$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wykorzystanie trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych do wnioskowania o ich funkcjonowaniu jest jedną z najważniejszych dziedzin współczesnej biologii. Dostępność atomowych struktur rozdzielczych zapewnia głębokie i unikalne zrozumienie funkcji białek i pomaga rozwikłać wewnętrzne funkcjonowanie żywej komórki. Do tej pory 86% wpisów w Banku Danych o Białkach (rcsb-PDB) to struktury makromolekularne, które zostały określone za pomocą krystalografii rentgenowskiej.
Aby uzyskać kryształy odpowiednie do badań krystalograficznych, makrocząsteczka (np. białko, kwas nukleinowy, kompleks białko-białko lub kompleks białko-kwas nukleinowy) musi zostać oczyszczona do jednorodności lub jak najbardziej zbliżonej do jednorodności. Jednorodność preparatu jest kluczowym czynnikiem w otrzymywaniu kryształów, które ulegają dyfrakcji z wysoką rozdzielczością (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Krystalizacja wymaga doprowadzenia makrocząsteczki do przesycenia. Próbka powinna być zatem zagęszczona do najwyższego możliwego stężenia, nie powodując agregacji lub wytrącania makrocząsteczki (zwykle 2-50 mg/ml). Wprowadzenie próbki do środka strącającego może sprzyjać zarodkowaniu kryształów białka w roztworze, co może skutkować wyrastaniem dużych trójwymiarowych kryształów z roztworu. Istnieją dwie główne techniki otrzymywania kryształów: dyfuzja parowa i krystalizacja okresowa. W dyfuzji pary kropla zawierająca mieszaninę roztworów strącających i białkowych jest zamykana w komorze z czystym środkiem strącającym. Para wodna następnie dyfunduje z kropli, aż osmolarność kropli i środka strącającego będą równe (rysunek 1A). Odwodnienie kropli powoduje powolne stężenie zarówno białka, jak i środka strącającego, aż do osiągnięcia równowagi, najlepiej w strefie zarodkowania kryształów na diagramie fazowym. Metoda okresowa polega na wprowadzeniu białka bezpośrednio do strefy zarodkowania poprzez zmieszanie białka z odpowiednią ilością środka strącającego (ryc. 1B). Ta metoda jest zwykle wykonywana w mieszaninie parafiny i oleju mineralnego, aby zapobiec dyfuzji wody z kropli.
Tutaj zademonstrujemy dwa rodzaje eksperymentalnych ustawień dyfuzji pary, wiszące krople i siedzące krople, a także krystalizację wsadową pod olejem.