Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Moshe A. Dessau; Yorgo Modis

doi:10.3791/2285

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

64.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2285

⸱

16 stycznia 2011

Moshe A. Dessau¹ , Yorgo Modis¹

¹Molecular Biochemistry and Biophysics, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Streszczenie

Wykorzystanie trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych do wnioskowania o tym, jak one funkcjonują, jest jedną z najważniejszych dziedzin współczesnej biologii. Dostępność struktur o rozdzielczości atomowej zapewnia głębokie i unikalne zrozumienie funkcji białek oraz pomaga odkryć wewnętrzne mechanizmy działania żywej komórki. Do tej pory 86% wpisów w Protein Data Bank (rcsb-PDB) stanowią struktury makrocząsteczkowe, które zostały wyznaczone przy użyciu krystalografii rentgenowskiej.

Aby uzyskać kryształy odpowiednie do badań krystalograficznych, makrocząsteczka (np. białko, kwas nukleinowy, kompleks białko-białko lub kompleks białko-kwas nukleinowy) musi zostać oczyszczona do stanu homogenności lub jak najbliżej stanu homogenności. Homogenność preparatu jest kluczowym czynnikiem w uzyskiwaniu kryształów dyfrakcyjnych o wysokiej rozdzielczości (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).

Krystalizacja wymaga doprowadzenia makrocząsteczki do stanu nasycenia nadmiernego. Próbka powinna zatem zostać skoncentrowana do najwyższego możliwego stężenia, które nie spowoduje agregacji lub precypitacji makrocząsteczki (zazwyczaj 2-50 mg/mL). Wprowadzenie próbki do czynnika wytrącającego może promować nukleację kryształów białka w roztworze, co może prowadzić do wzrostu dużych kryształów trójwymiarowych z roztworu. Istnieją dwie główne techniki pozyskiwania kryształów: dyfuzja par oraz krystalizacja okresowa (metoda batch). W dyfuzji par kropla zawierająca mieszaninę roztworów czynnika wytrącającego i białka jest zamknięta w komorze z czystym czynnikiem wytrącającym. Para wodna dyfunduje następnie z kropli, aż osmolarity kropli i czynnika wytrącającego się wyrównają (Rysunek 1A). Dehydratacja kropli powoduje powolną koncentrację zarówno białka, jak i czynnika wytrącającego, aż do osiągnięcia stanu równowagi, idealnie w strefie nukleacji kryształów na diagramie fazowym. Metoda batch polega na bezpośrednim wprowadzeniu białka do strefy nukleacji poprzez zmieszanie białka z odpowiednią ilością czynnika wytrącającego (Rysunek 1B). Metodę tę wykonuje się zazwyczaj pod mieszaniną parafiny i oleju mineralnego, aby zapobiec dyfuzji wody z kropli.

W niniejszym materiale zaprezentujemy dwa rodzaje układów eksperymentalnych do dyfuzji pary – metodę wiszącej kropli oraz metodę siedzącej kropli, a także krystalizację metodą wsadową pod warstwą oleju.

Protokół

Materiały:

Próbka białka – lyzozym (50 mg/ mL)
Płytka 24-dołkowa do metody wiszącej kropli
Płytka 24-dołkowa do metody siedzącej kropli
Płytka 96-dołkowa do krystalizacji metodą microbatch
Roztwory krystalizacyjne (dostępne komercyjnie lub przygotowane samodzielnie)
Smar silikonowy
Strzykawka 5 mL bez końcówki Luer-lock
Silikonizowane szkiełka nakrywkowe
Optyczna taśma uszczelniająca
Parafina
Mikropipeta 0,1-2 μL z końcówkami o niskiej retencji
Pęseta
Chusteczki specjalistyczne

1. Procedura kropli wiszącej/siedzącej:

Do wstępnego przesiewu można wykorzystać dostępne komercyjnie zestawy przesiewowe oparte na metodzie rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego dla warunków próbnych. Metoda rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego jest oparta na znanych warunkach krystalizacji makrocząsteczek i jest z nich wybierana (Carter and Carter, 1979; Cudney et al., 1994; Jancarik and Kim, 1991; Jancarik et al., 1991). Jeśli warunki krystalizacji są już znane, można przygotować wąski zestaw przesiewowy, zmieniając stężenie czynnika wytrącającego i pH wokół pierwotnie uzyskanego wyniku. Najskuteczniejszym i najczęściej stosowanym czynnikiem wytrącającym jest glikol polietylenowy (PEG), a następnie siarczan amonu. Te dwa czynniki odpowiadają za około 60% wszystkich zarejestrowanych czynników wytrącających makrocząsteczek stosowanych w krystalizacji (Gilliland et al., 1994; Kimber et al., 2003; Page et al., 2003).
Przygotować roztwory do krystalizacji. Zazwyczaj warunki te stanowią kombinację czynnika wytrącającego, odpowiedniej soli oraz buforu ustalającego pH. W niektórych przypadkach do konkretnego białka mogą zostać dodane specjalne dodatki. Wszystkie roztwory stokowe należy przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Niektóre roztwory stokowe mogą być bardzo lepkie (np. 50% PEGs, glicerol, PEG-MME).
- Przygotować po 1,5 mL roztworów NaCl o stężeniach 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M, każdy w 0,1 M NaOAc o pH 4,0, 4,3, 4,6 oraz 4,9 (łącznie 24 roztwory)
Odmrozić próbkę białka i przechowywać na lodzie. Stokowe roztwory białek należy przechowywać w temperaturze -80°C, chyba że badane białko jest wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania (w takim przypadku przechowywać w 4°C). Typowe stężenia białek mieszczą się w zakresie 5-50 mg/ mL, przy czym wyższe stężenia zazwyczaj dają lepsze wyniki.
Wirować próbkę przez 15 min przy 18 000×g w 4°C – niektóre białka mają tendencję do częściowej agregacji i wytrącania się po rozmrożeniu. Agregaty te mogą promować amorficzne wytrącanie pozostałych cząsteczek białka, dlatego dokładne wirowanie zapewni obecność w próbce wyłącznie cząsteczek rozpuszczalnych. Białko przechowywać na lodzie do momentu przygotowania płytki.
Wyznaczyć stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV. Stężenie białka można obliczyć z odczytu absorbancji i współczynnika ekstynkcji białka. Współczynnik ekstynkcji można obliczyć za pomocą narzędzia ProtParam na stronie internetowej Expasy: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
Napełnić dołki 24-dołkowej płytki do metody kropli wiszącej/siedzącej 500 μL roztworu czynnika wytrącającego zgodnie ze schematem ustawienia płytki (Rysunek 2B). Utworzyć pierścień z smaru silikonowego wokół krawędzi dołka. Pierścień powinien mieć małą przerwę, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza podczas uszczelniania dołka. W metodzie kropli siedzącej smar nie jest potrzebny, ponieważ dołek uszczelnia się taśmą (Rysunek 2A).
Wziąć szkiełko nakrywkowe i oczyścić je sprężonym powietrzem lub profesjonalną chusteczką – unikanie kurzu ułatwi interpretację kropli krystalizacyjnej i wyeliminuje zanieczyszczenia. W metodzie kropli siedzącej szkiełka nakrywkowe nie są stosowane. Zamiast tego dołek zawiera półkę, na której miesza się białko z czynnikiem wytrącającym.
Nanieść równe objętości próbki białka i roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe. W ramach procesu optymalizacji można wypróbować różne objętości białka i czynnika wytrącającego. Zastosowanie większej ilości białka niż czynnika wytrącającego prowadzi do zwiększenia stężenia białka w kropli po osiągnięciu stanu równowagi, co może być pożądane w przypadku rozcieńczonych próbek białek oraz w celu spowolnienia nukleacji lub wzrostu kryształów. Każda inna substancja nieletna w roztworze kropli zostanie również skoncentrowana przez ten sam czynnik. Podczas pipetowania białka i roztworów z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Dzieje się to często, gdy powietrze jest wydmuchiwane z pipety.
- Kropla wisząca: Nanieść 2 μL lizozymu o stężeniu 50 mg/ mL w 0,02 M NaOAc pH 4,9 na środek szkiełka nakrywkowego i dodać do niego 2 μL roztworu z rezerwuaru.
- Kropla siedząca: Nanieść 2 μL roztworu lizozymu o stężeniu 50 mg/ mL na środek półki i dodać do niego 2 μL roztworu z rezerwuaru.
Ostrożnie obrócić szkiełko nakrywkowe i położyć je na pierścieniu ze smaru na górze dołka. Delikatnie docisnąć, aby powietrze mogło uciec z dołka przez wycięcie w smarze, co zapobiegnie wzrostowi ciśnienia powietrza w dołku i zapewni szczelność. Wzrost ciśnienia powietrza w dołku może unieść szkiełko nakrywkowe, naruszając uszczelnienie. W metodzie kropli siedzącej do uszczelnienia dołków stosuje się optycznie przejrzystą taśmę przezroczystą. Zatem w tej metodzie uszczelnianie odbywa się dla każdego rzędu/kolumny.
Przejść do następnego dołka, aż cała płytka zostanie przygotowana.
Sprawdzić płytkę po przygotowaniu – wyeliminowanie cząsteczek kurzu i innych zanieczyszczeń może zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich przy identyfikacji kryształów białka.
Użyć arkusza ocen do dokumentowania eksperymentu.
Umieścić płytkę w pożądanej temperaturze inkubacji, zazwyczaj między 4°C a temperaturą pokojową. Najczęściej skuteczną temperaturą jest 20°C. Należy obchodzić się z płytką delikatnie i unikać wszelkich wstrząsów. Zachować ostrożność podczas otwierania i zamykania drzwi inkubatora. Wibracje lub zmiany temperatury podczas przenoszenia lub inkubacji mogą zapobiec wzrostowi kryształów lub negatywnie wpłynąć na ich jakość. Jako wyściółkę pod płytkami do kryształów można zastosować materiał amortyzujący (np. piankę opakowaniową).
Sprawdzić obecność kryształów na płytce następnego dnia, a następnie co kilka dni, zawsze obchodząc się z płytkami ostrożnie. Dokumentować wszelkie znaleziska i morfologię kropli w arkuszu ocen dedykowanym dla danej płytki. Kryształy zazwyczaj pojawiają się w ciągu 2-5 dni, choć sporadycznie mogą pojawić się znacznie szybciej (niemal natychmiast) lub później (nawet po kilku miesiącach!). Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu szybkości wzrostu kryształów najlepiej pozostawić płytki w spokoju, aż kryształy pojawią się i urosną do co najmniej połowy ich końcowej wielkości. Pozostawienie płytek w spokoju może zmniejszyć liczbę zdarzeń nukleacji kryształów, co prowadzi do powstania mniejszej liczby większych kryształów.

2. Procedura mikrobatchowa:

Przygotowanie próbki białka i czynnika wytrącającego odbywa się zgodnie z powyższym opisem.
Nową tackę do metody mikrobatch należy oczyścić za pomocą sprężonego powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia kurzem i innymi dużymi cząstkami.
Wypełnić tackę do metody mikrobatch olejem parafinowym do wysokości 3 mm (tyle, aby zakryć dołki). Usunąć nadmiar oleju.
Do dołka wypełnionego olejem nanieść 1 μL roztworu białka (lizozym 50 mg/ mL) – należy pipetować roztwór bezpośrednio na dno dołka (Rycina 2A).
Do dołka nanieść 1 μL roztworu czynnika wytrącającego zgodnie ze schematem rozmieszczenia na tacce (Rycina 2B) – należy upewnić się, że kropla opadnie na dno dołka i połączy się z kroplą białka.
Powtarzać czynność dla kolejnych dołków, aż cała tacka zostanie wypełniona.
Postępować zgodnie z krokami 11–14 procedury dla kropli wiszącej/siedzącej.