Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Podsumowanie

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Streszczenie

Profilowanie stabilnymi izotopami od dawna pozwala na czułe badania skutków metabolicznych mutacji genetycznych i/lub terapii farmakologicznych w modelach komórkowych i ssaczych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowe metody przeprowadzania profilowania stabilnymi izotopami metabolizmu pośredniego oraz strumienia metabolicznego u nicienia Caenorhabditis elegans. Opisano metody profilowania wolnych aminokwasów w całym organizmie nicienia, znakowanego dwutlenku węgla, znakowanych kwasów organicznych oraz znakowanych aminokwasów w zwierzętach poddanych działaniu stabilnych izotopów – albo od wczesnego etapu rozwoju na płytkach agarowych z pożywką wzrostową dla nicieni, albo począwszy od wczesnej dorosłości podczas ekspozycji na różne terapie farmakologiczne w hodowli płynnej. Wolne aminokwasy są ilościowo oznaczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w alikwotach całych nicieni ekstrahowanych w 4% kwasie nadchlorowym. Jako prekursor stabilnego izotopu wykorzystuje się uniwersalnie znakowaną glukozę ¹³C lub 1,6-¹³C₂-glukozę, której znakowany węgiel jest śledzony za pomocą spektrometrii mas w dwutlenku węgla (zarówno atmosferycznym, jak i rozpuszczonym), a także w metabolitach wskazujących na strumień poprzez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasu trójkarboksylowego. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, aby zademonstrować wpływ czasu ekspozycji na izotop, różnych protokołów usuwania bakterii oraz alternatywnych metod rozdrabniania nicieni u osobników typu dzikiego, a także względny stopień wbudowania izotopu u nicieni z mutacją kompleksu III mitochondriów (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego. Zastosowanie profilowania stabilnymi izotopami u żywych nicieni zapewnia nową możliwość badania na poziomie całego organizmu zmian metabolicznych zachodzących w czasie rzeczywistym, wywołanych przez poszczególne zaburzenia genetyczne i/lub terapie farmakologiczne.

Protokół

Protokół A: Stabilne profilowanie izotopowe metabolizmu pośredniego podczas rozwoju C. elegans na płytkach NGM.

*Uwaga: Wzbogacenie izotopami stabilnymi można z powodzeniem zmierzyć w populacjach młodych dorosłych nicieni po ekspozycji na izotopy (z użyciem albo całkowicie znakowanej glukozy ¹³C, albo 1,6-¹³C₂-glukozy), rozpoczynając albo we wczesnym etapie rozwoju, albo we wczesnej dorosłości. Niniejszy protokół umożliwia jednoczesne monitorowanie stanu zdrowia, rozwoju i wzrostu zwierząt na standardowych pożywkach do wzrostu nicieni (NGM), co nie jest tak łatwo osiągalne w hodowlach płynnych.

1. Przygotować szalki Petriego o średnicy 100 mm z 10 mL pożywki do wzrostu nicieni (NGM), zgodnie ze standardową techniką. ¹
2. Zasiać na płytkach NGM bakterie E. coli szczep OP50 ¹ i pozostawić do wyschnięcia przez noc.
3. Dodać równomiernie na płytkę 500 μL 200 mM 1,6-¹³C₂ glukozy (aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM na płytce NGM). Pozostawić do wyschnięcia przez noc.
4. Poddać owidukujące dorosłe nicienie działaniu podchlorynu ¹. Odzyskane jaja wysiać na płytki NGM bez bakterii lub 1,6-¹³C₂ glukozy. Inkubować w temperaturze 20°C przez noc.
5. Następnego dnia przenieść wyklute larwy w stadium zahamowania L1 na płytki NGM uprzednio zasiane 1,6-¹³C₂-glukozą i E. coli OP50 (zgodnie z krokiem nr 2 powyżej). Hodować nicienie do stadium młodych osobników dorosłych (48-72 godziny, w zależności od szczepu), dbając o to, aby nicienie nie głodowały.
6. Zebrać synchroniczne, jednodniowe młode osobniki dorosłe z płytek, używając 3-4 mL buforu S. Basal.
7. Przemyć nicienie w 50 mL buforu S. Basal w probówkach Falcon 50 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia siłą grawitacji przez 5 minut. Odlać nadsącz do objętości ~5 mL. Powtórzyć przemywanie jeszcze dwukrotnie.
8. Oszacować liczbę nicieni, odliczając trzy aliquoty po 100 μL². Dostosować stężenie nicieni do 1000 nicieni/mL buforu S. Basal.
9. Pipetować 1 mL (1000 nicieni) do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.
10. Dodać 69 μL 60% PCA zawierającego wzorzec wewnętrzny (kwas ε-aminokapronowy), aby uzyskać stężenie końcowe 4% PCA i 200 μmol wzorca wewnętrznego.
11. Pozostawić nicienie do osadzenia siłą grawitacji przez 5 minut. Odlać i zachować nadsącz w osobnej probówce.
12. Rozetrzeć próbki nicieni za pomocą plastikowego homogenizatora (Kontes Pellet Pestle) i wiertarki elektrycznej (Kontes Pellet Pestle Cordless Motor) przez 15 sekund. Potwierdzić wizualnie rozbicie nicieni za pomocą mikroskopii świetlnej. Powtórzyć w razie potrzeby.
13. Przenieść nadsącz z kroku nr 11 i połączyć go z homogenatem z kroku nr 12.
14. Wirować próbkę przy 2250 rpm (1300 x g) przez 5 minut.
15. Przenieść nadsącz do nowej szklanej probówki 7 mL. Zachować osad do oznaczania stężenia białka, zgodnie ze szczegółami w kroku nr 20 poniżej.
16. Dostosować pH próbek do zakresu 7-8 (neutralnego) za pomocą 4N KOH.
17. Wirować zneutralizowane próbki w szklanej probówce 7 mL przy 2250 rpm (1300 x g) przez 5 minut w celu usunięcia soli.
18. Przenieść nadsącz do nowej szklanej probówki 7 mL.
19. Przygotować zneutralizowane próbki do oznaczania metabolitów poprzez:
    1. Wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC): Oddzielić 50 μL zneutralizowanej próbki do bezpośredniego wstrzyknięcia do HPLC. Oznaczanie wolnych aminokwasów przeprowadza się metodą HPLC (Varian) z wykorzystaniem derywatyzacji przedkolumnowej o-ftalaldehydem i detekcją fluorescencyjną, jak opisano wcześniej^3-4.
    2. Chromatografię gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GC/MS): Przystąpić do ekstrakcji pozostałych zneutralizowanych próbek przy użyciu żywicy jonowymiennej (Bio-Rad) w celu oznaczenia wzbogacenia izotopowego aminokwasów i kwasów organicznych metodą GC/MS, zgodnie ze szczegółami w PROTOKOLE D.
20. Dodać 1 mL 1N NaOH do pozostałego osadu białkowego (z kroku nr 15) w szklanej probówce 7 mL.
21. Inkubować próbkę białka traktowaną NaOH w temperaturze pokojowej podczas rotacji (Labnet* LabRoller Rotator) przez noc, aż do rozpuszczenia.
22. Użyć 75-100 μL białka traktowanego NaOH do oznaczenia stężenia białka standardowymi metodami (DC Protein Assay, Bio-rad).

Protokół B. Profilowanie stabilnych izotopów metabolizmu pośredniego u młodych dorosłych osobników C. elegans w hodowli płynnej.

*UWAGA: Wpływ farmakologiczny na przepływ metaboliczny produktów pośrednich u dorosłych nicieni można badać po ekspozycji izotopowej rozpoczynającej się w pierwszym dniu składania jaj, zarówno na płytkach NGM (patrz Protokół A powyżej), jak i w kulturze płynnej. Preferujemy drugie podejście, aby zmaksymalizować efektywność kosztową wykorzystania stabilnych izotopów i czynników farmakologicznych.

1. Rozcieńczyć zsynchronizowane młode dorosłe osobniki w pierwszym dniu składania jaj w pożywce S. Basal zawierającej 0,0005% cholesterolu (otrzymanej poprzez dodanie 0,5 ml 1% cholesterolu (rozpuszczonego w 95% etanolu) do 1 l pożywki S. Basal) do stężenia 2000 osobników na 500 μL.
2. Przygotować hodowlę (lub hodowle) o całkowitej objętości ok. 4 ml w kolbach Erlenmeyera o pojemności 25 ml w następujący sposób:

   OBRÓBKA:	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	"LEK A
   S. Podstawowe z cholesterolem	3020 μL	3020 µL – objętość „Leku A”
   Stabilne izotopy (1,6-13C2-glukozy)	80 μL	80 μL
   K12 E. coli (OD660 2,5 do 3)	400 μL	400 μL
   Młode dorosłe nicienie (2 000)	500 μL	500 μL
   Lek A (pożądane stężenie)	-	Zgodnie z życzeniem

3. Przykryć kolby folią. Inkubować kolby w wytrząsarce z platformą w temperaturze 20°C przez 24 godziny przy 220 obr./min.
4. Należy upewnić się, że kolby nie są całkowicie szczelne, ponieważ tlen jest niezbędny dla pośredniego strumienia metabolicznego oraz dla wynikającego z tego znakowania endogennych metabolitów nicieni.
5. Przemyj nicienie, dodając 4 ml kultury do 46 ml medium S. basal w 50-mililitrowej stożkowej probówce plastikowej. Pozostaw nicienie na 5 minut, aby osiadły w probówce pod wpływem grawitacji. Odsącz nadsącz za pomocą pompy próżniowej, pozostawiając około 5 ml cieczy. Powtórz proces płukania, dwukrotnie uzupełniając objętość w probówce do 50 ml za pomocą medium S. basal.
6. Skoncentrować wypłukane nicienie do stężenia 1000 osobników/ml w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
7. Dodać 69 μL 60% kwasu nadchlorowego (PCA) oraz 2 μL 10 μM standardu wewnętrznego (kwasu ε-aminokapronowego), aby uzyskać końcowe stężenie 200 μmol standardu wewnętrznego oraz 4% PCA.
8. Przygotować próbki zgodnie z krokami od 11 do 22 w PROTOKOLE A.

PROTOKÓŁ C-1. Monitorowanie wykorzystania izotopów w dorosłych nicieniach na szalkach poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferycznym i rozpuszczonym dwutlenku węgla.

*UWAGA: Podczas gdy PROTOKOŁY A i B szczegółowo opisują metody monitorowania wbudowy izotopu w wolne metabolity w organizmach nicieni odpowiednio w ciągu 2-3 dni rozwoju lub 1 dnia życia dorosłego osobnika, ogólną potwierdzenie sukcesu i kinetyki wbudowy izotopowej w krótkim przedziale czasowym (tj. od minut do godzin) można osiągnąć poprzez monitorowanie znacznika w dwutlenku węgla (CO₂) z atmosfery uwalnianego przez nicienie lub zawartego w rozpuszczonym dwutlenku węgla w ekstrakcie z nicieni. Żywe lub zabite bakterie mogą być podawane nicieniom hodowanym na płytkach (PROTOKÓŁ C-1). Bakterie nie są niezbędne do krótkotrwałej ekspozycji nicieni na izotopy w hodowli płynnej (PROTOKÓŁ C-2).

1. Przygotować szalki Petri o średnicy 100 mm z 10 mL agaru NGM. Posiać na płytkach NGM żywe lub zabite promieniami UV szczepy E. coli OP50 (zgodnie z pokazem na Rysunku 1). Pozostawić płytki do wyschnięcia przez noc.
2. Dodać 500 μL 200 mM glukozy znakowanej 1,6-¹³C₂ do posianych OP50 płytek NGM (aby uzyskać końcowe stężenie izotopu 10 mM na płytce NGM). Pozostawić płytki do wyschnięcia przez noc.
3. Pozyskać synchroniczne, młode dorosłe nicienie z pierwszego dnia składania jaj, hodowane na płytkach z agarem NGM posianych wyłącznie szczepem E. coli OP50.
4. Przenieść 1000 młodych dorosłych nicieni na eksperymentalne płytki z agarem NGM zawierające izotop stabilny i E. coli (przygotowane zgodnie z krokami #1-2 powyżej).
5. Umieścić eksperymentalną płytkę NGM (bez pokrywki) w specjalnej komorze szklanej wyposażonej w szczelny kran trójdrożny, umożliwiający precyzyjne pobieranie i wymianę atmosfery. Natychmiast zamknąć komory optycznie przezroczystym dyskiem szklanym. Miejsce styku dysku szklanego z płytką pokryć smarem wysokopróżniowym w celu uszczelnienia. Zapisać czas jako „Czas 0”.
6. Pobrać 10 mL atmosfery z komory szklanej przez kran trójdrożny za pomocą strzykawki 20 mL w 30., 60., 90. i 120. minucie. Przenieść każdą próbkę atmosfery do wcześniej przygotowanej, zamkniętej próżniowo probówki szklanej z gumowym korkiem, zawierającej 1 mL 1 mM NaHCO₃ w 0,1 N NaOH.
7. Wstrzyknąć 10 mL powietrza z powrotem do każdej komory szklanej przez kran trójdrożny za pomocą strzykawki 20 mL. Zamknąć kran prowadzący do komory po pobraniu/ponownym wstrzyknięciu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji między punktami czasowymi pobierania próbek.
8. Wstrzyknąć 100 μL 20% kwasu fosforowego przez korek do probówki szklanej z gumowym korkiem zawierającej próbkę atmosferycznego CO₂.
9. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL probówek do autosamplera z niebieskim kapslem, uprzednio wypełnionych helem, w celu pomiaru atmosferycznego CO₂.
10. Próbki „atmosferycznego CO₂” poddać analizie za pomocą spektrometru mas o stosunku gazowym (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Otworzyć komory szklane po dwugodzinnym okresie inkubacji izotopowej i pobraniu wszystkich próbek atmosfery.
12. Zmyć nicienie z płytek NGM, używając 3 mL S. basal.
13. Przemyć nicienie w 50 mL S. basal w probówkach Falcon 50 mL. Powtórzyć przemywanie jeszcze dwa razy.
14. Skoncentrować nicienie do stężenia ~1000 nicieni/mL w szklanej probówce (probówkach) o okrągłym dnie o pojemności 7 mL.
15. Zamknąć probówkę szklaną próżniowo za pomocą gumowego korka.
16. Dodać 100 μL 20% kwasu fosforowego przez gumowy korek za pomocą strzykawki, aby uwolnić rozpuszczony CO₂.
17. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL probówek do autosamplera z niebieskim kapslem, uprzednio wypełnionych helem, w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂.
18. Próbki „rozpuszczonego CO₂” poddać analizie za pomocą spektrometru mas o stosunku gazowym (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Alternatywny protokół (C-2): Monitorowanie wykorzystania izotopów u dorosłych nicieni w hodowli płynnej poprzez śledzenie znakowanego węgla w atmosferycznym i rozpuszczonym dwutlenku węgla.

1. Przygotować synchroniczną populację młodych dorosłych nicieni z pierwszego dnia składania jaj, hodowanych na płytkach agarowych NGM z wysianą bakterią E. coli szczep OP50.
2. Przemyć nicienie w 50 mL soli S. basal w probówkach Falcon 50 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia przez grawitację przez 5 minut. Odlać supernatant, pozostawiając ok. 5 mL. Powtórzyć proces płukania jeszcze dwukrotnie.
3. Przenieść 1000 młodych dorosłych nicieni w 1 mL soli S. basal do szklanej probówki o okrągłym dnie o pojemności 10 mL. Do 1 mL zawiesiny nicieni dodać 10,1 μl roztworu stokowego 1 M glukozy uniwersalnie znakowanej ¹³C, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM.
4. Utnlenić probówkę o okrągłym dnie zawierającą nicienie i izotop, wymieniając atmosferę wewnątrz otwartej probówki poprzez przepływ 100% tlenu przez 2 minuty. Natychmiast zamknąć probówkę gumowym korkiem.
5. Wstrząsać probówkami eksperymentalnymi na inkubowanym w 20°C wytrząsarce platformowej przy 220 rpm. Zapisać czas rozpoczęcia jako „Czas 0”.
6. Pobrać 5 mL atmosfery z 10 mL szklanej probówki o okrągłym dnie za pomocą 10 mL strzykawki i igły 25G przez gumowy korek w 30, 60, 90 i 120 minutach.
7. Przenieść każdą próbkę atmosferyczną do wcześniej przygotowanej, zamkniętej próżniowo 10 mL szklanej probówki z gumowym korkiem, zawierającej 1 mL 1 mM NaHCO₃ w 0,1 N NaOH.
8. Wstrzyknąć 5 mL powietrza z powrotem do każdej eksperymentalnej szklanej probówki o okrągłym dnie zawierającej nicienie i izotop przez gumowy korek, używając 10 mL strzykawki i igły 25G.
9. Wznowić inkubację eksperymentalnych 10 mL szklanych probówek o okrągłym dnie zawierających nicienie i izotop, wstrząsając przy 220 rpm pomiędzy punktami czasowymi pobierania próbek.
10. Wstrzyknąć 100 μL 20% kwasu fosforowego przez korek do 10 mL szklanej probówki z gumowym korkiem zawierającej pobraną atmosferę.
11. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL probówek do autosamplera z niebieską zakrętką, uprzednio napełnionych helem, w celu pomiaru CO₂ atmosferycznego.
12. Przeanalizować „próbki CO₂ atmosferycznego” za pomocą spektrometru mas z pomiarem stosunku gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. Po zakończeniu okresu eksperymentalnego przemyć nicienie w 50 mL soli S. basal w probówce Falcon 50 mL. Pozostawić do uformowania się osadu nicieni przez grawitację. Odessać supernatant za pomocą próżni, pozostawiając ok. 5 mL. Powtórzyć płukanie jeszcze dwukrotnie w 50 mL soli S. basal.
14. Skoncentrować nicienie do poziomu ok. 1000 nicieni/mL w 7 mL szklanej probówce o okrągłym dnie. Zamknąć probówkę gumowym korkiem i uszczelnić próżniowo. Wstrzyknąć 100 μL 20% kwasu fosforowego za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 25G przez gumowy korek, aby uwolnić rozpuszczony CO₂ z nicieni.
15. Pobrać 2 mL atmosfery i wstrzyknąć do 12 mL probówek do autosamplera z niebieską zakrętką, uprzednio napełnionych helem, w celu pomiaru rozpuszczonego CO₂.
16. Przeanalizować „próbki rozpuszczonego CO₂” za pomocą spektrometru mas z pomiarem stosunku gazów (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protokół D. Obróbka zneutralizowanych próbek z Protokołów A i B do analizy aminokwasów i kwasów organicznych za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas.

1. Przygotowanie kulek:
   1. Do kulek Ag 1 i Ag 50 oddzielnie dodaj 1 N HCl w zlewkach o pojemności 1L.
   2. Mieszaj zawartość każdej kolby przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego.
   3. Przemywaj kulki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH płuczek zrówna się z pH wody.
2. Przygotowanie kolumn:
   1. Wprowadź czop watowy tuż nad najwęższą część końcówki pipety Pasteura.
   2. Do każdej z dwóch kolumn na próbkę dodaj naładowane kulki, wypełniając je do około jednej trzeciej wysokości kolumny. Użyj kulek AG1 do ekstrakcji kwasów organicznych. Użyj kulek AG50 do ekstrakcji aminokwasów.
3. Przetwarzanie próbek:
   1. Do kolumny z naładowanymi kulkami AG1 dodaj 500 μL próbki. Jeśli próbka ma już neutralne pH, przed nałożeniem na kolumnę AG1 w celu ekstrakcji kwasów organicznych nie dodaje się do niej niczego (patrz PROTOKÓŁ A, krok #19B).
   2. Do pozostałej części próbki przed nałożeniem na kolumnę AG50 w celu ekstrakcji aminokwasów dodaj 1 mL 0,1 N HCL.
   3. Pozostaw próbki do całkowitego przepływu przez kolumny.
   4. Przemywaj kolumnę wodą 10 razy, aż płuczki będą neutralne (zakres pH 7-8).
   5. Eluuj kolumny do świeżych, oznakowanych szklanych fiolek na próbki o pojemności 4 mL:
      1. W przypadku ekstrakcji kwasów organicznych dodaj 3 mL 3 N HCl do kolumny AG1. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego w całkowitej liczbie znakowanych węgli wśród gatunków 3-węglowych (mleczan), 4-węglowych (asparagian, bursztynian, jabłczan), 5-węglowych (glutaminian) i 6-węglowych (cytrynian).
      2. W przypadku ekstrakcji aminokwasów: dodaj 3 mL 4 N NH₄OH do kolumny AG50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego w całkowitej liczbie znakowanych węgli wśród gatunków 3-węglowych (alanina) i 5-węglowych (glutamina).
   6. Umieść fiolki z próbkami w ewaporatorze Reacti-Vap III na noc, aż do wyschnięcia.

E. Deratyzacja próbek i ustawienia urządzenia do spektrometrii mas

Do każdej fiolki z próbką dodać 50 μL acetonitrylu oraz 50 μL N-metylo-N-t-butyldimetylosilylo-trifluoroacetamidu (MTBSTFA). Przykryć, wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 60°C. Do chromatografu gazowego sprzężonego z spektrometrem mas (GC/MS) wstrzyknąć 1-2 μl każdej próbki.

F. Analiza wyników

1. Kwantyfikacja pików aminokwasów. Ilość każdego aminokwasu w analizie HPLC oblicza się na podstawie pola powierzchni każdego piku w stosunku do piku wzorca wewnętrznego.
2. Obliczanie wzbogacenia izotopowego. Stabilne wzbogacenie izotopowe oblicza się w programie Excel (Microsoft) dla każdego gatunku według następującego wzoru: Atom Percent Excess, corrected (APE) = (R_sa-R_st)*100/[(R_sa-R_st)+100], gdzie R_sa - stosunek w próbce oraz R_st - stosunek we wzorcu.
3. Ocena różnic statystycznych między wzbogaceniem próbek. Do oceny istotności różnic w zawartości aminokwasów i znakowaniu izotopowym między próbkami stosuje się test t-Studenta.

REPREZENTATYWNE WYNIKI:

Stabilny izotop został dobrze wbudowany w organizmy młodych dorosłych nicieni, co potwierdzono poprzez pomiar znakowanego węgla w atmosferycznym CO2₂ oraz rozpuszczony w organizmach nicieni $CO_2$. W nicieniach karmionych żywymi lub zabitymi promieniowaniem UV bakteriami OP50 *E. coli*, stosunek ¹³Tlenek węgla₂ do ¹²Tlenek węgla₂ było większe w grupie z rozpuszczonymi nicieniami CO₂ frakcja w stosunku do uwolnionego do atmosfery CO₂ (Rycina 1). Karmienie nicieni żywymi lub zabitymi bakteriami OP50 E. coli nie zmieniło znacząco pomiaru ¹³CO₂ Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. ¹²tlenek węgla₂ stosunek w ekstrakcie z przemytych nicieni (patrz PROTOKÓŁ C1).

Przedłużona ekspozycja na stabilny izotop od wczesnego okresu larwalnego zwiększyła wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich. Skorygowany procentowy nadmiar atomów znakowanego węgla, wyznaczony w metabolitach pośrednich młodych dorosłych nicieni typu dzikiego, był wyższy dla wszystkich gatunków glutaminianu w przypadku, gdy nicienie były karmione uniwersalnie znakowaną glukozą ¹³C oraz żywymi bakteriami przez cały okres rozwoju, w porównaniu z podobnie traktowanymi zwierzętami karmionymi znakowanymi bakteriami tylko przez 48 godzin po osiągnięciu dorosłego stadium składającego jaja (Rysunek 2).

Wpływ czasu oczyszczania na wzbogacenie izotopowe. Niezależnie od przebiegu czasu ekspozycji, wszystkie zwierzęta hodowane na płytkach zostały „oczyszczone” z izotopu przed dalszym przygotowaniem do analiz GC/MS. Porównanie protokołów oczyszczania przeprowadzono zgodnie z rysunkiem 2, obejmując karmienie nicieni przez 2 godziny na płytkach agarowych NGM z wysianymi żywymi, świeżymi bakteriami bez izotopu, karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 godziny oraz karmienie na płytkach agarowych NGM bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. Niezależnie od przebiegu ekspozycji izotopowej, nie zaobserwowano istotnych różnic we wzbogaceniu izotopowym metabolitów pośrednich w ekstrakcie z całych nicieni w stadium młodych osobników dorosłych, gdy zwierzęta były oczyszczane na płytkach bez bakterii przez 2 lub 6 godzin. W przeciwieństwie do tego, mniejsze wzbogacenie izotopowe metabolitów pośrednich zaobserwowano, gdy zwierzęta były następnie „oczyszczane” z nadmiaru izotopu poprzez karmienie nieoznakowanymi bakteriami przez dwie godziny. Jednakże zwiększone wzbogacenie w gatunkach +3, +4 i +5 było widoczne, gdy nicienie były eksponowane na izotop od wczesnego okresu larwalnego. W związku z tym ustalono, że optymalny protokół oczyszczania polega na oczyszczaniu nicieni po ich inkubacji na płytkach NGM z wysianym izotopem stabilnym i bakteriami poprzez następującą inkubację przez 2 godziny na niewysianych płytkach NGM. Należy zauważyć, że nicienie hodowane w kulturze płynnej były przepłukiwane w celu usunięcia izotopu i bakterii w trzech objętościach S. basal (patrz Protokół B); analiza GC/MS popłuczyn nie wykazała istotnego wzbogacenia izotopowego po trzecim płukaniu.

Rozdrabnianie nicieni doprowadziło do maksymalnego wzbogacenia w metabolity pośrednie. Aby zoptymalizować procent wzbogacenia w metabolity pośrednie przy podobnych warunkach traktowania, porównano próbki nicieni rozbitych za pomocą samej sonikacji oraz sonikacji połączonej z rozdrabnianiem. Rycina 3 pokazuje, że nicienie rozbite po ekspozycji na izotopy za pomocą sonikacji i rozdrabniania wykazały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki rozbite wyłącznie przez sonikację. Dane te sugerują, że rozdrabnianie doprowadziło do rozbicia większej liczby frakcji podorganizmalnych niż sonikacja. Kolejne badania wykazały, że samo rozdrabnianie bez sonikacji było wystarczające do osiągnięcia maksymalnego wzbogacenia izotopowego (dane niepokazane).

Ekspozycja całych nicieni na izotopy umożliwia analizę przepływu w pośrednich szlakach metabolicznych. Karmienie żywych nicieni stabilnym prekursorem izotopowym albo podczas rozwoju (PROTOKÓŁ A, Rycina 4A), albo począwszy od stadium dorosłych osobników (PROTOKÓŁ B, Rycina 4B) pozwala na czułą analizę wzbogacenia izotopowego metabolitów wskazujących na przepływ przez glikolizę (mleczan, alanina), metabolizm pirogronianu (alanina) oraz cykl kwasów trójkarboksylowych (cytrynian, jabłczan, bursztynian, asparaginian, glutaminian i glutamina). Uniwersalnie znakowana glukoza ¹³C zapewnia trwałe znakowanie wszystkich gatunków węgla, podczas gdy zastosowanie 1,6-¹³C₂-glukozy umożliwia trwałe znakowanie tylko w gatunkach +1 każdego metabolitu. Technika ta pozwala na czułe rozróżnienie różnic w pośrednim przepływie metabolicznym między nicieniami typu dzikiego a szczepami z mutacjami w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, takimi jak mutant podjednostki mitochondrialnego łańcucha oddechowego kompleksu III isp-1(qm150). Rycina 5 ilustruje wielkość różnic zaobserwowanych w bezwzględnym znakowaniu między nicieniami isp-1(qm150) a N2, z których każdy był eksponowany przez 24 godziny na 1,6-¹³C₂-glukozę w kulturze płynnej z bakteriami E. coli K12 od pierwszego dnia etapu młodych dorosłych osobników składających jaja (Protokół B). Trwają dodatkowe badania izotopowe na szeregu mutantów mitochondrialnych nicieni.

Rysunek 1. Stabilny izotop ¹³C-glukozy z uniwersalnym znakowaniem został dobrze wbudowany w dorosłe nicienie w młdym wieku. Stosunek ¹³CO₂ do ¹²CO₂ (procent nadmiaru atomów (APE), skorygowany) u nicieni typu dzikiego (N2) po dwóch godzinach karmienia uniwersalnie znakowaną ¹³C-glukozą oraz bakteriami OP50 zabitymi promieniami UV lub żywymi na płytkach (PROTOKÓŁ C1). Wbudowanie ¹³C w metabolity nicieni było wyraźne po dwóch godzinach ekspozycji na izotop. Niebieskie i czerwone słupki wskazują odpowiednio względne wzbogacenie izotopowe w fazie gazowej („atmosferyczny CO₂”) i fazie ciekłej („CO₂ nicieni”).

Rysunek 2. Przedłużona ekspozycja na izotopy od wczesnego okresu larwalnego i późniejsze „oczyszczanie” nicieni na płytkach agarowych NGM bez bakterii zwiększyło wzbogacenie izotopowe wolnego glutaminianu u młodych dorosłych nicieni. Wzbogacenie izotopowe w gatunkach glutaminianu pokazano dla nicieni karmionych na płytkach agarowych NGM z uniwersalnie znakowaną ¹³C-glukozą i bakteriami OP50 albo przez cały okres rozwoju od stadium larwalnego L1 do stadium młodych dorosłych o 959 komórkach („L1”, patrz PROTOKÓŁ A), albo przez czterdzieści osiem godzin, począwszy od momentu, gdy nicienie osiągnęły pierwszy dzień składania jaj w stadium młodych dorosłych („YA”). Oś X wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu. Oś Y wskazuje procent wzbogacenia (poprawione atomy na nadmiar (APE)). Zielone słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji na izotopy poprzez karmienie E. coli OP50 bez izotopu na płytkach NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji na izotopy na płytkach NGM bez bakterii i izotopu odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA.

Rycina 3. Rozbicie nicieni poprzez mielenie zapewnia maksymalne wzbogacenie izotopowe pośrednich metabolitów nicieni. Procent wzbogacenia w węgiel zmierzony w gatunkach +1 cytrynianu w nicieniach typu dzikiego, poddanych 24-godzinnej inkubacji w kulturze płynnej z 1,6-¹³C₂-glukozą bez bakterii (PROTOKÓŁ B). Czarne i szare słupki oznaczają odpowiednio nicienie rozbite wyłącznie przez sonikację lub przez sonikację i mielenie. Wzbogacenie izotopowe po ekspozycji na 1,6-¹³C₂-glukozę jest najlepiej oceniane w metabolitach znakowanych na jednym węglu. W przeciwieństwie do tego, znakowanie jest wzbogacone we wszystkich gatunkach każdego metabolitu, gdy stosowana jest uniwersalnie znakowana ¹³C-glukoza.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki ilustrują zakres wzbogacenia izotopowego metabolitów pośrednich u nicieni, wskazujący na strumień przez glikolizę, metabolizm pirogronianu oraz cykl kwasów trójkarboksylowych. Skorygowaną procentową nadwyżkę atomów (APE) wyznaczono u młodych dorosłych nicieni typu dzikiego (N2 Bristol) po ekspozycji na 1,6-¹³C₂-glukozę albo (A) podczas rozwoju od stadium L1 na płytkach (PROTOKÓŁ A), albo (B) począwszy od pierwszego dnia składania jaj jako młode osobniki dorosłe przez 24 godziny w kulturze płynnej (PROTOKÓŁ B). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe w przypadkach, gdy dostępne były wiarygodne dane izotopowe z trzech powtórzeń biologicznych.

Rycina 5. Bezwzględne oznaczenie ilościowe metabolitów aminokwasowych u szczepów nicieni typu dzikiego i mutantów mitochondrialnych. Bezwzględna wartość dla każdego z czterech gatunków aminokwasów została obliczona poprzez pomnożenie stężenia wolnych aminokwasów wyznaczonego metodą HPLC (nmol/mg białka nicieni) przez skorygowany procent nadmiaru atomów (APE) dla każdego gatunku. Słupki szare i czarne oznaczają odpowiednio szczepy typu dzikiego (N2 Bristol) oraz mutanty podjednostki kompleksu III mitochondriów (isp-1(qm150)). Słupki przedstawiają średnią z trzech powtórzeń biologicznych dla każdego szczepu.

Dyskusja

Zastosowanie spektrometrii mas do pomiaru zawartości izotopowej w metabolitach pośrednich pozwala na uzyskanie niezwykle szczegółowego obrazu krytycznych zmian biochemicznych⁵. W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły wykorzystania tej wysokoczułej i specyficznej metodologii do oceny przepływu metabolitów pośrednich u genetycznie wszechstronnego zwierzęcia modelowego, C. elegans. Karmienie żywych zwierząt prekursorami metabolicznymi znakowanymi stabilnymi izotopami (takimi jak ¹³C-glukoza) umożliwia uzyskanie nowej wiedzy na temat przepływu w pośrednich szlakach metabolicznych poprzez pomiar wzbogacenia izotopowego w metabolitach pochodnych. Opracowaliśmy niezawodną metodologię pozwalającą na rzetelną analizę przepływu w glikolizie, metabolizmie pirogronianu oraz cyklu kwasu trójkarboksylowego. Można to osiągnąć zarówno u zwierząt karmionych stabilnymi izotopami od wczesnych stadiów larwalnego rozwoju, jak i począwszy od pomitotycznego okresu dorosłości. Wzbogacenie izotopowe różnych gatunków metabolitów można badać w połączeniu z profilowaniem wolnych aminokwasów z całych nicieni za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak opisano wcześniej⁴, aby określić bezwzględne wzbogacenie izotopowe różnych gatunków wolnej alaniny, asparaginianu, glutaminianu i glutaminy w organizmie nicienia. Spójne wzorce wzbogacenia izotopowego uzyskuje się podczas pomiaru analitów aminokwasów i kwasów organicznych w alikwotach od 1 000 do 2 000 młodych, synchronicznych dorosłych nicieni. Taka metodologia pozwala na czułe rozróżnienie nieprawidłowego przepływu pośredniego w szczepach mutantów mitochondrialnych z mutacjami w genach jądrowych w stosunku do nicieni typu dzikiego.

Technika ta jest cenna w badaniu zmian strumienia w konkretnych szlakach biochemicznych istotnych dla powszechnych wrodzonych błędów metabolizmu. W szczególności wykorzystanie glukozy znakowanej stabilnym izotopem dostarcza informacji o strumieniu węgla przez centralne szlaki metaboliczne istotne dla chorób mitochondrialnych. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że zastosowanie tej metodologii pozwala na czułe odróżnienie nieprawidłowego strumienia produktów pośrednich w szczepie mutanta podjednostki kompleksu III mitochondriów opartego na genie jądrowym (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego.

Należy pamiętać, że ponieważ ekspozycja na izotopy trwa od jednego do kilku dni, ilościowo określone wzbogacenie izotopowe reprezentuje wartość wzbogacenia w „stanie stacjonarnym”, a nie mierzalny strumień w określonym przedziale czasu, jaki można by wyznaczyć w modelach komórkowych eksponowanych na izotop przez okres od kilku minut do kilku godzin. Inne potencjalne ograniczenie badania strumienia szlaków metabolicznych w trakcie rozwoju nicieni wiąże się z różną długością rozwoju larwalnego w konkretnych szczepach mutantów. Na przykład wiadomo, że wiele poważnych mutacji mitochondrialnych powoduje zatrzymanie rozwoju na trzecim stadium (L3) larwy⁶. Zatem analiza wbudowania izotopu wyłącznie u zwierząt, które dożyły wieku dorosłego, może nie być reprezentatywna dla całej populacji mutantów. Metodologia ta mogłaby jednak zostać dostosowana do oceny wbudowania izotopowego w metabolitach pośrednich na konkretnym etapie larwalnym (np. L2), zamiast oczekiwania, aż zwierzęta osiągną stadium dorosłe. Podobnie, zwierzęta, które wchodzą w alternatywne stadium larwalne znane jako dauer, prawdopodobnie wykazują znacznie zmieniony (prawdopodobnie niższy) strumień metaboliczny w porównaniu ze zwierzętami, które przechodzą bezpośrednio przez cztery stadia larwalne. W przyszłości można przeprowadzić badania w celu bezpośredniej oceny wbudowania izotopowego u zwierząt w stadium dauer o różnych podłożach genetycznych. Ekspozycja zwierząt na trwały izotop przez określony czas (tutaj od 24 do 48 godzin), rozpoczynająca się w momencie osiągnięcia przez zwierzęta stadium młodego dorosłego (zgodnie ze szczegółami w Protokole B), eliminuje wpływ zmiennych okresów rozwojowych. Podczas gdy ¹³C-glukoza pozwala badać jedynie glikolizę, metabolizm pirogronianu i strumień cyklu kwasów trójkarboksylowych, potencjalnie można zastosować inne znaczniki izotopowe do badania strumienia szlaków biochemicznych w innych interesujących obszarach u nicieni. Na przykład ¹⁵N-glicyna mogłaby zostać wykorzystana do oceny obrotu aminokwasów u nicieni.

Kolejnym potencjalnym ograniczeniem tego podejścia jest poziom czułości detekcji metabolitów. Nasze doświadczenia sugerują, że do skutecznego ilościowego oznaczenia wbudowania izotopowego za pomocą zastosowanych tutaj metod HPLC oraz GC/MS wymagane jest minimum 500 młodych dorosłych nicieni. Zastosowanie instrumentów o większej czułości, takich jak ultrawydajna chromatografia cieczowa (UPLC), może pozwolić na dalszą redukcję liczby badanych zwierząt, choć przewidujemy, że jest mało prawdopodobne, aby umożliwiło to wiarygodne oznaczanie ilościowe metabolitów i wbudowania izotopowego w poszczególne gatunki metabolitów w przypadku pojedynczych osobników. Badaliśmy populacje nicieni obejmujące 1 000 zwierząt na eksperyment, co w naszym odczuciu pozwalało na wiarygodną detekcję metabolitów o niskiej zawartości w każdym szczepie. Jednak niektóre metabolity, takie jak GABA, mogą być wiarygodnie oznaczone ilościowo jedynie w znacznie większych populacjach nicieni, rzędu 1x10⁶ zwierząt⁴.

Podsumowując, profilowanie izotopów stabilnych stanowi nieinwazyjne i bezpieczne (niereaktywne radiologicznie) podejście, które od dawna jest wykorzystywane do badania wrodzonych błędów metabolizmu. Zastosowanie tej metodologii w odniesieniu do C. elegans umożliwia nowatorskie badanie in vivo i w czasie rzeczywistym zmian metabolicznych zachodzących w całym organizmie zwierzęcia, które mogą wynikać z poszczególnych zaburzeń genetycznych i/lub ekspozycji na środki farmakologiczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S. basal		1 - strona 59	Protokoły A i B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protokół B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protokoły A i C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protokół B
Agar NGM	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protokoły A, B i C
13C glukoza (uniwersalnie znakowana)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protokoły A i C
13C glukoza (znakowana w pozycjach 1,6)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protokół B
60% kwas perchlorowy (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protokoły A i B
ε-kwas aminokapronowy (standard wewnętrzny)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protokoły A i B
MTBSTFA	Regis	270243	Protokół E
Acetonitryl	Regis	270010	Protokół E
Żywica AG 1-X8, 100-200, w formie chlorkowej	Bio-Rad	140-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja kwasów organicznych)
Żywica AG 50W-X8, 100-200, w formie wodorowej	Bio-Rad	142-1441	Protokoły A i B (ekstrakcja aminokwasów)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protokół C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protokół C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół A
0,1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protokół D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protokół D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protokoły A i B
Woda dejonizowana	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protokół D
Hel	Airgas	24001364	Protokół C2
Stereomikroskop SMZ-800 Zoom	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protokoły A, B i C
Miernik pH	Fisher Scientific	S68167	Protokoły A i B
Wirówka stołowa - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protokoły A i B
Inkubowany wstrząsacz platformowy	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protokół B
Rotator Mini LabRoller	Labnet International	H-5500	Protokoły A i B
Tłuczki	Kontes Corp	K749520-0090	Protokoły A i B
Wiertarka	Kontes Corp	K749540-0000	Protokoły A i B
Zlewka szklana 1 L	Fisher Scientific	02-539P
Kolby Erlenmeyera 1 L	VWR international	89000-368
Kolby Erlenmeyera 25 mL	VWR international	89000-356	Protokół B
Szklane probówki okrągłodenne 7 ml + gumowy korek	VWR international	VT6431	Protokoły A, B oraz C1, C2
Szklane probówki okrągłodenne 10 ml + gumowy korek	VWR international	VT6430	Protokół C2
Probówki z niebieską zakrętką	Labco	438B
Stożkowe plastikowe probówki 50 ml	Falcon BD	14-959-49A	Wszystkie protokoły
Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml	Fisher Scientific	02-681-320	Protokoły A i B
Strzykawki (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protokoły C1 i C2
Igły 25 G	Fisher Scientific	22-253-131	Protokoły C1 i C2
Kolumny chromatograficzne Poly-Prep	Bio-Rad	731-1550	Protokół D
Pipety Pasteura	VWR international	14673-043	Protokół D
Szalki Petriego 60 mm	VWR international	25373-085	Protokół C
Komora szklana (odcięte dno kolby 1 L) wyposażona w uszczelniony smarem kurek trójdrożny	Wykonanie na zamówienie		Protokół C
Optycznie przezroczysta płyta szklana	Wykonanie na zamówienie		Protokół C
Odparowacz Reacti-Vap III	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protokół D
Wata	VWR international	14224-516	Protokół D
Smar do wysokiej próżni	Dow Corning	1597418	Protokół C1
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	01-213-18	Protokół B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protokół C
Spektrometr mas z pomiarem stosunku gazów	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protokół D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protokół D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protokół D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protokół D