR3-411
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniająca o szerokości 1,88 calaHampton researchHR3-511
VDX nakrywkowe parafinowy 96 Well Imp@ct Plate (płytka mikroporcjowa)Hampton research HR3-098

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  2. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  3. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  4. Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
  5. Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
  6. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
  7. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
  8. Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
  9. Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
  10. McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
  11. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  12. Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Vapor DiffusionHanging DropSitting DropBatch CrystallizationMicro BatchProtein PurificationPrecipitant SolutionCrystal Nucleation

Powiązane artykuły