Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Podsumowanie

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Streszczenie

Profilowanie stabilnymi izotopami od dawna pozwala na czułe badania skutków metabolicznych mutacji genetycznych i/lub terapii farmakologicznych w modelach komórkowych i ssaczych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowe metody przeprowadzania profilowania stabilnymi izotopami metabolizmu pośredniego oraz strumienia metabolicznego u nicienia Caenorhabditis elegans. Opisano metody profilowania wolnych aminokwasów w całym organizmie nicienia, znakowanego dwutlenku węgla, znakowanych kwasów organicznych oraz znakowanych aminokwasów w zwierzętach poddanych działaniu stabilnych izotopów – albo od wczesnego etapu rozwoju na płytkach agarowych z pożywką wzrostową dla nicieni, albo począwszy od wczesnej dorosłości podczas ekspozycji na różne terapie farmakologiczne w hodowli płynnej. Wolne aminokwasy są ilościowo oznaczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w alikwotach całych nicieni ekstrahowanych w 4% kwasie nadchlorowym. Jako prekursor stabilnego izotopu wykorzystuje się uniwersalnie znakowaną glukozę ¹³C lub 1,6-¹³C₂-glukozę, której znakowany węgiel jest śledzony za pomocą spektrometrii mas w dwutlenku węgla (zarówno atmosferycznym, jak i rozpuszczonym), a także w metabolitach wskazujących na strumień poprzez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasu trójkarboksylowego. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, aby zademonstrować wpływ czasu ekspozycji na izotop, różnych protokołów usuwania bakterii oraz alternatywnych metod rozdrabniania nicieni u osobników typu dzikiego, a także względny stopień wbudowania izotopu u nicieni z mutacją kompleksu III mitochondriów (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego. Zastosowanie profilowania stabilnymi izotopami u żywych nicieni zapewnia nową możliwość badania na poziomie całego organizmu zmian metabolicznych zachodzących w czasie rzeczywistym, wywołanych przez poszczególne zaburzenia genetyczne i/lub terapie farmakologiczne.

Protokół

Protokół A: Stabilne profilowanie izotopowe metabolizmu pośredniego podczas rozwoju C. elegans na płytkach NGM.

*Uwaga: Wzbogacenie izotopami stabilnymi można z powodzeniem zmierzyć w populacjach młodych dorosłych nicieni po ekspozycji na izotopy (z użyciem albo uniwersalnie znakowanej glukozy ¹³C, albo 1,6-¹³C₂-glukozy), rozpoczynając proces albo we wczesnym etapie rozwoju, albo we wczesnej dorosłości. Niniejszy protokół umożliwia jednoczesne monitorowanie stanu zdrowia, rozwoju i wzrostu zwierząt na standardowych pożywkach do wzrostu nicieni (NGM), co nie jest tak łatwe do osiągnięcia w hodowli ciekłej.

1. Przygotować płytki Petri 10 mm z 10 mL pożywki do wzrostu nicieni (NGM), zgodnie ze standardową techniką. ¹
2. Zasiać na płytkach NGM szczep OP50 E. coli ¹ i pozostawić do wyschnięcia przez noc.
3. Równomiernie nanieść na płytkę 50 μL 20 mM glukozy 1,6-¹³C₂ (aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM na płytce NGM). Pozostawić do wyschnięcia przez noc.
4. Przeprowadzić bleach gravid adult worms (odkażanie hipochlorytem zapłodnionych dorosłych osobników) ¹. Odzyskane jaja przenieść na płytki NGM bez bakterii lub glukozy 1,6-¹³C₂. Inkubować w temperaturze 20°C przez noc.
5. Następnego dnia przenieść wyklute larwy w stadium L1-arrested na płytki NGM uprzednio zaszczepione glukozą 1,6-¹³C₂ i E. coli OP50 (zgodnie z krokiem nr 2 powyżej). Hodować nicienie do stadium młodych dorosłych (48-72 godziny, w zależności od szczepu), dbając o to, aby nicienie nie głodowały.
6. Zebrać synchroniczne, pierwszodniowe młode dorosłe nicienie z płytek, używając 3-4 mL buforu S. Basal.
7. Przemyć nicienie w 50 mL buforu S. Basal w probówkach Falcon 50 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia przez grawitację przez 5 minut. Odpipować supernatant do objętości ~5 mL. Powtórzyć mycie jeszcze dwukrotnie.
8. Oszacować liczbę nicieni, odliczając trzy alikwoty po 100 μL². Dostosować stężenie nicieni do 100 nicieni/mL buforu S. basal.
9. Napipetować 1 mL (100 nicieni) do plastikowej probówki wirnikowej 1,5 mL.
10. Dodać 69 μL 60% PCA zawierającego standard wewnętrzny (kwas ε-aminokapronowy) do końcowego stężenia 4% PCA i 20 μmol standardu wewnętrznego.
11. Pozostawić nicienie do osadzenia przez grawitację przez 5 minut. Zebrać i przechować supernatant w innej probówce.
12. Rozetrzeć próbki nicieni za pomocą plastikowego homogenizatora (Kontes Pellet Pestle) i wiertarki elektrycznej (Kontes Pellet Pestle Cordless Motor) przez 15 sekund. Potwierdzić wizualnie rozbicie nicieni pod mikroskopem świetlnym. W razie potrzeby powtórzyć.
13. Przenieść supernatant z kroku nr 1 i połączyć z homogenatem z kroku nr 12.
14. Odwirować próbkę przy 250 rpm (130 x g) przez 5 minut.
15. Przenieść supernatant do nowej szklanej probówki 7 mL. Przechować osad do oznaczania stężenia białka, zgodnie z opisem w kroku nr 20 poniżej.
16. Dostosować pH próbek do zakresu 7-8 (neutralnego) przy użyciu 4N KOH.
17. Odwirować zneutralizowane próbki w szklanych probówkach 7 mL przy 250 rpm (130 x g) przez 5 minut w celu usunięcia soli.
18. Przenieść supernatant do nowej szklanej probówki 7 mL.
19. Przygotować zneutralizowane próbki do oznaczania metabolitów w następujący sposób:
    1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC): Oddzielić 50 μL zneutralizowanej próbki do bezpośredniego wtrysku do HPLC. Oznaczanie wolnych aminokwasów przeprowadza się metodą HPLC (Varian) z wykorzystaniem derywatyzacji przedkolumnowej o-ftalaldehydem i detekcją fluorescencyjną, zgodnie z wcześniejszym opisem^3-4.
    2. Chromatografia gazowa sprzężona z spektrometrią mas (GC/MS): Przystąpić do ekstrakcji pozostałych zneutralizowanych próbek przy użyciu żywicy jonowymiennej (Bio-Rad) w celu oznaczenia wzbogacenia izotopowego aminokwasów i kwasów organicznych metodą GC/MS, zgodnie ze szczegółami w PROTOKOLIE D.
20. Dodać 1 mL 1N NaOH do pozostałego osadu białkowego (z kroku nr 15) w szklanej probówce 7 mL.
21. Inkubować próbkę białka traktowaną NaOH w temperaturze pokojowej podczas rotacji (Labnet* LabRoller Rotator) przez noc, aż do całkowitego rozpuszczenia.
22. Użyć 75-10 μL białka traktowanego NaOH do oznaczenia stężenia białka standardowymi metodami (DC Protein Assay, Bio-rad).

Protokół B. Stabilne profilowanie izotopowe metabolizmu pośredniego u młodych dorosłych osobników C. elegans w hodowli płynnej.

*UWAGA: Efekty farmakologiczne wpływające na pośredni strumień metaboliczny u dorosłych nicieni można badać po ekspozycji na izotopy rozpoczynającej się w pierwszym dniu składania jaj, albo na płytkach NGM (patrz Protokół A powyżej), albo w hodowli ciekłej. Preferujemy to drugie podejście, aby zmaksymalizować efektywność kosztową wykorzystania izotopów stabilnych i czynników farmakologicznych.

1. Rozcieńczyć zsynchronizowane, młode dorosłe osobniki w pierwszym dniu składania jaj w pożywce S. basal zawierającej 0,05% cholesterolu (otrzymanej poprzez dodanie 0,5 ml 1% cholesterolu (rozpuszczonego w 95% etanolu) do 1 l pożywki S. basal) do stężenia 20 zwierząt na 500 μL.
2. Przygotuj kulturę (lub kultury) o całkowitej objętości ok. 4 ml w kolbach Erlenmeyera o pojemności 25 ml w następujący sposób:

   LECZENIE:	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	"LEK A
   S. podstawowe z cholesterolem	3020 μL	3020 µl – objętość „leku A”
   Stabilne izotopy (1,6-13C2-glukoza)	80 μL	80 μL
   K12 E. coli (OD660 2,5 do 3)	400 μL	400 μL
   Młode dorosłe nicienie (2 0)	500 μL	500 μL
   Lek A (pożądane stężenie)	-	Zgodnie z życzeniem

3. Przykryć kolby folią. Inkubować kolby przez 24 godziny przy 20 obr./min w 20°C inkubator z wytrząsarką platformową.
4. Należy upewnić się, że kolby nie są całkowicie szczelne, ponieważ tlen jest niezbędny dla pośredniego strumienia metabolicznego oraz dla wynikującego z niego znakowania endogennych metabolitów nicieni.
5. Przemyć nicienie, dodając 4 ml objętości kultury do 46 ml pożywki S. basal w 50 ml stożkowej probówce plastikowej. Pozostawić nicienie do osadzenia się przez grawitację przez 5 minut. Odessać nadsącz za pomocą pompy próżniowej, aż pozostanie ok. 5 ml. Powtórzyć płukanie, dwukrotnie uzupełniając objętość w probówce do 50 ml pożywką S. basal.
6. Skoncentrować przemyte nicienie do stężenia 10 osobników/ml w plastikowej probówce do wirowania o pojemności 1,5 ml.
7. Dodaj 69 μL 60% kwasu nadchlorowego (PCA) i 2 μL z 10 μM standard wewnętrzny (kwas ε-aminokapronowy), aby uzyskać końcowe stężenie wynoszące 200 μmol standard wewnętrzny i 4% PCA.
8. Przygotować próbki zgodnie z krokami 1–2 w PROTOKOLE A.

PROTOKÓŁ C-1. Monitorowanie wykorzystania izotopów przez dorosłe nicienie na płytkach poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferycznym i rozpuszczonym dwutlenku węgla.

*UWAGA: Podczas gdy PROTOKOŁY A i B szczegółowo opisują metody monitorowania wbudowy izotopów w wolne metabolity wewnątrz nicieni odpowiednio w ciągu 2-3 dni rozwoju lub 1 dnia życia dorosłych osobników, ogólne potwierdzenie sukcesu i kinetyki wbudowy izotopowej w krótkim czasie (tj. od minut do godzin) można osiągnąć poprzez monitorowanie znacznika w atmosferycznym dwutlenku węgla (CO₂) uwalnianym z nicieni lub zawartym w rozpuszczonym dwutlenku węgla w ekstrakcie z nicieni. Żywe lub zabite bakterie mogą być podawane nicieniom hodowanym na szalkach (PROTOKÓŁ C-1). Bakterie nie są konieczne do krótkotrwałej ekspozycji nicieni w kulturze płynnej na izotopy (PROTOKÓŁ C-2).

1. Przygotować płytki Petri o średnicy 10 mm z 10 mL agaru NGM. Zasiać na płytkach NGM żywe lub zabite promieniami UV bakterie OP50 E. coli (zgodnie z demonstracją na Rysunku 1). Pozostawić płytki do wyschnięcia przez noc.
2. Dodać 50 μL 20 mM glukozy znakowanej 1,6-¹³C₂ do zasianych bakteriami OP50 płytek NGM (aby uzyskać końcowe stężenie izotopu 10 mM na płytce NGM). Pozostawić płytki do wyschnięcia przez noc.
3. Uzyskać synchroniczne, młode dorosłe nicienie w pierwszym dniu składania jaj, hodowane na płytkach z agarem NGM zasianych wyłącznie bakteriami OP50 E. coli.
4. Przenieść 10 młodych dorosłych nicieni na eksperymentalne płytki z agarem NGM zawierające izotop trwały i E. coli (przygotowane zgodnie z krokami nr 1-2 powyżej).
5. Umieścić eksperymentalną płytkę NGM (bez pokrywy) w specjalnie wykonanej komorze szklanej wyposażonej w szczelny trójdrożny kurek, aby umożliwić precyzyjne pobieranie i wymianę atmosfery. Natychmiast zamknąć komory optycznie przezroczystym szklanym dyskiem. Uszczelnić miejsce styku szklanego dysku z płytką za pomocą smaru wysokopróżniowego. Zapisać czas jako „Czas 0”.
6. Pobrać 10 mL atmosfery z komory szklanej za pomocą trójdrożnego kurka i strzykawki 20 mL w minutach 30, 60, 90 i 120. Przenieść każdą próbkę atmosferyczną do wcześniej przygotowanej, zamkniętej próżniowo szklanej probówki z gumowym korkiem, zawierającej 1 mL 1 mM NaHCO₃ w 0,1 N NaOH.
7. Wstrzyknąć 10 mL powietrza z powrotem do każdej komory szklanej przez trójdrożny kurek za pomocą strzykawki 20 mL. Zamknąć kurek do komory po pobraniu/ponownym wstrzyknięciu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji pomiędzy punktami czasowymi pobierania próbek.
8. Wstrzyknąć 100 μL 20% kwasu fosforowego przez korek do szklanej probówki z gumowym korkiem zawierającej próbkę CO₂ z atmosfery.
9. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL niebieskich probówek do autosamplera wypełnionych wcześniej helem w celu pomiaru CO₂ z atmosfery.
10. Przeanalizować „próbki CO₂ z atmosfery” za pomocą spektrometru mas o stosunku gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Otworzyć komory szklane po dwugodzinnym okresie inkubacji z izotopem i pobraniu wszystkich próbek atmosferycznych.
12. Zmyć nicienie z płytek NGM, używając 3 mL S. basal.
13. Przemyć nicienie w 50 mL S. basal w probówkach Falcon 50 mL. Powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy.
14. Skoncentrować nicienie do stężenia ~10 nicieni/mL w okrągłodennych szklanych probówkach o pojemności 7 mL.
15. Zamknąć probówkę szklaną gumowym korkiem w warunkach próżni.
16. Dodać 10 μL 20% kwasu fosforowego przez gumowy korek za pomocą strzykawki w celu uwolnienia rozpuszczonego CO₂.
17. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL niebieskich probówek do autosamplera wypełnionych wcześniej helem w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂.
18. Przeanalizować „próbki rozpuszczonego CO₂” za pomocą spektrometru mas o stosunku gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protokół alternatywny (C-2): Monitorowanie wykorzystania izotopów u dorosłych nicieni w kulturze płynnej poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferycznym i rozpuszczonym dwutlenku węgla.

1. Przygotować synchronizowane, młode dorosłe nicienie z pierwszego dnia znoszenia jaj, hodowane na płytkach agarowych NGM wysianych z E. coli szczepu OP50.
2. Przemyć nicienie w 50 mL roztworu S. basal w probówkach Falcon o pojemności 50 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia się pod wpływem grawitacji przez 5 minut. Odessać nadmiar nadsączu do poziomu ~5 mL. Powtórzyć proces płukania jeszcze dwukrotnie.
3. Przenieść 10 młodych dorosłych nicieni w 1 mL roztworu S. basal do szklanej probówki o okrągłym dnie o pojemności 10 mL. Do 1 mL zawiesiny nicieni dodać 10,1 μl roztworu stokowego 1 M glukozy uniwersalnie znakowanej ¹³C, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM.
4. Natlenić szklaną probówkę o okrągłym dnie zawierającą nicienie i izotop, wymieniając atmosferę poprzez przepływ 10% tlenu w otwartej probówce przez 2 minuty. Natychmiast zamknąć probówkę gumowym korkiem.
5. Wstrząsać probówkami eksperymentalnymi na inkubowanej platformie wstrząsowej w temperaturze 20°C przy 20 rpm. Zapisać czas rozpoczęcia jako „Czas 0”.
6. Pobrać próbkę 5 mL atmosfery z szklanej probówki o okrągłym dnie o pojemności 10 mL za pomocą strzykawki 10 mL i igły 25 G przez gumowy korek w 30, 60, 90 i 120 minucie.
7. Przenieść każdą próbkę atmosfery do wcześniej przygotowanej, zamkniętej gumowym korkiem szklanej probówki o pojemności 10 mL, zawierającej 1 mL 1 mM NaHCO₃ w 0,1 N NaOH i zapieczętowanej próżniowo.
8. Wstrzyknąć 5 mL powietrza z powrotem do każdej eksperymentalnej szklanej probówki o okrągłym dnie zawierającej nicienie i izotop przez gumowy korek, używając strzykawki 10 mL i igły 25 G.
9. Wznowić inkubację eksperymentalnych szklanych probówek o okrągłym dnie o pojemności 10 mL z nicieniami i izotopem poprzez wstrząsanie przy 20 rpm pomiędzy punktami czasowymi pobierania próbek.
10. Wstrzyknąć 10 μL 20% kwasu fosforowego przez korek do atmosfery w szklanej probówce o pojemności 10 mL zamkniętej gumowym korkiem.
11. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL niebieskich probówek do autosamplera wypełnionych wcześniej hellem w celu pomiaru atmosferycznego CO₂.
12. Przeanalizować „próbki atmosferycznego CO₂” za pomocą spektrometru mas z pomiarem stosunków gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. Po zakończeniu okresu eksperymentalnego przemyć nicienie w 50 mL roztworu S. basal w probówce Falcon 50 mL. Pozostawić osad z nicieni do uformowania się pod wpływem grawitacji. Odessać nadsącz próżniowo do pozostałości ~5 mL. Powtórzyć płukanie dwukrotnie w 50 mL roztworu S. basal.
14. Skoncentrować nicienie do stężenia ~10 nicieni/mL w szklanej probówce o okrągłym dnie o pojemności 7 mL. Zamknąć probówkę gumowym korkiem i zapieczętować próżniowo. Przez gumowy korek wstrzyknąć 10 μL 20% kwasu fosforowego za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 25 G, aby uwolnić rozpuszczony CO₂ z nicieni.
15. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL niebieskich probówek do autosamplera wypełnionych wcześniej hellem w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂.
16. Przeanalizować „próbki rozpuszczonego CO₂” za pomocą spektrometru mas z pomiarem stosunków gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protokół D. Przetwarzanie zneutralizowanych próbek z Protokołów A i B do analizy aminokwasów i kwasów organicznych metodą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas.

1. Przygotowanie kulek:
   1. Do kulek Ag 1 oraz Ag 50 dodaj oddzielnie 1 N HCl w zlewkach o pojemności 1L.
   2. Mieszaj każdą kolbę przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego.
   3. Myj kulki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH popłuczyn będzie równe pH wody.
2. Przygotowanie kolumn:
   1. Wprowadź czop bawełniany tuż powyżej najwęższej części końcówki pipety Pasteura.
   2. Do każdej z dwóch kolumn na próbkę dodaj naładowane kulki, wypełniając każdą z nich do około jednej trzeciej wysokości kolumny. Do ekstrakcji kwasów organicznych użyj kulek AG1. Do ekstrakcji aminokwasów użyj kulek AG50.
3. Przetwarzanie próbek:
   1. Do kolumny z naładowanymi kulkami AG1 dodaj 50 μL próbki. Jeśli próbka ma już neutralne pH, przed nałożeniem jej na kolumnę AG1 w celu ekstrakcji kwasów organicznych nie dodaje się do niej nic (patrz PROTOKÓŁ A, krok nr 19B).
   2. Do pozostałej części próbki przed nałożeniem jej na kolumnę AG50 w celu ekstrakcji aminokwasów dodaj 1 mL 0,1 N HCL.
   3. Pozostaw próbki do całkowitego przepłynięcia przez kolumny.
   4. Myj kolumnę wodą 10 razy, aż popłuczyny będą neutralne (zakres pH 7-8).
   5. Eluuj kolumny do świeżych, opisanych szklanych fiolek na próbki o pojemności 4 mL:
      1. W przypadku ekstrakcji kwasów organicznych dodaj 3mL 3 N HCl do kolumny AG1. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego w całkowitej liczbie znakowanych węgli wśród związków 3-węglowych (mleczan), 4-węglowych (asparaginian, bursztynian, jabłczan), 5-węglowych (glutaminian) i 6-węglowych (cytrynian).
      2. W przypadku ekstrakcji aminokwasów: dodaj 3mL 4 N NH₄OH do kolumny AG50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego w całkowitej liczbie znakowanych węgli wśród związków 3-węglowych (alanina) i 5-węglowych (glutamina).
   6. Umieść fiolki z próbkami w ewaporatorze Reacti-Vap III na noc, aż wyschną.

E. Deratyzacja próbek i ustawienia urządzenia do spektrometrii mas

Do każdej fiolki z próbką dodać 50 μL acetonitrylu i 50 μL n-metylo-n-t-butyldimetylosilylotrifluoroacetamidu (MTBSTFA). Przykryć, wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 60°C. Do chromatografu gazowego sprzężonego z spektrometrem mas (GC/MS) wstrzyknąć 1-2 μl z każdej próbki.

F. Analiza wyników

1. Kwantyfikacja pików aminokwasów. Ilość każdego aminokwasu w analizie HPLC oblicza się na podstawie powierzchni każdego piku w stosunku do powierzchni piku standardu wewnętrznego.
2. Obliczanie wzbogacenia izotopowego. Stopień wzbogacenia stabilnymi izotopami oblicza się w programie Excel (Microsoft) dla każdego gatunku zgodnie z następującym wzorem: Atom Percent Excess, corrected (APE) = (R_sa-R_st)*10/[(R_sa-R_st)+10], gdzie R_sa – stosunek w próbce, a R_st – stosunek w standardzie.
3. Ocena różnic statystycznych między wzbogaceniem próbek. Do oceny istotności różnic w zawartości aminokwasów i znacznikach izotopowych między próbkami wykorzystuje się test t Studenta.

REPREZENTATYWNE WYNIKI:

Stabilny izotop został dobrze wchłonięty przez młode dorosłe nicienie, co potwierdzono poprzez pomiar znakowanego węgla w atmosferycznym CO2₂ or rozpuszczony w organizmach nicieni CO2. U nicieni karmionych żywymi lub zabitymi promieniami UV szczepami OP50 E. coli, stosunek ¹³Tlenek węgla₂ do ¹²CO₂ było większe w przypadku rozpuszczonego nicienia CO₂ frakcja w stosunku do uwolnionego do atmosfery CO₂ (Rycina 1). Karmienie nicieni żywymi lub zabitymi bakteriami OP50 E. coli nie zmieniły w sposób znaczący pomiaru ¹³CO₂ Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. ¹²CO₂ stosunek w ekstrakcie z przemytych nicieni (patrz PROTOKÓŁ C1).

Przedłużona ekspozycja na stabilny izotop od wczesnego okresu larwalnego zwiększyła wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich. Poprawiona wartość nadmiaru procentowego atomów znakowanego węgla określona w metabolitach pośrednich młodych dorosłych nicieni typu dzikiego była wyższa dla wszystkich gatunków glutaminianu w przypadku, gdy nicienie były karmione uniwersalnie znakowaną glukozą ¹³C i żywymi bakteriami przez cały okres rozwoju, w porównaniu z osobnikami traktowanymi analogicznie, którym podawano znakowane bakterie jedynie przez 48 godzin po osiągnięciu dorosłego stadium składającego jaja (Rycina 2).

Wpływ czasu oczyszczania na wzbogacenie izotopowe. Niezależnie od czasu ekspozycji, wszystkie zwierzęta hodowane na płytkach zostały „oczyszczone” z izotopowego znacznika przed dalszym przygotowaniem do analiz GC/MS. Porównanie protokołów oczyszczania przeprowadzono zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2 schematem, obejmując karmienie nicieni przez 2 godziny na płytkach agarowych NGM z wysianymi żywymi, świeżymi bakteriami bez izotopu, karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 godziny oraz karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. Bez względu na przebieg ekspozycji izotopowej, nie zaobserwowano istotnych różnic we wzbogaceniu izotopowym metabolitów pośrednich w ekstraktach z całych dorosłych nicieni, gdy zwierzęta były oczyszczane na płytkach bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. W przeciwieństwie do tego, mniejsze wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich zaobserwowano, gdy zwierzęta były następnie „oczyszczane” z nadmiaru izotopu poprzez karmienie nieznacznymi bakteriami przez dwie godziny. Jednakże zwiększone wzbogacenie w gatunkach +3, +4 i +5 było widoczne, gdy nicienie były eksponowane na izotop od wczesnego okresu larwalnego. W związku z tym ustalono, że optymalny protokół oczyszczania polega na oczyszczaniu nicieni po ich inkubacji na płytkach NGM z wysianym stabilnym izotopem i bakteriami poprzez następującą inkubację przez 2 godziny na niezesianych płytkach NGM. Należy zauważyć, że nicienie hodowane w kulturze płynnej były płukane w celu usunięcia znacznika izotopowego i bakterii w trzech objętościach podłoża S. basal (patrz Protokół B); analiza GC/MS popłuczyn nie wykazała istotnego wzbogacenia izotopowego po trzecim płukaniu.

Rozcieranie nicieni pozwoliło uzyskać maksymalne wzbogacenie w metabolity pośrednie. W celu optymalizacji procentowego wzbogacenia w metabolity pośrednie przy podobnych warunkach traktowania, dokonano porównania próbek nicieni poddanych wyłącznie sonikacji oraz sonikacji połączonej z rozcieraniem. Rycina 3 wykazuje, że nicienie poddane sonikacji i rozcieraniu po ekspozycji na izotopy wykazywały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki poddane wyłącznie sonikacji. Dane te sugerują, że rozcieranie doprowadziło do rozbicia większej liczby frakcji podorganizmowych niż sonikacja. Kolejne badania wykazały, że samo rozcieranie, bez sonikacji, było wystarczające do osiągnięcia maksymalnego wzbogacenia izotopowego (dane nie przedstawiono).

Izotopowa ekspozycja całych nicieni umożliwia analizę strumienia pośrednich szlaków metabolicznych. Podawanie żywym nicieniom prekursorów stabilnych izotopów albo w trakcie rozwoju (PROTOKÓŁ A, Rysunek 4A), albo począwszy od stadium dorosłego (PROTOKÓŁ B, Rysunek 4B) pozwala na czułą analizę wzbogacenia izotopowego metabolitów wskazujących na strumień poprzez glikolizę (mleczan, alanina), metabolizm pirogronianu (alanina) oraz cykl kwasów trójkarboksylowych (cytrynian, jabłczan, bursztynian, asparaginian, glutaminian i glutamina). Uniwersalnie znakowana glukoza ¹³C zapewnia skuteczne znakowanie wszystkich gatunków węgla, podczas gdy zastosowanie 1,6-¹³C₂-glukozy pozwala na skuteczne znakowanie jedynie gatunków +1 każdego metabolitu. Technika ta pozwala czule rozpoznać różnice w pośrednim strumieniu metabolicznym między nicieniami typu dzikiego a szczepami z mutantami łańcucha oddechowego mitochondriów, takimi jak mutant podjednostki łańcucha oddechowego mitochondriów kompleksu III isp-1(qm150). Rysunek 5 ilustruje wielkość różnic zaobserwowanych w bezwzględnym znakowaniu pomiędzy nicieniami isp-1(qm150) i N2, z których każdy był eksponowany przez 24 godziny na 1,6-¹³C₂-glukozę w kulturze płynnej z bakteriami E. coli K12 od pierwszego dnia stadium młodych dorosłych składających jaja (Protokół B). Trwają dodatkowe badania izotopowe na szeregu mutantów mitochondrialnych nicieni.

Rysunek 1. Uniwersalnie znakowany ¹³Stabilny izotop glukozy znakowany węglem został dobrze włączony do organizmów młodych dorosłych nicieni. ¹³Tlenek węgla₂:¹²Tlenek węgla (IV)₂ stosunek (skorygowany procent nadmiaru atomów (APE)) w nicieniach typu dzikiego (N2) po dwóch godzinach podawania uniwersalnie znakowanego ¹³glukoza C oraz bakterie OP50 – martwe (utrwalone promieniami UV) lub żywe – na płytkach (PROTOKÓŁ C1). ¹³Inkorporacja C do metabolitów nicieni była wyraźna po dwóch godzinach ekspozycji na izotop. Niebieskie i czerwone słupki wskazują względne wzbogacenie izotopowe w fazie gazowej („atmosferyczne CO₂") i fazę ciekłą ("worm CO₂"), odpowiednio.

Rycina 2. Przedłużona ekspozycja na izotop od wczesnego okresu larwalnego, a następnie „oczyszczanie” nicieni na szalkach z agarem NGM bez bakterii, zwiększyło wzbogacenie izotopowe wolnego glutaminianu u młodych dorosłych nicieni. Wzbogacenie izotopowe w gatunkach glutaminianu przedstawiono dla nicieni hodowanych na płytkach z agarem NGM z uniwersalnie znakowanym-¹³glukoza C oraz bakterie OP50 albo przez cały okres rozwoju od stadium larwalnego L1 do stadium młodego dorosłego z 959 komórkami („L1”, patrz PROTOKÓŁ A), albo przez czterdzieści osiem godzin, począwszy od momentu, gdy nicienie osiągnęły pierwszy dzień stadium młodego dorosłego znoszącego jaja („YA”). Oś X wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu. Oś Y wskazuje procent wzbogacenia (skorygowane atomy na nadmiar (APE)). Zielone słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji na izotop poprzez podawanie bakterii OP50 E. coli bez izotopu na płytkach NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare słupki wskazują nicienie oczyszczone po ekspozycji na izotop na płytkach NGM bez bakterii lub izotopu odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA.

Rysunek 3. Rozdrabnianie nicieni w celu ich zniszczenia zapewnia maksymalne wzbogacenie izotopowe w pośrednich metabolitach nicieniProcent wzbogacenia w węgiel zmierzony w gatunkach cytrynianu z jednym znakowaniem (+1) w nicieniach typu dzikiego, inkubowanych przez 24 godziny w kulturze płynnej z 1,6-¹³C₂-glukozy bez bakterii (PROTOKÓŁ B). Słupki czarne i szare oznaczają kolejno nicienie poddane wyłącznie sonikacji lub sonikacji i rozcieraniu. Wzbogacenie izotopowe po ekspozycji na 1,6-¹³C₂–glukoza jest najlepiej oceniana w przypadku metabolitów znakowanych jednym atomem węgla. W przeciwieństwie do tego, znakowanie jest wzbogacone we wszystkich gatunkach każdego metabolitu w przypadku zastosowania glukozy znakowanej uniwersalnie.¹³Wykorzystywana jest C-glukoza.

Rycina 4. Reprezentatywne wyniki obrazujące stopień wzbogacenia izotopowego w pośrednich metabolitach robaków, wskazujące na przepływ przez glikolizę, metabolizm pirogronianu oraz cykl kwasu trójkarboksylowego. Skorygowany procent nadmiaru atomów (APE) określono u młodych dorosłych nicieni typu dzikiego (N2 Bristol) po 1,6-¹³C₂– ekspozycja na glukozę albo (A) podczas rozwoju od stadium L1 na szalkach (PROTOKÓŁ A), albo (B) rozpoczynająca się w pierwszym dniu składania jaj u młodych dorosłych przez 24 godziny w kulturze płynnej (PROTOKÓŁ B). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe w przypadkach, gdy dostępne były wiarygodne dane izotopowe z trzech powtórzeń biologicznych.

Rysunek 5. Bezwzględne oznaczanie ilościowe metabolitów aminokwasowych w szczepach nicieni typu dzikiego i mutantów mitochondrialnychWartość bezwzględną dla każdego z czterech aminokwasów obliczono poprzez pomnożenie stężenia wolnych aminokwasów oznaczonego metodą HPLC (nmol/mg białka nicienia) przez skorygowany procentowy nadmiar atomów (APE) dla każdego gatunku. Szare i czarne słupki oznaczają szczepy typu dzikiego (N2 Bristol) oraz szczepy z mutacją podjednostki kompleksu III mitochondriów (isp-1(qm150)), odpowiednio. Słupki reprezentują średnią z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego szczepu.

Dyskusja

Zastosowanie spektrometrii mas do pomiaru zawartości izotopowej w metabolitach pośrednich pozwala na uzyskanie niezwykle szczegółowego obrazu krytycznych zmian biochemicznych⁵. W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły wykorzystania tej wysokoczułej i specyficznej metodologii do oceny przepływu metabolitów pośrednich u genetycznie wszechstronnego zwierzęcia modelowego, C. elegans. Karmienie żywych zwierząt prekursorami metabolicznymi znakowanymi stabilnymi izotopami (takimi jak ¹³C-glukoza) umożliwia uzyskanie nowej wiedzy na temat przepływu w pośrednich szlakach metabolicznych poprzez pomiar wzbogacenia izotopowego w metabolitach pochodnych. Opracowaliśmy niezawodną metodologię pozwalającą na rzetelną analizę przepływu w glikolizie, metabolizmie pirogronianu oraz cyklu kwasu trójkarboksylowego. Można to osiągnąć zarówno u zwierząt karmionych stabilnymi izotopami od wczesnych stadiów larwalnego rozwoju, jak i począwszy od pomitotycznego okresu dorosłości. Wzbogacenie izotopowe różnych gatunków metabolitów można badać w połączeniu z profilowaniem wolnych aminokwasów z całych nicieni za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak opisano wcześniej⁴, aby określić bezwzględne wzbogacenie izotopowe różnych gatunków wolnej alaniny, asparaginianu, glutaminianu i glutaminy w organizmie nicienia. Spójne wzorce wzbogacenia izotopowego uzyskuje się podczas pomiaru analitów aminokwasów i kwasów organicznych w alikwotach od 1 000 do 2 000 młodych, synchronicznych dorosłych nicieni. Taka metodologia pozwala na czułe rozróżnienie nieprawidłowego przepływu pośredniego w szczepach mutantów mitochondrialnych z mutacjami w genach jądrowych w stosunku do nicieni typu dzikiego.

Technika ta jest cenna w badaniu zmian strumienia w konkretnych szlakach biochemicznych istotnych dla powszechnych wrodzonych błędów metabolizmu. W szczególności wykorzystanie glukozy znakowanej stabilnym izotopem dostarcza informacji o strumieniu węgla przez centralne szlaki metaboliczne istotne dla chorób mitochondrialnych. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że zastosowanie tej metodologii pozwala na czułe odróżnienie nieprawidłowego strumienia produktów pośrednich w szczepie mutanta podjednostki kompleksu III mitochondriów opartego na genie jądrowym (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego.

Należy pamiętać, że ponieważ ekspozycja na izotopy trwa od jednego do kilku dni, ilościowo określone wzbogacenie izotopowe reprezentuje wartość wzbogacenia w „stanie stacjonarnym”, a nie mierzalny strumień w określonym przedziale czasu, jaki można by wyznaczyć w modelach komórkowych eksponowanych na izotop przez okres od kilku minut do kilku godzin. Inne potencjalne ograniczenie badania strumienia szlaków metabolicznych w trakcie rozwoju nicieni wiąże się z różną długością rozwoju larwalnego w konkretnych szczepach mutantów. Na przykład wiadomo, że wiele poważnych mutacji mitochondrialnych powoduje zatrzymanie rozwoju na trzecim stadium (L3) larwy⁶. Zatem analiza wbudowania izotopu wyłącznie u zwierząt, które dożyły wieku dorosłego, może nie być reprezentatywna dla całej populacji mutantów. Metodologia ta mogłaby jednak zostać dostosowana do oceny wbudowania izotopowego w metabolitach pośrednich na konkretnym etapie larwalnym (np. L2), zamiast oczekiwania, aż zwierzęta osiągną stadium dorosłe. Podobnie, zwierzęta, które wchodzą w alternatywne stadium larwalne znane jako dauer, prawdopodobnie wykazują znacznie zmieniony (prawdopodobnie niższy) strumień metaboliczny w porównaniu ze zwierzętami, które przechodzą bezpośrednio przez cztery stadia larwalne. W przyszłości można przeprowadzić badania w celu bezpośredniej oceny wbudowania izotopowego u zwierząt w stadium dauer o różnych podłożach genetycznych. Ekspozycja zwierząt na trwały izotop przez określony czas (tutaj od 24 do 48 godzin), rozpoczynająca się w momencie osiągnięcia przez zwierzęta stadium młodego dorosłego (zgodnie ze szczegółami w Protokole B), eliminuje wpływ zmiennych okresów rozwojowych. Podczas gdy ¹³C-glukoza pozwala badać jedynie glikolizę, metabolizm pirogronianu i strumień cyklu kwasów trójkarboksylowych, potencjalnie można zastosować inne znaczniki izotopowe do badania strumienia szlaków biochemicznych w innych interesujących obszarach u nicieni. Na przykład ¹⁵N-glicyna mogłaby zostać wykorzystana do oceny obrotu aminokwasów u nicieni.

Kolejnym potencjalnym ograniczeniem tego podejścia jest poziom czułości detekcji metabolitów. Nasze doświadczenia sugerują, że do skutecznego ilościowego oznaczenia wbudowania izotopowego za pomocą zastosowanych tutaj metod HPLC oraz GC/MS wymagane jest minimum 500 młodych dorosłych nicieni. Zastosowanie instrumentów o większej czułości, takich jak ultrawydajna chromatografia cieczowa (UPLC), może pozwolić na dalszą redukcję liczby badanych zwierząt, choć przewidujemy, że jest mało prawdopodobne, aby umożliwiło to wiarygodne oznaczanie ilościowe metabolitów i wbudowania izotopowego w poszczególne gatunki metabolitów w przypadku pojedynczych osobników. Badaliśmy populacje nicieni obejmujące 1 000 zwierząt na eksperyment, co w naszym odczuciu pozwalało na wiarygodną detekcję metabolitów o niskiej zawartości w każdym szczepie. Jednak niektóre metabolity, takie jak GABA, mogą być wiarygodnie oznaczone ilościowo jedynie w znacznie większych populacjach nicieni, rzędu 1x10⁶ zwierząt⁴.

Podsumowując, profilowanie izotopów stabilnych stanowi nieinwazyjne i bezpieczne (niereaktywne radiologicznie) podejście, które od dawna jest wykorzystywane do badania wrodzonych błędów metabolizmu. Zastosowanie tej metodologii w odniesieniu do C. elegans umożliwia nowatorskie badanie in vivo i w czasie rzeczywistym zmian metabolicznych zachodzących w całym organizmie zwierzęcia, które mogą wynikać z poszczególnych zaburzeń genetycznych i/lub ekspozycji na środki farmakologiczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S. basal		1 - strona 59	Protokoły A i B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protokół B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protokoły A i C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protokół B
Agar NGM	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protokoły A, B i C
13C glukoza (uniwersalnie znakowana)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protokoły A i C
13C glukoza (znakowana w pozycjach 1,6)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protokół B
60% kwas perchlorowy (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protokoły A i B
ε-kwas aminokapronowy (standard wewnętrzny)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protokoły A i B
MTBSTFA	Regis	270243	Protokół E
Acetonitryl	Regis	270010	Protokół E
Żywica AG 1-X8, 100-200, w formie chlorkowej	Bio-Rad	140-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja kwasów organicznych)
Żywica AG 50W-X8, 100-200, w formie wodorowej	Bio-Rad	142-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja aminokwasów)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protokół C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protokół C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół A
0,1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protokół D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protokoły A i B
Woda dejonizowana	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protokół D
Hel	Airgas	24001364	Protokół C2
Stereomikroskop SMZ-800 Zoom	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protokoły A, B i C
Miernik pH	Fisher Scientific	S68167	Protokoły A i B
Wirówka stołowa - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protokoły A i B
Inkubowany wstrząsacz platformowy	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protokół B
Rotator Mini LabRoller	Labnet International	H-5500	Protokoły A i B
Tłuczki	Kontes Corp	K749520-0090	Protokoły A i B
Wiertarka	Kontes Corp	K749540-0000	Protokoły A i B
Zlewka szklana 1 L	Fisher Scientific	02-539P
Kolby Erlenmeyera 1 L	VWR international	89000-368
Kolby Erlenmeyera 25 mL	VWR international	89000-356	Protokół B
Szklane probówki okrągłodenne 7 ml + gumowy korek	VWR international	VT6431	Protokoły A, B oraz C1, C2
Szklane probówki okrągłodenne 10 ml + gumowy korek	VWR international	VT6430	Protokół C2
Probówki z niebieską zakrętką	Labco	438B
Stożkowe plastikowe probówki 50 ml	Falcon BD	14-959-49A	Wszystkie protokoły
Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml	Fisher Scientific	02-681-320	Protokoły A i B
Strzykawki (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protokoły C1 i C2
Igły 25 G	Fisher Scientific	22-253-131	Protokoły C1 i C2
Kolumny chromatograficzne Poly-Prep	Bio-Rad	731-1550	Protokół D
Pipety Pasteura	VWR international	14673-043	Protokół D
Szalki Petriego 60 mm	VWR international	25373-085	Protokół C
Komora szklana (odcięte dno kolby 1 L) wyposażona w uszczelniony smarem kurek trójdrożny	Wykonanie na zamówienie		Protokół C
Optycznie przezroczysta płyta szklana	Wykonanie na zamówienie		Protokół C
Odparowacz Reacti-Vap III	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protokół D
Wata	VWR international	14224-516	Protokół D
Smar do wysokiej próżni	Dow Corning	1597418	Protokół C1
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	01-213-18	Protokół B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protokół C
Spektrometr mas z pomiarem stosunku gazów	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protokół D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protokół D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protokół D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protokół D