Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

Podsumowanie

Przesiewowe poszukiwanie mutantów z defektami fenotypowymi jest prostą metodą identyfikacji genów funkcjonujących w danym procesie biologicznym. W niniejszym artykule opisujemy sposób hodowli wolnożyjących nicieni (np. Pristionchus pacificus) w warunkach laboratoryjnych i przedstawiamy dwie różne metody mutagenezy: EMS oraz TMP/UV.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje procedury utrzymywania nicieni w laboratorium oraz sposób ich mutagenizacji przy użyciu dwóch alternatywnych metod: siarczanu etylometanosulfonianu (EMS) oraz 4, 5', 8-trimetylopsoralenu w połączeniu ze światłem ultrafioletowym (TMP/UV). Nicienie stanowią potężne systemy biologiczne do badań genetycznych ze względu na prostą budowę ciała i system rozrodu, składający się z samopłodnych hermafrodytów oraz samców, którzy mogą generować setki potomstwa na jedną osobnik. Nicienie są utrzymywane na płytkach agarowych zawierających trawnik bakterii i mogą być łatwo przenoszone z jednej płytki na drugą za pomocą igły do przenoszenia. EMS jest czynnikiem alkilującym powszechnie stosowanym do indukowania mutacji punktowych i małych delecji, podczas gdy TMP/UV indukuje głównie delecje. W zależności od stosowanego gatunku nicienia, stężenia EMS i TMP będą wymagały optymalizacji. W celu wyizolowania mutacji recesywnych u nicienia Pristionchus pacificus, osobniki generacji F2 poddano wizualnej ocenie fenotypowej. Aby zilustrować te metody, przeprowadzono mutagenizację nicieni i wyszukano mutanty Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) oraz Transformer (Tra).

Protokół

Część 1: Przygotowanie szalek Petri z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)

Nematody eksperymentalne, takie jak C. elegans i P. pacificus, są zazwyczaj hodowane w laboratorium na płytkach Petriego o średnicy 6 cm zawierających pożywkę NGM (Nematode Growth Medium) ¹. Nicienie są utrzymywane w temperaturze 20°C, ale mogą być inkubowane w różnych zakresach temperatur (od 4°C do 25°C), w zależności od gatunku nematody i projektu eksperymentalnego. Do przygotowania płytek z NGM należy zastosować standardowe techniki sterylizacji, aby zapobiec kontaminacji grzybiczej i bakteryjnej. Poniżej przedstawiono protokół przygotowania płytek NGM:

1. Odważ 15 g agaru, 2,4 g NaCl, 2 g tryptonu oraz 2,72 g KH2PO4₂PO₄ w kolbie stożkowej o pojemności 2 L dopełnić objętość do 1 L wodą, wysterylizować w autoklawie i pozwolić ostygnąć do 60° C w łaźni wodnej.
2. Dodać po 0,8 ml 1 M CaCl2₂, cholesterol (5 mg/ml w etanolu) oraz 1 M MgSO4₄Aby zapobiec kontaminacji grzybiczej i bakteryjnej, do każdego litra pożywki można dodać 1 ml streptomycyny (100 mg/ml) oraz 1 ml nystatyny (10 mg/ml).
3. Przy użyciu urządzenia Unispense i z zachowaniem warunków sterylnych, rozlej pożywkę do odpowiednich płytek. Płytki należy wypełnić do około 2/3 objętości.^rd pełne. Standardowa płytka o średnicy 60 mm wymaga około 10 ml pożywki. Nie należy przesuwać płytek do czasu całkowitego zżelowania agaru; w przeciwnym razie powierzchnia agaru będzie nierówna, co utrudni ustawienie ostrości na nicieniach w stereomikroskopie.
4. Po wyschnięciu płytki można zasiewać natychmiast lub przechowywać w 4° C do momentu zaszczepienia bakteriami.

Część 2: Przygotowanie bakterii OP50 i wysiewanie szalek Petriego z pożywką NGM

P. pacificus jest hodowany w laboratorium poprzez karmienie szczepem E.coli OP50. OP50 wykazuje ograniczony wzrost na płytkach NGM, tworząc tym samym cienki trawnik, co ułatwia wizualizację nicieni¹. Aby wyhodować kulturę OP50, należy użyć pożywki LB-broth:

1. Do butelki z zakrętką o pojemności 500 ml dodać 5 g baktotryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego oraz 2,5 g NaCl, uzupełnić objętość do 500 ml wodą destylowaną i wysterylizować w autoklawie.
2. W warunkach sterylnych zaszczepić pożywkę pojedynczą kolonią OP50 z płytki hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37° C.
3. LB-OP50 jest gotowy do użycia i może być przechowywany w temperaturze 4° C przez kilka miesięcy, pod warunkiem zachowania sterylności. W celu zaszczepienia płytek należy przelać niewielką ilość pożywki do małego sterylnego zlewka, co zapobiegnie zanieczyszczeniu kultury wyjściowej.
4. Aby zaszczepić płytki, nanieść 100-120 μl OP50 na płytkę Petri z podłożem NGM o średnicy 60 mm i zamieszać okrężnymi ruchami w celu rozprowadzenia zawiesiny.
5. Inkubować zaszczepione płytki przez noc w temperaturze pokojowej do czasu wyrośnięcia trawnika bakterii. Tak przygotowane płytki można przechowywać w temperaturze 4° C do 3 tygodni. Przechowywanie ich w pozycji odwróconej zapobiega szybkiemu wysychaniu.

Część 3: Wybór kolonii

W tej sekcji opisujemy, jak przygotować igłę do przenoszenia nicieni. Igła służy do przenoszenia nicieni z jednego miejsca w drugie. Jest ona wykonana z drutu 30 gauge składającego się z 90% platyny i 10% irydu, choć niektórzy badacze mogą preferować nieco inne składy metali:

1. Odciąć około 3-4 cm drutu, wprowadzić 0,5 cm drutu do końcówki pipety Pasteura (której końcówkę wcześniej skrócono), a następnie stopić szkło nad palnikiem Bunsena, aby utrwalić drut. Długość drutu wystającego ze szkła powinna wynosić około 3-3,5 cm, jednak może być dostosowana do indywidualnych preferencji.
2. Spłaszczyć wystający koniec drutu za pomocą młotka lub szczypiec. Następnie zagiąć spłaszczoną część ku górze, tworząc czerpak.
3. Wygładzić ostre krawędzie narzędzia papierem ściernym, aby zapobiec uszkodzeniu nicieni lub agaru.

Część 4: Wybieranie nicieni

1. Aby pobrać nicienie, wysterylizować drucik platynowy w płomieniu, a następnie przesunąć spłaszczoną końcówkę pęsety wzdłuż trawnika bakteryjnego, aby pokryć ją grubą warstwą lepkich bakterii, uważając, by nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni agaru.
2. Korzystając ze stereomikroskopu, bardzo delikatnie dotknąć lepki końcówką nicnia lub nicieni przeznaczonych do pobrania, aż przykleją się oni do bakterii na pęsecie.
3. Gdy nicień znajdzie się na końcówce pęsety, należy go bezzwłocznie przenieść na nową płytkę, dotykając lub przesuwając końcówkę pęsety po trawniku bakteryjnym nowej płytki, co powinno spowodować zejście nicienia z narzędzia. Należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni agaru na płytce, w przeciwnym razie nicienie mogą wpełznąć w otwory, co utrudni ich późniejsze odzyskanie. Jeśli nicień pozostanie na pęsecie zbyt długo, może ulec wysuszeniu.

Część 5: Mutageneza za pomocą EMS

Metanosulfonian etylu (EMS) indukuje szerokie spektrum mutacji w genomie 2. Mutanty można zidentyfikować na podstawie takich defektów jak zaburzenia składania jaj, wady mięśniowe, nieprawidłowości w determinacji płci, tworzenie postaci dauer, zmiany w zachowaniu oraz wady formowania gonad. Protokół mutagenezy EMS jest podobny do opisanego dla C. elegans ¹.

1. Przygotować 500 ml (lub więcej) 1N NaOH.
2. Pobrać 4-5 szalek Petri o średnicy 6 cm wypełnionych nicieniami, zawierających kilkaset osobników w trzecim stadium larwalnym (J3), i zmyć nicienie, używając 2-3 ml sterylnego M9 na szalkę.
3. Zebrać wszystkie nicienie do sterylnej, jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 1500 x g przez 5-7 minut lub do momentu utworzenia osadu z nicieni.
4. Odssać ciecz i użyć 2 ml M9 do ponownego zawieszenia nicieni. Dodać 20 μl EMS do probówki zawierającej 2 ml M9 i wstrząsnąć, aby rozpuścić substancję. Następnie dodać ten roztwór EMS do 2 ml zawiesiny nicieni i delikatnie wymieszać ruchem okrężnym. Końcowe stężenie EMS wyniesie 47 mM. Uwaga: EMS jest bardzo silnym mutagenem i należy z nim pracować w dygestorium. Wszystkie materiały (rękawiczki, pipety, końcówki), które miały kontakt z tym mutagenem, należy potraktować 1N NaOH w celu inaktywacji EMS. Przez cały czas trwania procedury mutagenezy EMS należy nosić podwójne rękawiczki. Odpady niebezpieczne należy utylizować zgodnie z wytycznymi danej instytucji.
5. Umieścić probówkę wirówkową i zabezpieczyć zakrętkę parafimem; położyć probówkę poziomo w dygestorium i inkubować nicienie przez 3,5 godziny. Probówkę można również umieścić na wstrząsarce o niskiej prędkości.
6. Obrócić probówkę i zabezpieczyć zakrętkę parafimem; ustawić w pozycji pionowej i inkubować do czasu opadnięcia nicieni na dno.
7. Odssać nadosad i wylać go do zlewki/kolby zawierającej 1N NaOH. Pozwoli to na inaktywację EMS.
8. Dodać do nicieni 5 ml M9, odwrócić probówkę 25-30 razy w celu przemycia nicieni, a następnie wirować przy 1500 x g przez 5-7 minut lub do momentu utworzenia osadu. Odssać nadosad i wylać do zlewki z 1N NaOH.
9. Powtórzyć etap przemywania co najmniej 3 razy.
10. Po ostatnim przemyciu ponowie zawiesić osad z nicieni w minimalnej ilości (~500 μl) M9 i przenieść je pipetą na płytki NGM zawierające trawnik bakterii OP50. Na tym etapie nie ma już konieczności pracy w dygestorium.
11. Pozostawić ciecz do wyschnięcia przez kilka minut, a następnie wybrać i przenieść zdrowe larwy J4 na świeżo zaszczepione płytki. Oryginalną płytkę należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
12. Pozostawić zmutagenizowane nicienie do samodyzapłodnienia. Używając stereomikroskopu, przesiewać fenotypy pokolenia F2 w celu znalezienia interesujących mutantów recesywnych.

Część 6: Mutageneza psoralenowa

W tej sekcji opisujemy procedurę mutagenezy z użyciem TMP w połączeniu z długofalowym promieniowaniem ultrafioletowym (UV). Metoda mutagenezy TMP/UV jest szeroko stosowana do indukowania mutacji delecyjnych w genomie ³.

1. Zebrać nicienie z szalek Petri o średnicy 6 cm (4-5 szalek) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, zgodnie z opisem w poprzedniej procedurze.
2. Dodać 10 ml buforu M9, odwrócić probówkę 20 razy w celu przemycia nicieni, a następnie wirować przy 1500 x g przez 5 minut. Odlać nadsącz i powtórzyć przemywanie łącznie 3 razy. Odessać ciecz i zawiesić nicienie ponownie w objętości buforu M9 około 10-krotnie przekraczającej ich objętość, zawierającej 30 μg/ml TMP. Do 2 ml buforu M9 pipetować 20 μl TMP (3 mg/ml). Podobnie jak EMS, TMP jest silnym kancerogenem i musi być obsługiwany z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa. Aby zapobiec potencjalnemu ryzyku związanemu z promieniowaniem UV, należy stosować odpowiednie okulary ochronne. Materiały jednorazowe należy utylizować w odpowiednich workach na odpady biologiczne.
3. Inkubować probówkę w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wolnoobrotowym wytrząsarce (40 UPM). Postawić zakrytą probówkę pionowo na 10 minut, aby wszystkie nicienie opadły na dno.
4. Zebrać nicienie z dna probówki za pomocą pipety Pasteura i przenieść je na nieobsianą płytkę NGM. Nadsącz należy zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi niebezpiecznych substancji chemicznych.
5. Przechowywać płytkę w ciemności do czasu wchłonięcia nadmiaru TMP przez podłoże.
6. Używając miernika natężenia UV, ustawić odległość między źródłem długofalowego promieniowania UV a płytką tak, aby natężenie na płytce wynosiło 500 μW/cm^{2 4}. Zdjąć osłonę aluminiową oraz pokrywkę i naświetlać płytkę z nicieniami traktowanymi TMP długofalowym promieniowaniem UV przez 50 sekund.
7. Przykryć i pozostawić nicienie w ciemności na 5 godzin w temperaturze pokojowej.
8. Wybrać i przenieść zdrowe larwy J4 na świeżo obsiane płytki. Oryginalną płytkę należy zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi niebezpiecznych substancji chemicznych.
9. Używając stereomikroskopu, przesiewać fenotypy pokolenia F2 w celu znalezienia poszukiwanej mutacji.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

Niektóre fenotypy mutantów P. pacificus powstałe w wyniku mutagenezy (zarówno przy użyciu EMS, jak i TMP/UV) przedstawiono na rysunku 1. Każdy mutant posiada charakterystyczny fenotyp, który jest łatwo odróżnialny od zwierzęcia typu dzikiego. Z nicieni poddanych działaniu mutagenu wybrano 30 larw J3/J4 z pokolenia rodzicielskiego (P0), które umieszczono na oddzielnych szalkach i pozostawiono do zniesienia jaj, stanowiących pokolenie F1. Z szalek, na których pojawiło się zdrowe potomstwo F1, łącznie 1000 osobników F1 przeniesiono na indywidualne szalki, a następnie przesiewano potomstwo F2 pod kątem fenotypów. Znaleziono zwierzęta o fenotypach Dumpy ^5,6, Uncoordinated⁶ oraz Transformer⁷.

Rycina 1. Pristionchus pacificus zwierzęta typu dzikiego i mutanty. A. hermafrodyta typu dzikiego B. samiec typu dzikiego C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutanta. Dwa górne panele przedstawiają zwierzęta typu dzikiego: hermafrodytę (po lewej) i samca (po prawej), w celu porównania z różnymi mutantami na pozostałych panelach.

Dyskusja

Mutageneza jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach genetycznych u różnych organizmów modelowych. Eksperymenty z mutagenezą są często wykorzystywane do identyfikacji funkcji genu². Opisane tutaj procedury mutagenezy mogą być stosowane nie tylko w przypadku P. pacificus, ale także dla C. elegans i innych pokrewnych gatunków nicieni. W niniejszym opracowaniu opisujemy dwie metody: mutagenezę EMS oraz TMP/UV.

EMS jest związkiem chemicznym, który indukuje mutac...