Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego strumienia metabolicznego w stadium rozwijającym się i dorosłym Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Stabilne profilowanie izotopowe za pomocą chromatografii gazowej, analiza spektrometryczna pośredniego strumienia metabolicznego jest opisana w nicieniu, Caenorhabditis elegans. Szczegółowo opisano metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenek węgla, kwasy organiczne i aminokwasy po ekspozycji na izotopy podczas rozwoju na płytkach agarowych lub w okresie dorosłości w kulturze płynnej.

Streszczenie

Stabilne profilowanie izotopowe od dawna pozwala na prowadzenie wrażliwych badań nad metabolicznymi konsekwencjami mutacji genetycznych i/lub terapii farmakologicznych w modelach komórkowych i ssakach. W tym miejscu opisano szczegółowe metody wykonywania stabilnego profilowania izotopowego pośredniego metabolizmu i strumienia metabolicznego u nicienia Caenorhabditis elegans. Opisano metody profilowania całych aminokwasów wolnych od robaków, znakowanych dwutlenkiem węgla, znakowanymi kwasami organicznymi i znakowanymi aminokwasami u zwierząt narażonych na działanie stabilnych izotopów albo od wczesnego rozwoju na płytkach agarowych pożywek wzrostowych nicieni, albo począwszy od młodych dorosłych, podczas ekspozycji na różne zabiegi farmakologiczne w płynnej kulturze. Wolne aminokwasy określa się ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w całych podwielokrotnościach robaków ekstrahowanych w 4% kwasie nadchlorowym. Uniwersalnie znakowana ¹³C-glukoza lub 1,6-13 C_2-glukoza jest wykorzystywana jako stabilny prekursor izotopowy, którego znakowany węgiel jest śledzony za pomocą spektrometrii mas w dwutlenku węgla (zarówno atmosferycznym, jak i rozpuszczonym), a także w metabolitach wskazujących na przepływ przez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasów trikarboksylowych. Uwzględniono reprezentatywne wyniki w celu wykazania wpływu czasu ekspozycji na izotopy, różnych protokołów usuwania bakterii i alternatywnych metod rozbijania robaków u nicieni typu dzikiego, a także względnego zakresu inkorporacji izotopowej w zmutowanych robakach mitochondrialnego kompleksu III (isp-1(qm150)) w stosunku do robaków typu dzikiego. Zastosowanie stabilnego profilowania izotopowego u żywych nicieni zapewnia nowe możliwości badania na poziomie całego zwierzęcia zmian metabolicznych w czasie rzeczywistym, które są spowodowane poszczególnymi zaburzeniami genetycznymi i/lub terapiami farmakologicznymi.

Protokół

Protokół A: Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego metabolizmu podczas rozwoju C. elegans na płytkach NGM.

*Uwaga: Wzbogacenie stabilnych izotopów może być z powodzeniem mierzone w populacjach młodych dorosłych nicieni po ekspozycji na izotopy (z powszechnie znakowaną ^{glukozą 13}C lub 1,6-13 C 2-glukozą) począwszy od wczesnego rozwoju lub wczesnej dorosłości. Protokół ten ułatwia jednoczesne monitorowanie zdrowia, rozwoju i wzrostu zwierząt na standardowych płytkach pożywek hodowlanych (NGM), co nie jest tak łatwe do osiągnięcia w hodowlach płynnych.

1. Przygotować 100-milimetrowe szalki Petriego z 10 ml pożywki do hodowli nicieni (NGM), zgodnie ze standardową techniką. ¹
2. Rozsmarować płytki NGM OP50 E. coli ¹ i pozostawić do wyschnięcia na noc.
3. Równomiernie dodać 500 μl 200 mM 1,6-13 C₂ glukozy (aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM na płytce NGM) równomiernie na płytkę. Pozostawić do wyschnięcia na noc.
4. Wybielacz gravid dorosłe robaki ¹. Płytki odzyskane jaja na płytkach NGM bez bakterii i 1,6-13 C₂ glukozy. Inkubować w temperaturze 20°C przez noc.
5. Następnego dnia wykluły się larwy zatrzymane w L1 na płytki NGM, wcześniej rozprzestrzenione z 1,6-13 C_2-glukozą i OP50 E. coli (zgodnie z krokiem #2, powyżej). Hoduj robaki do stadium młodego dorosłego (48-72 godziny, w zależności od odmiany), uważając, aby robaki nie głodowały.
6. Zbierz synchroniczne, młode dorosłe robaki pierwszego dnia z płytek z 3-4 ml S. Basal.
7. Umyj robaki w 50 ml S. Basal w 50 ml probówek Falcon. Pozwól robakom granulować grawitacyjnie przez 5 minut. Usunąć supernatant do ~5 ml. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
8. Oszacuj liczbę robaków, licząc trzy podwielokrotności po 100 μl². Dostosuj stężenie robaków do 1000 robaków/ml S. basal.
9. Odpipetować 1 ml (1000 robaków) do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
10. Dodać 69 μl 60% PCA zawierającego wzorzec wewnętrzny (kwas ε-aminokapronowy) do końcowego stężenia 4% PCA i 200 μmol wzorca wewnętrznego.
11. Niech robaki osiądą grawitacyjnie x 5 minut. Usunąć supernatant i zapisać go w innej probówce.
12. Miel próbki robaków za pomocą plastikowego homogenizatora (Kontes Pellet Pestle) i wiertarki z napędem silnikowym (Kontes Pellet Pestle Cordless Motor) przez 15 sekund. Wizualnie potwierdź rozerwanie robaków za pomocą mikroskopii świetlnej. W razie potrzeby czynność powtórzyć.
13. Przenieść supernatant z kroku #11 do połączenia z homogenatem z kroku #12.
14. Odwirować próbkę z prędkością 2250 obr./min (1300 x g) przez 5 minut.
15. Przenieść supernatant do świeżej szklanej probówki o pojemności 7 ml. Zachowaj osad do oznaczenia stężenia białka, jak opisano w kroku #20 poniżej.
16. Próbki pH do zakresu 7-8 (neutralny) przy użyciu 4N KOH.
17. Odwirować zobojętnione próbki w szklanej probówce o pojemności 7 ml przy prędkości 2250 obr./min (1300 x g) przez 5 minut w celu usunięcia soli.
18. Przenieść supernatant do świeżej szklanej probówki o pojemności 7 ml.
19. Przygotować zobojętnione próbki do ilościowego oznaczania metabolitów poprzez:
    1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC): Oddzielić 50 μl zobojętnionej próbki do bezpośredniego wstrzyknięcia do HPLC. Kwantyfikacja wolnych aminokwasów jest przeprowadzana za pomocą HPLC (Varian) przy użyciu derywatyzacji przedkolumnowej z aldehydem o-ftalowym i detekcją fluorescencyjną, jak opisano wcześniej^3-4.
    2. Chromatografia gazowa/spektrometria mas (GC/MS): Kontynuować ekstrakcję pozostałych zobojętnionych próbek przy użyciu żywicy jonowymiennej (Bio-Rad) do oznaczania GC/MS wzbogacenia izotopowego w aminokwasy i kwasy organiczne, jak wyszczególniono w PROTOKOLE D.
20. Dodaj 1 ml 1N NaOH do pozostałego osadu białkowego (z kroku #15) w szklanej probówce o pojemności 7 ml.
21. Próbkę białka poddanego działaniu NaOH inkubować w temperaturze pokojowej, obracając (Labnet* LabRoller Rotator) przez noc, aż do rozpuszczenia.
22. Użyj 75-100 μl białka poddanego działaniu NaOH, aby określić stężenie białka standardowymi metodami (DC Protein Assay, Bio-rad).

Protokół B. Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego metabolizmu u młodych dorosłych C. elegans w płynnej kulturze.

*UWAGA: Efekty farmakologiczne na pośredni przepływ metaboliczny u dorosłych nicieni mogą być badane po ekspozycji izotopowej rozpoczynającej się pierwszego dnia składania jaj na płytkach NGM (patrz Protokół A, powyżej) lub w płynnej hodowli. Preferujemy to drugie podejście, aby zmaksymalizować efektywność kosztową wykorzystania stabilnych izotopów i środków farmakologicznych.

1. Rozcieńczyć synchroniczne, składające jaja młode osobniki dorosłe pierwszego dnia w S. basal zawierające 0,0005% cholesterolu (otrzymanego przez dodanie 0,5 ml 1% cholesterolu (rozpuszczonego w 95% etanolu) do 1 litra S. Basal) do 2000 zwierząt na 500 μL.
2. Ustawić ~ 4 ml kultury (kultury) o całkowitej objętości w kolbach Erlenmeyera o pojemności 25 ml w następujący sposób: leczenie: żaden "LEK A" S. Podstawowy z cholesterolem 3020 μL 3020 uL - objętość "Lek A" Stabilny izotop (1,6-13 C_2-glukoza) 80 μL 80 μL K12 E. coli (OD₆₆₀ 2,5 do 3) 400 μL 400 μL Robaki młodych dorosłych (2,000) 500 μL 500 μL Lek A (pożądane stężenie) - Zgodnie z życzeniem
3. Przykryj kolby folią. Wytrząsać kolby przez 24 godziny z prędkością 220 obr./min w inkubowanej wytrząsarce platformowej o temperaturze 20 °C.
4. Upewnij się, że kolby nie są całkowicie szczelne, ponieważ tlen jest niezbędny do pośredniego przepływu metabolicznego i do wynikającego z niego znakowania endogennych metabolitów nicieni.
5. Umyj robaki, dodając 4 ml objętości kultury do 46 ml S. basal w stożkowej plastikowej probówce o pojemności 50 ml. Pozwól robakom granulować grawitacyjnie przez 5 minut. Pozostaje supernatant do ssania próżniowego do ~ 5 ml. Powtórz mycie, napełniając probówkę jeszcze dwa razy do 50 ml S. basal.
6. Skoncentrować umyte robaki do 1000 robaków/ml w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
7. Dodać 69 μl 60% kwasu nadchlorowego (PCA) i 2 μl 10 μM wzorca wewnętrznego (kwas ε-aminokapronowy), aby uzyskać końcowe stężenie 200 μmol wzorca wewnętrznego i 4% PCA.
8. Przygotuj próbki zgodnie z krokami #11-22 w PROTOKOLE A.

PROTOKÓŁ C-1. Monitorowanie wykorzystania izotopów u dorosłych robaków na płytkach poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferze i rozpuszczonym dwutlenku węgla.

*UWAGA: Podczas gdy PROTOKOŁY A i B szczegółowo opisują metody monitorowania wprowadzania izotopów do wolnych metabolitów u robaków odpowiednio w ciągu 2-3 dni rozwoju lub 1 dnia dorosłego życia, ogólne potwierdzenie sukcesu i kinetyki inkorporacji izotopowej w krótkim czasie (tj. minut do godzin) można uzyskać poprzez etykietę monitorowania atmosferycznego dwutlenku węgla (CO₂) uwalniane przez robaki lub zawarte w rozpuszczonym dwutlenku węgla w ekstrakcie z robaków. Żywe lub zabite bakterie mogą być karmione robakami, gdy są hodowane na płytkach (PROTOKÓŁ C-1). Bakterie nie są konieczne do krótkotrwałej ekspozycji na izotopy robaków w płynnej kulturze (PROTOKÓŁ C-2).

1. Przygotuj 100 mm szalki Petriego z 10 ml agaru NGM. Rozprowadź płytki NGM żywymi lub zabitymi promieniami UV OP50 E. coli (jak pokazano na rysunku 1). Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
2. Dodać 500 μl 200 mM 1,6-znakowanej ^1,6_{C 2-glukozy} do płytek NGM rozprowadzanych OP50 (dla końcowego stężenia izotopów 10 mM na płytce NGM). Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
3. Uzyskać synchroniczne, składające jaja, młode dorosłe robaki wyhodowane na płytkach agarowych NGM rozsmarowane tylko z OP50 E. coli.
4. Przenieś 1000 młodych dorosłych robaków na eksperymentalne płytki agarowe NGM zawierające stabilny izotop i E. coli (przygotowane zgodnie z krokami #1-2 powyżej).
5. Umieść eksperymentalną płytkę NGM (bez pokrywy) w niestandardowej szklanej komorze wyposażonej w dobrze uszczelniony 3-drogowy zawór odcinający, aby umożliwić precyzyjne pobieranie próbek atmosfery i wymianę go. Natychmiast uszczelnij komory optycznie przezroczystą szklaną tarczą. Zakryj szew, w którym szklany dysk znajduje się na płycie, smarem o wysokiej próżni w celu uszczelnienia. Zapisz czas jako "Czas 0".
6. Pobrać próbkę 10 ml atmosfery ze szklanej komory za pomocą 3-kierunkowego zaworu odcinającego za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml po 30, 60, 90 i 120 minutach. Przenieść każdą próbkę atmosferyczną do wstępnie przygotowanej szklanej probówki o pojemności 10 ml z gumowym korkiem, zawierającej 1 ml 1 mM NaHCO₃ w 0,1 N NaOH, która została zamknięta próżniowo.
7. Wstrzyknąć 10 ml powietrza z powrotem do każdej szklanej komory przez 3-kierunkowy kran za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml. Zamknąć zawór odcinający do komory po pobraniu próbek/ponownym wstrzyknięciu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji między punktami poboru.
8. Wstrzyknąć 100 μl 20% kwasu fosforowego przez korek do szklanej probówki o pojemności 10 ml z gumowym korkiem, zawierającej próbkę atmosferycznego_CO2
.
9. Usunąć 2 ml atmosfery i wstrzyknąć ją do 12 ml niebieskich probówek z automatycznym samplerem wstępnie napełnionych helem w celu pomiaru atmosferycznego CO₂ .
10. Analizuj "atmosferyczne próbki CO₂" za pomocą spektrometru mas o stosunku gazu (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Otwarte szklane komory po dwugodzinnym okresie inkubacji izotopów i pobraniu wszystkich próbek atmosferycznych.
12. Zmyj robaki z płytek NGM za pomocą 3 ml S. basal.
13. Umyj robaki w 50 ml S. podstawowy w 50 ml probówkach Falcon. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
14. Skoncentruj robaki do ~1000 robaków/ml w 7 ml szklanej probówce z okrągłym dnem.
15. Szklana rurka z uszczelnieniem próżniowym z gumowym korkiem.
16. Dodać 100 μl 20% kwasu fosforowego przez gumowy korek ze strzykawką, aby uwolnić rozpuszczony CO₂ .
17. Usunąć 2 ml atmosfery i wstrzyknąć do 12 ml niebieskich probówek z automatycznym samplerem wstępnie napełnionych helem w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂ .
18. Analizuj "rozpuszczone próbki CO₂ " za pomocą spektrometru mas o stosunku gazu (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Alternatywny protokół (C-2): Monitorowanie wykorzystania izotopów u dorosłych robaków w płynnej kulturze poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferze i rozpuszczonego dwutlenku węgla.

1. Uzyskaj synchroniczne, składające jaja, młode dorosłe robaki wyhodowane na płytkach agarowych NGM rozsmarowanych OP50 E. coli.
2. Umyj robaki w 50 ml S. basal w 50 ml probówkach Falcon. Pozwól robakom granulować grawitacyjnie przez 5 minut. Usunąć supernatant do ~5 ml. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
3. Przenieś 1000 młodych dorosłych robaków w 1 ml S. baseal do 10 ml szklanej probówki z okrągłym dnem. Dodać 10,1 μl 1 M zapasu uniwersalnie znakowanej ¹³C-glukozy do 1 ml robaków, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM.
4. Natlenić okrągłodenną szklaną rurkę zawierającą robaki i izotop poprzez wymianę atmosfery z przepływającym 100% tlenem w otwartej probówce przez 2 minuty. Natychmiast zamknij tubkę gumowym korkiem.
5. Wstrząsnąć probówkami doświadczalnymi w inkubowanej wytrząsarce platformowej o temperaturze 20°C z prędkością 220 obr./min. Zapisz czas rozpoczęcia jako "Czas 0".
6. Pobrać próbkę 5 ml atmosfery z okrągłodennej szklanej probówki o pojemności 10 ml za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25G przez gumowy korek po 30, 60, 90 i 120 minutach.
7. Przenieść każdą próbkę atmosferyczną do wstępnie przygotowanej, gumowej probówki szklanej o pojemności 10 ml z korkiem zawierającej 1 ml 1 ml NaHCO₃ w 0,1 N NaOH, która została zamknięta próżniowo.
8. Wstrzyknąć 5 ml powietrza z powrotem do każdej eksperymentalnej szklanej probówki z okrągłym dnem zawierającej robaki i izotop przez gumowy korek za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły o rozmiarze 25.
9. Wznowić inkubację eksperymentalnych okrągłodennych szklanych probówek o pojemności 10 ml zawierających robaki i izotop, wytrząsając je z prędkością 220 obr./min między punktami czasowymi.
10. Wstrzyknąć 100 μl 20% kwasu fosforowego przez korek do atmosfery zawierającej gumowy korek ze szklaną probówką o pojemności 10 ml.
11. Usunąć 2 ml atmosfery i wstrzyknąć do 12 ml niebieskich probówek z automatycznym samplerem wstępnie napełnionych helem w celu pomiaru atmosferycznego CO₂ .
12. Analizuj "atmosferyczne próbki CO₂" za pomocą spektrometru mas o stosunku gazu (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. Pod koniec okresu doświadczalnego umyj robaki w 50 ml S. baseal w 50 ml probówki Falcon. Pozwól, aby osad robaka utworzył się grawitacyjnie. Pozostaje supernatant do ssania próżniowego do ~ 5 ml. Powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy w 50 ml S. basal.
14. Skoncentruj robaki do ~1000 robaków/ml w szklanej probówce o okrągłym dnie o pojemności 7 ml. Dodaj gumowy korek i rurkę uszczelniającą próżniowo. Dodać 100 μl 20% kwasu fosforowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 25 przez gumowy korek, aby uwolnić rozpuszczony robak CO₂ .
15. Usunąć 2 ml atmosfery i wstrzyknąć do 12 ml niebieskich probówek z automatycznym samplerem wstępnie napełnionych helem w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂ .
16. Analizuj "rozpuszczone próbki CO₂ " za pomocą spektrometru mas o stosunku gazu (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protokół D. Przetwarzanie zneutralizowanych próbek z Protokołów A i B do analizy aminokwasów i kwasów organicznych za pomocą chromatografii gazowej/spektrometrii mas.

1. Przygotowanie koralików:
   1. Dodaj 1 N HCl do kulek Ag 1 i Ag 50 oddzielnie w zlewkach o pojemności 1 l.
   2. Mieszać każdą kolbę przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego.
   3. Umyj koraliki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH popłuczyn zrówna się z pH wody.
2. Przygotowanie kolumny:
   1. Włóż bawełnianą zatyczkę tuż nad najwęższą częścią końcówki pipety Pasteura.
   2. Dodaj naładowane kulki do każdej z dwóch kolumn na próbkę, wypełniając każdą do około jednej trzeciej wysokości kolumny. Użyj kulek AG1 do ekstrakcji kwasów organicznych. Użyj kulek AG50 do ekstrakcji aminokwasów.
3. Przykładowe przetwarzanie:
   1. Dodać 500 μl próbki do kolumny z naładowanymi kulkami AG1. Niczego nie dodaje się do próbki (patrz PROTOKÓŁ A, krok #19B) przed zastosowaniem do kolumny AG1 w celu ekstrakcji kwasów organicznych, jeśli próbka ma już pH o neutralnym pH.
   2. Dodać 1 ml 0,1 N HCL do pozostałej próbki przed zastosowaniem jej do kolumny AG50 w celu ekstrakcji aminokwasów.
   3. Pozwól, aby próbki całkowicie przeszły przez kolumny.
   4. Przemyć kolumnę wodą 10 razy, aż popłuczyny będą neutralne (zakres pH 7-8).
   5. Kolumny elutyczne do świeżych, oznakowanych szklanych fiolek na próbki o pojemności 4 ml:
      1. W przypadku ekstrakcji kwasem organicznym dodaj 3 ml 3 N HCl do kolumny AG1. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopów w całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla wśród gatunków 3-węglowych (mleczan), 4-węglowych (asparaginian, bursztynian, jabłczan), 5-węglowych (glutaminian) i 6-węglowych (cytrynian).
      2. Do ekstrakcji aminokwasów: dodać 3 ml 4 N NH₄OH do kolumny AG50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopów w całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla wśród 3-węglowych (alanina) i 5-węglowych (glutamina).
   6. Umieść fiolki z próbkami w parowniku Reacti-Vap III na noc, aż wyschną.

E. Pobieranie próbek i ustawienia maszyny dla spektrometrii mas

Dodaj 50 μL acetonitrylu i 50 μL n-metylo-t-butylodimetylosiliodtrifluoroacetamidu (MTBSTFA) do każdej fiolki z próbką. Przykryć, wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 60°C. Wstrzyknąć 1-2 μl na próbkę do chromatografii gazowej/spektrometru masowego (GC/MS).

F. Analiza wyników

1. Kwantyfikacja pików aminokwasów. Oznaczanie ilościowe każdego aminokwasu za pomocą analizy HPLC oblicza się przy użyciu powierzchni każdego piku w stosunku do powierzchni wzorca wewnętrznego.
2. Obliczanie wzbogacenia izotopowego. Stabilne wzbogacenie izotopowe oblicza się w programie Excel (Microsoft) dla każdego gatunku według następującego wzoru: Procent nadmiaru atomu, skorygowany (APE) = (R_{sa-R st})*100/[(R_{sa-R st})+100], gdzie R_sa - Stosunek próbki i R_st - Stosunek wzorca.
3. Ocena różnic statystycznych między wzbogaceniem próby. Test t Studenta służy do oceny istotności względnych różnic w znacznikach aminokwasów i izotopów między próbkami.

REPREZENTATYWNE WYNIKI:

Stabilny izotop jest dobrze wkomponowany w młode dorosłe robaki, o czym świadczy oznaczony węgiel mierzony w atmosferycznym CO₂ i rozpuszczony robak CO 2. U robaków karmionych żywymi lub napromieniowanymi promieniowaniem UV zabitych OP50 E. coli stosunek ¹³CO₂ do ¹²CO₂ był większy we frakcji CO₂ rozpuszczonego robaka w stosunku do uwolnionego atmosferycznego CO₂ (ryc. 1). Karmienie żywych lub zabitych robaków OP50 E. coli nie zmieniło znacząco zmierzonego stosunku ¹³CO₂ do ¹²CO₂ w przemytym ekstrakcie z robaków (patrz PROTOKÓŁ C1).

Długotrwała ekspozycja na stabilny izotop z wczesnego okresu larwalnego zwiększyła wzbogacenie izotopowe w pośrednie metabolity. Skorygowany procent atomów Nadmiar znakowanego węgla określony w pośrednich metabolitach młodych dorosłych robaków typu dzikiego był większy u wszystkich gatunków glutaminianu, gdy robaki były karmione uniwersalnie znakowaną ¹³C-glukozą i żywymi bakteriami przez cały okres rozwoju w porównaniu z podobnie traktowanymi zwierzętami karmionymi znakowanymi bakteriami przez 48 godzin dopiero po osiągnięciu dorosłego etapu składania jaj (Figura 2).

Wpływ czasu oczyszczania na wzbogacenie izotopowe. Niezależnie od przebiegu czasowego ekspozycji, wszystkie zwierzęta hodowane na płytkach zostały "oczyszczone" z oznakowania izotopowego przed dalszym przygotowaniem do analiz GC/MS. Porównano protokoły oczyszczania, jak pokazano na rysunku 2, w tym karmienie robaków przez 2 godziny na płytkach agarowych NGM rozsianych żywymi świeżymi bakteriami bez izotopu lub karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 godziny oraz karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. Niezależnie od przebiegu ekspozycji izotopowej, nie zaobserwowano istotnej różnicy we wzbogaceniu izotopowym w metabolity pośrednie z ekstraktu z całych robaków dla młodych dorosłych, gdy zwierzęta były oczyszczane na płytkach bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. W przeciwieństwie do tego, mniejsze wzbogacenie izotopowe zaobserwowano w metabolitach pośrednich, gdy zwierzęta zostały następnie "oczyszczone" z nadmiaru izotopu poprzez karmienie się nieznakowanymi bakteriami przez dwie godziny. Jednak zwiększone wzbogacenie w gatunki +3, +4 i +5 było widoczne, gdy robaki były wystawione na działanie izotopu z wczesnego okresu larwalnego. W związku z tym określono optymalny protokół oczyszczania jako usuwanie robaków po ich inkubacji na płytkach NGM rozprzestrzeniających się ze stabilnym izotopem i bakteriami poprzez późniejszą inkubację przez 2 godziny na nierozsianych płytkach NGM. Warto zauważyć, że robaki wyhodowane w płynnej kulturze zostały wypłukane z oznaczenia izotopowego i bakterii w trzech tomach S. basal (patrz Protokół B); Analiza GC/MS popłuczyn nie wykazała istotnego wzbogacenia izotopowego przy trzecim płukaniu.

Mielenie robaków przyniosło maksymalne wzbogacenie w pośrednie metabolity. Aby zoptymalizować procentowe wzbogacenie w metabolity pośrednie w podobnych warunkach obróbki, porównano próbki robaków zakłócone przez samą sonikację lub sonikację z mieleniem. Rysunek 3 pokazuje, że robaki zakłócone w wyniku ekspozycji na izotop przez sonikację i mielenie miały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki zakłócone tylko przez sonikację. Dane te sugerują, że więcej frakcji suborganizmów zostało zakłóconych przez mielenie niż przez sonikację. Późniejsze badania wykazały, że samo mielenie bez sonikacji było wystarczające do osiągnięcia maksymalnego wzbogacenia izotopowego (dane nie pokazane).

Ekspozycja na cały izotopowy robak pozwala na analizę pośredniego przepływu szlaku metabolicznego. Karmienie żywych robaków stabilnym prekursorem izotopowym zarówno podczas rozwoju (PROTOKÓŁ A, ryc. 4A), jak i na początku u dorosłych zwierząt (PROTOKÓŁ B, ryc. 4B) pozwala na czułą analizę wzbogacenia izotopowego wśród metabolitów wskazujących na przepływ przez glikolizę (mleczan, alanina), metabolizm pirogronianu (alanina) i cykl kwasów trikarboksylowych (cytrynian, jabłczan, bursztynian, asparaginian, glutaminian i glutamina). Uniwersalnie znakowana ¹³C-glukoza zapewnia solidne znakowanie wszystkich form węgla, podczas gdy wykorzystanie 1,6-13 C 2-glukozy pozwala na solidne znakowanie tylko w +1 gatunku każdego metabolitu. Technika ta pozwala z wyczuciem dostrzec różnice w pośrednim strumieniu metabolicznym robaków typu dzikiego między zmutowanymi szczepami mitochondrialnego łańcucha oddechowego, takimi jak zmutowana podjednostka mitochondrialnego łańcucha oddechowego kompleksu III isp-1 (qm150). Rycina 5 ilustruje wielkość różnic obserwowanych w znaczniku bezwzględnym między robakami isp-1 (qm150) i N2, z których każdy jest wystawiony na 24 godziny na działanie 1,6-13_{C 2-glukozy} w płynnej hodowli z bakteriami K12 E. coli od pierwszego dnia etapu składania jaj przez młode dorosłe osobniki (Protokół B). Prowadzone są dodatkowe badania nad stabilnymi izotopami na szeregu mitochondrialnych zmutowanych robaków.

Rysunek 1. Powszechnie znakowany stabilny izotop ¹³C-glukozy był dobrze wkomponowany w młode dorosłe robaki. ¹³Stosunek CO₂:¹²CO₂ (procent nadmiaru atomów (APE), skorygowany) u robaków typu dzikiego (N2) po dwóch godzinach karmienia na płytkach powszechnie znakowanych ¹³C-glukozy i zabitych promieniami UV lub żywych bakterii OP50 (PROTOKÓŁ C1). ¹³Włączenie C do metabolitów robaków było silne po dwóch godzinach ekspozycji na izotopy. Niebieskie i czerwone paski wskazują względne wzbogacenie izotopowe odpowiednio w fazie gazowej ("atmosferyczny CO₂ ") i ciekłej ("robak CO₂ ").

Rysunek 2. Przedłużona ekspozycja na izotopy od wczesnego okresu larwalnego, a następnie "usuwanie" robaków na płytkach agarowych NGM bez bakterii, zwiększyło wzbogacenie izotopowe w wolny glutaminian młodych dorosłych robaków. Wzbogacenie izotopowe w gatunki glutaminianu wykazano dla robaków karmionych na płytkach agarowych NGM z powszechnie znakowanymi bakteriami C-glukozy i OP50 pod uniwersalnym oznaczeniem ¹³C-glukozy i OP50 albo przez cały okres rozwoju od stadium larwalnego L1 do stadium młodego dorosłego 959 komórek ("L1", patrz PROTOKÓŁ A), lub przez czterdzieści osiem godzin, począwszy od momentu, gdy robaki osiągnęły pierwszy dzień stadium składania jaj przez młode dorosłe osobniki ("YA"). Oś X wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu. Oś Y wskazuje procentowe wzbogacenie (skorygowane atomy na nadmiar (APE)). Zielone paski wskazują robaki usunięte po ekspozycji na izotop poprzez podawanie OP50 E. coli bez izotopu na płytki NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare paski wskazują robaki usunięte po ekspozycji na izotop na płytkach NGM bez bakterii lub izotopu odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA.

Rysunek 3. Rozbijanie robaków przez mielenie zapewnia maksymalne wzbogacenie izotopowe w pośrednie metabolity robaków. Procent wzbogacenia w węgiel mierzony w gatunkach cytrynianu +1 u robaków typu dzikiego traktowanych przez 24 godziny w płynnej kulturze z 1,6-13 C_2-glukozą bez bakterii (PROTOKÓŁ B). Czarne i szare paski oznaczają robaki, które zostały zakłócone przez samą sonikację lub odpowiednio przez sonikację i mielenie. Wzbogacenie izotopowe po ekspozycji na 1,6-13 C_2-glukozę najlepiej ocenia się w metabolitach znakowanych na jednym węglu. W przeciwieństwie do tego, znakowanie jest wzbogacone we wszystkie gatunki każdego metabolitu, gdy stosuje się uniwersalnie znakowaną ¹³C-glukozę.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki ilustrują stopień wzbogacenia izotopowego w pośrednie metabolity robaków wskazujące na przepływ przez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasów trikarboksylowych. Skorygowany procent atomów (APE) określono u młodych dorosłych robaków typu dzikiego (N2 Bristol) po ekspozycji na 1,6-13 C_2-glukozę albo (A) podczas rozwoju od stadium L1 na płytkach (PROTOKÓŁ A), albo (B) rozpoczynając się w pierwszym dniu składania jaj jako młode dorosłe przez 24 godziny w płynnej kulturze (PROTOKÓŁ B). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe w przypadku, gdy dostępne były wiarygodne dane izotopowe z trzech kontrprób biologicznych.

Rysunek 5. Bezwzględna ocena ilościowa aminokwasów w gatunkach metabolitów aminokwasów w zmutowanych szczepach robaków typu dzikiego i mitochondrialnego. Bezwzględne oznaczenie czterech aminokwasów w każdym gatunku obliczono, mnożąc stężenie wolnych aminokwasów określone przez HPLC (nmol/mg białka robaka) przez skorygowany procent nadmiaru atomów (APE) dla każdego gatunku. Szare i czarne paski oznaczają odpowiednio zmutowane szczepy typu dzikiego (N2 Bristol) i mitochondrialnego kompleksu III podjednostek (isp-1(qm150)). Słupki wskazują średnią z trzech eksperymentów z powtórzonymi próbami biologicznymi na szczep.

Dyskusja

Zastosowanie spektrometrii mas do pomiaru obfitości izotopów w metabolitach pośrednich daje niezwykle szczegółowy obraz krytycznych zmian biochemicznych⁵. W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły wykorzystania tej wysoce czułej i specyficznej metodologii do oceny pośredniego przepływu metabolicznego u genetycznie wszechstronnego zwierzęcia modelowego, C. elegans. Rzeczywiście, karmienie żywych zwierząt prekursorami metabolicznymi znakowanymi stabilnymi izotopami (takimi jak ¹³C-glukoza) pozwala na nowy wgląd w pośredni przepływ szlaku metabolicznego podczas pomiaru wzbogacenia izotopowego w dalsze metabolity. Opracowaliśmy wiarygodną metodologię, aby uzyskać solidną analizę strumienia poprzez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasów trikarboksylowych. Można to osiągnąć zarówno u zwierząt karmionych stabilnym izotopem od wczesnych stadiów rozwojowych larw, jak i rozpoczynających się w okresie postmitotycznym dorosłości. Wzbogacanie izotopowe w różne gatunki metabolitów można badać w połączeniu z profilowaniem całych aminokwasów wolnych od robaków za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak opisano wcześniej⁴, w celu określenia bezwzględnego wzbogacenia izotopowego w różnych gatunkach wolnej alaniny, asparaginianu, glutaminianu i glutaminy. Rzeczywiście, spójne wzorce wzbogacania izotopowego uzyskuje się podczas pomiaru analitów aminokwasów i kwasów organicznych w podwielokrotnościach od 1000 do 2000 młodych dorosłych robaków synchronicznych. Taka metodologia może z wyczuciem rozróżniać nieprawidłowy strumień pośredni w zmutowanych szczepach mitochondrialnych opartych na genach jądrowych w porównaniu z robakami typu dzikiego.

Technika ta jest przydatna w badaniu zmian strumienia w określonych szlakach biochemicznych mających znaczenie dla powszechnych wrodzonych wad metabolizmu. W szczególności wykorzystanie glukozy znakowanej stabilnym izotopem informuje o przepływie węgla przez centralne szlaki metaboliczne mające znaczenie dla choroby mitochondrialnej. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że zastosowanie takiej metodologii może z wyczuciem rozróżniać nieprawidłowy strumień pośredni w zmutowanym szczepie podjednostki mitochondrialnego kompleksu III opartego na genach jądrowych (ISP-1(qm150)) w stosunku do robaków typu dzikiego.

Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że ponieważ ekspozycja na izotopy trwa od jednego do kilku dni, ilościowe wzbogacenie izotopowe reprezentuje wartość wzbogacenia w "stanie ustalonym", a nie kwantyfikowalny strumień w określonym okresie czasu, jak można określić w modelach komórkowych wystawionych na działanie izotopu przez okres od kilku minut do godzin. Innym potencjalnym ograniczeniem przepływu szlaku badawczego w trakcie rozwoju nicieni jest różna długość rozwoju larwalnego, która występuje w poszczególnych zmutowanych szczepach. Na przykład wiadomo, że wiele poważnych mutacji mitochondrialnych powoduje zatrzymanie w trzecim (L3) stadium larwalnym⁶. Tak więc analiza inkorporacji izotopów tylko u zwierząt, które dożywają dorosłości, może nie być reprezentatywna dla całej populacji mutantów. Metodologię tę można jednak dostosować do oceny włączenia izotopów do metabolitów pośrednich w określonym stadium larwalnym (takim jak L2), zamiast czekać, aż zwierzęta osiągną stadium dorosłe. Podobnie, zwierzęta, które wchodzą w alternatywne stadium larwalne znane jako dauer, prawdopodobnie mają znacząco zmieniony (prawdopodobnie niższy) strumień metaboliczny w porównaniu ze zwierzętami, które przechodzą bezpośrednio przez cztery stadia larwalne. W przyszłości można również przeprowadzić badania w celu bezpośredniej oceny inkorporacji izotopowej u zwierząt w stadium zaawansowania genetycznego o różnym pochodzeniu genetycznym. Wystawianie zwierząt na działanie stabilnego izotopu przez określony okres czasu (w tym przypadku od 24 do 48 godzin), rozpoczynając się, gdy zwierzęta osiągną stadium młodego dorosłego osobnika (jak wyszczególniono w Protokole B) usuwa wpływ zmiennych okresów rozwojowych. Podczas gdy ¹³C-glukoza bada tylko glikolizę, metabolizm pirogronianu i strumień cyklu kwasów trikarboksylowych, inne znaczniki izotopowe mogą być potencjalnie oceniane w celu zbadania przepływu szlaków biochemicznych przez inne szlaki zainteresowania nicieni. Na przykład ¹⁵N-glicyna może być wykorzystana do oceny obrotu aminokwasów u nicieni.

Kolejnym potencjalnym ograniczeniem tego podejścia jest poziom czułości wykrywania metabolitów. Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba co najmniej 500 młodych dorosłych nicieni, aby pomyślnie określić ilościowo inkorporację izotopową za pomocą zastosowanych tu metod HPLC i GC/MS. Stosowanie przyrządów o większej czułości, takich jak ultrasprawna chromatografia cieczowa (UPLC), może pozwolić na dalszą redukcję badanej liczby zwierząt, chociaż przewidujemy, że jest mało prawdopodobne, aby pozwoliło to na wiarygodne określenie ilościowe metabolitów i włączenie izotopów do gatunków metabolitów z pojedynczych robaków. Badaliśmy populacje robaków liczące 1000 zwierząt w każdym eksperymencie, które, jak stwierdziliśmy, niezawodnie wykrywają metabolity o niskiej liczebności w każdym szczepie. Jednak niektóre metabolity, takie jak GABA, można wiarygodnie określić ilościowo tylko w znacznie większych populacjach nicieni, rzędu 1x10⁶ zwierząt⁴.

Podsumowując, profilowanie stabilnych izotopów zapewnia nieinwazyjne i bezpieczne (nieradioaktywne) podejście, które od dawna jest wykorzystywane do badania wrodzonych wad metabolizmu. Zastosowanie tej metodologii do C. elegans zapewnia nowe możliwości badania in vivo, w czasie rzeczywistym, zmian metabolicznych zachodzących na poziomie całego zwierzęcia, które mogą wynikać z indywidualnych zaburzeń genetycznych i/lub ekspozycji na czynniki farmakologiczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S. basal		1 - strona 59	Protokoły A i B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protokół B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Protokoły Centrum Genetyki		A i C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protokół B
Agar	NGMProdukty Badawcze Międzynarodowa Corp.	N81800-1000.0	Protokoły A, B i C
13C glukoza (uniwersalnie oznakowane)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protokół A i C
13C glukoza (znakowana 1,6)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protokół B
60% kwas nadchlorowy (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protokoły A i B
ε-kwas aminokapronowy (wzorzec wewnętrzny)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protokoły A i B
MTBSTFA	Regis	270243	Protokół E
Acetonitryl	Regis	270010	Protokół E
AG 1-X8, 100-200, Żywica chlorkowa	Bio-Rad	140-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja kwasami organicznymi)
AG 50W-X8, 100-200, Żywica wodorowa	Bio-Rad	142-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja aminokwasów)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protokół C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protokół C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół A
0,1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protokół D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protokoły A i B
Woda dejonizowana	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protokół D
Hel	Airgas	24001364	Protokół C2
SMZ-800 Mikroskop stereoskopowy	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protokoły A, B i C
pH-metr	Fisher Scientific	S68167	Protokoły A i B
Wirówka stołowa - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protokoły A i B
Wytrząsarka inkubacyjna New	Brunswick Scientific	M1324-0004	Protokół B
Mini rotator rolkowy	Labnet International	H-5500	Protokoły A i B
Tłuczki	Kontes Corp	K749520-0090	Protokoły A i B
Wiertło	Kontes Corp	K749540-0000	Protokoły A i B
Szklana zlewka 1 L	Fisher Scientific	02-539P
1 L Kolby Erlenmeyera	VWR international	89000-368
25 ml Kolby Erlenmeyera	VWR international	89000-356	Protokół B
Probówki szklane okrągłodenne 7 ml + korek gumowy	VWR international	VT6431	Protokoły A, B i C1, C2
Probówki szklane okrągłodenne 10 ml + korek gumowy	VWR international	VT6430	Protokół C2
Niebieskie rurki górne	Labco	438B
Probówki stożkowe plastikowe 50 ml	Falcon BD	14-959-49A	Wszystkie protokoły
Probówki do mikrofuge 1,5 ml	Fisher Scientific	02-681-320	Protokoły A i B
Strzykawki (1 ml, 10 ml, 20 ml)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protokoły C1 i C2
Igły o grubości 25 Fisher	Scientific	22-253-131	Protokoły C1 i C2
Kolumny chromatograficzne Poly-Prep	Bio-Rad	731-1550	Protokół D
Pipety Pasteura	VWR international	14673-043	Protokół D
Szalki Petriego 60 mm	VWR international	25373-085	Protokół C
Szklana komora (ścięte dno kolby 1 L) wyposażona w uszczelniony smarem 3-drogowy kran	Custom Made		Protocol C
Optycznie przezroczysta szklana płyta	Custom Made		Protocol C
Parownik Reacti-Vap III	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protokół D
Bawełna	VWR international	14224-516	Protokół D
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning	1597418	Protokół C1
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	01-213-18	Protokół B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protokół C
Spektrometr masowy ze stosunkiem gazu	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protokół D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protokół D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protokół D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protokół D