Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.
Artykuł metodologiczny
Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sepsis pozostaje uporczywym problemem na oddziałach intensywnej terapii na całym świecie. Zrozumienie złożonych mechanizmów sepsy jest warunkiem wstępnym do opracowania nowych podejść terapeutycznych w tej dziedzinie. Dlatego wymagane są modele zwierzęce, które są w stanie ściśle naśladować ludzką chorobę i jednocześnie w wystarczającym stopniu odpowiadać na pytania naukowe. Model stentowania okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce zestandaryzowanym modelem polimikrobiologicznej sepsy brzusznej u gryzoni. W tym modelu niewielki stent jest chirurgicznie wprowadzany do okrężnicy wstępującej myszy lub szczurów, co prowadzi do ciągłego wycieku bakterii jelitowych do jamy otrzewnej. Procedura ta skutkuje zapaleniem otrzewnej, systemową bakteriemią, zakażeniem narządów przez bakterie jelitowe oraz ogólnoustrojowym i miejscowym uwalnianiem kilku cytokin pro- i przeciwzapalnych. Śmiertelność w modelu CASP można kontrolować poprzez średnicę wprowadzonego stentu. Wariant tego modelu, tzw. CASP z interwencją (CASPI), daje możliwość usunięcia ogniska septycznego podczas drugiej operacji, zgodnie z powszechnymi procedurami w praktyce klinicznej. CASP jest łatwym do opanowania i wysokoreprodukowalnym modelem, który ściśle naśladuje kliniczny przebieg sepsy brzusznej. Umożliwia on prowadzenie badań nad zagadnieniami w kilku dziedzinach nauki, np. immunologii, infekcjologii czy chirurgii.
Protokół
1. Przygotowanie myszy
- Zanieść mysz pod narkozę poprzez doszpikowe podanie płynu znieczulającego (patrz tabela odczynników) i ułożyć ją w pozycji grzbietowej.
- Stopy myszy należy przymocować do płytki za pomocą taśmy, aby zapewnić stabilną pozycję zwierzęcia podczas zabiegu.
2. Obsługa
- Użyć kaniuli dożylnej, powszechnie stosowanej do iniekcji i.v. u ludzi, i naciąć jej plastikową rurkę w poprzek, 2 mm od końcówki. Aby kontrolować wskaźnik śmiertelności, stosujemy trzy różne rozmiary kaniul (BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80 mL/min); 16GA (1,7x45mm, 180 mL/min); 14GA (2,0x45mm, 270 mL/min)).
- Po dokładnej dezynfekcji skóry brzucha wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej na długości około 15 mm. Otworzyć jamę otrzewnową, nacinając mięśnie brzucha i otrzewną wzdłuż białej linii brzucha.
- Zidentyfikować biegun kątnicy i ostrożnie wyciągnąć kątnicę, końcowy odcinek jelita krętego oraz okrężnicę wstępującą z jamy brzusznej przy użyciu tamponów bawełnianych.
- W odległości 15 mm dystalnie od zastawki ileocekalnej należy przebić ścianę okrężnicy wstępującej szwem 7/0. Należy przy tym unikać uszkodzenia naczyń jelitowych. Szew należy przymocować do ściany okrężnicy za pomocą dwóch węzłów chirurgicznych.
- Następnie nakłuć okrężnicę wstępującą przygotowaną kaniulą 1-2 mm proksymalnie od szwu 7/0. Ostrożnie wprowadzić kaniulę do jelita, aż wycięcie w plastikowej rurce znajdzie się na poziomie błony surowiczej.
- Obwinąć wolne końce szwu 7/0 wokół kaniuli i zawiązać podwójny węzeł dokładnie w przygotowanym wycięciu plastikowej rurki.
- Teraz, za pomocą igły szwu 7/0, przeszyć antymezynteryczną ścianę jelita. Następnie wykonać dwa węzły chirurgiczne, aby dodatkowo przymocować plastikową rurkę do ściany okrężnicy. Odciąć końce szwu.
- Lekko wysunąć metalową część kaniuli i odciąć plastikową rurkę blisko (1 mm) mocującego szwu 7/0.
- Następnie należy ostrożnie przesuwać kał z kątnicy w stronę stentu jelitowego za pomocą tamponów bawełnianych, aż na szczycie stentu pojawi się niewielka ilość treści kałowej.
- Wprowadzić jelito z powrotem do jamy otrzewnowej i przeprowadzić resuscytację płynową poprzez domięśniowe podanie 0,5 mL roztworu soli fizjologicznej.
- Zamknąć otrzewną szwem ciągłym (4/0).
- Zamknąć skórę szwami przerywanymi (4/0).
3. Opieka pooperacyjna
- Umieść zwierzę z powrotem w klatce, która powinna zawierać odpowiednią ilość pożywienia i wody. W celu zapewnienia analgesji należy regularnie podawać doćmięśnnie silny środek przeciwbólowy (stosujemy buprenorfinę).
- W ciągu pierwszych dwóch dni po operacji zwierzęta należy kontrolować co 6 godzin.
4. Pozorna procedura CASP
- Wykonaj kroki od 1.1 do 2.4.
- Nie przebijaj jelita grubego. Wykonaj jedynie kroki od 2.6 do 2.8.
- Wykonaj kroki od 2.10 do 3.2.
5. CASPI
- Wykonaj CASP przy użyciu kaniuli 14G zgodnie z krokami 1.1-3.1
- 5h po CASP należy ponownie poddać zwierzę operacji. Ponownie przygotuj i znieczul mysz zgodnie z krokami 1.1-1.2
- Rozepnij szwy na ścianie brzucha.
- Wyciągnij wstępującą część okrężnicy z wprowadzonym stentem.
- Ostrożnie przetnij szwy mocujące stent i usuń stent.
- Zamknij ubytek w okrężnicy za pomocą pojedynczych szwów wywijających (7/0).
- Wprowadź jelito z powrotem do jamy brzusznej i przepłucz ją dwukrotnie 10 mL roztworem soli fizjologicznej.
- Zamknij otrzewną szwem ciągłym (4/0).
- Zamknij skórę pojedynczymi szwami (4/0).
- Postępuj zgodnie z krokami 3.1-3.2
6. Reprezentatywne wyniki
W ciągu kilku godzin po operacji u zwierząt pojawiają się kliniczne objawy początkowej sepsy. Typowe objawy choroby to ograniczona ruchomość, zjeżona sierść, pocenie się, zmniejszony pobór pokarmu, utrata masy ciała, a także zredukowany odruch ucieczki. Zwierzęta, u których rozwija się ciężkie zapalenie otrzewnej z następczą infekcją systemową, zazwyczaj giną w ciągu 48 h. W zależności od rozmiaru wprowadzonego stentu można uzyskać różne wskaźniki śmiertelności. Stent 14G skutkuje 100% śmiertelnością, 16G daje 70% śmiertelności, a wskaźnik śmiertelności na poziomie 50% można osiągnąć stosując stent 18G (Rycina 1a). Operacja pozorowana (Sham) skutkuje 100% przeżywalnością. Zazwyczaj wszystkie zwierzęta giną w ciągu pierwszych 48 godzin po CASP. W związku z tym wszystkie zwierzęta żyjące w tym punkcie czasowym można uznać za ocalałe. Zalecamy jednak dodatkowy okres obserwacji trwający co najmniej 72 godziny, aby wykryć rzadkie „późne zgony” po CASP.
Wynik CASPI zależy od czasu, który upłynął od CASP do momentu usunięcia stentu. Interwencja przeprowadzona 3h po CASP skutkuje przeżywalnością na poziomie 45%. Jeśli stent zostanie usunięty 5h po CASP, procedurę przeżywa jedynie 10% zwierząt. Usunięcie stentu po 9h skutkuje 100% śmiertelnością (Rycina 1b). Sham CASPI prowadzi do 100% przeżywalności. W przypadku ustawień CASPI zalecamy okres obserwacji trwający 10 dni, ponieważ zazwyczaj zdarzają się zwierzęta, które giną później niż 48 godzin po CASP.
Makroskopowa ocena ułożenia narządów jamy brzusznej 24 godziny po CASP wykazuje typowe objawy zapalenia otrzewnej: obrzęk, wazodylatację, rumień ściany jelita, wyraźne odgraniczenie kępek Peyera, porażenie jelit, wolny płyn oraz wydzielinę ropną (Rysunek 2).
Zakażenie systemiczne można wykazać za pomocą analizy bakteriologicznej. 12 godzin po CASP w płukaninach otrzewnowych, krwi, wątrobie, płucach, śledzionie i nerkach można wykryć masywne ilości bakterii. Analiza jakościowa bakterii wykazuje zakażenie systemiczne typowymi bakteriami jelitowymi, takimi jak E. coli, gatunki z rodzaju bacteroides, gatunki z rodzaju enterococcus itd. (Rysunek 3).
Sepsa indukowana przez CASP objawia się lokalnym oraz systemowym uwalnianiem cytokin i chemokin pro- i przeciwzapalnych. 12 godzin po CASP, za pomocą metody ELISA w krwi, a także w supernatantach zawiesin narządowych, np. wątroby, płuc, śledziony i nerek, można zmierzyć znaczne ilości TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 oraz innych (Ryc. 4).
Podczas wdrażania CASP w laboratorium, wskaźniki przeżywalności, badania bakteriologiczne oraz uwalnianie cytokin powinny zostać przyjęte jako parametry kontrolne prawidłowego przebiegu CASP. W późniejszym etapie parametry te mogą służyć jako standardowy system odczytu dla wszystkich układów eksperymentalnych.
Rycina 1a: Przeżywalność po CASP. Wskaźniki przeżywalności po operacji CASP zależą od średnicy wprowadzonego stentu. W przypadku CASP 14G śmiertelność wynosi 100%, przy CASP 16G śmiertelność wynosi 70%, a CASP 18G prowadzi do 50% śmiertelności. Zabieg sham CASP wiąże się ze 100% przeżywalnością. n=20/grupa. B: Wskaźniki przeżywalności po operacji CASPI zależą od czasu usunięcia stentu. Usunięcie stentu 3h po CASP 14G prowadzi do 55% śmiertelności. Usunięcie stentu 5h po CASP 14G skutkuje 90% śmiertelnością, natomiast usunięcie stentu 9h po CASP 14G skutkuje 100% śmiertelnością. Zabieg sham CASPI (5h) skutkuje 100% przeżywalnością. n=10/grupa (Sham CASPI; CASPI 9h), n=20/grupa (3h CASPI; 5h CASPI).
Rysunek 2: Położenie organów jamy brzusznej 24h po CASP. Ścianę brzucha usunięto odpowiednio 24h po CASP (igła 16G) lub zabiegu sham CASP. Położenie organów u myszy poddanej zabiegowi sham wygląda fizjologicznie. W przeciwieństwie do tego, CASP prowadzi do obrzęku, przekrwienia, rozszerzenia jelit oraz uwidocznienia kępek Peyera, co świadczy o ciężkim zapaleniu otrzewnej.
Rysunek 3: Bakteriologia. CASP prowadzi do ciężkiej infekcji kilku przedziałów i narządów bakteriami jelitowymi w ciągu 12h po operacji. Liczbę bakterii podano odpowiednio jako jednostki tworzące kolonie (cfu) na mL. Hodowle bakteryjne pobrane od myszy poddanych operacji pozorowanej były całkowicie jałowe (nie pokazano). 16G CASP, n=5/grupa.
Rysunek 4: Cytokiny. CASP wywołuje systemową odpowiedź immunologiczną, w wyniku czego w osoczu oraz w nadsączach z organów wykrywalnych jest kilka cytokin i chemokin. Na rysunku przedstawiono przykładowo cytokiny prozapalne: czynnik martwicy nowotworów (TNF) i interleukinę-6 (IL-6), a także głównie przeciwzapalną IL-10. 12h po CASP w osoczu, wątrobie, płucach i śledzionie można wykryć znaczące poziomy tych cytokin. Jednakże po CASP w płucach i śledzionie nie udaje się wykryć IL-10. Operacja pozorowana (sham) nie prowadzi do wydzielania cytokin (nie pokazano). 16G CASP, n=5/grupa.
Dyskusja
CASP jest polimikrobowym modelem sepsy brzusznej, który spełnia większość kryteriów postulowanych dla wartościowego modelu sepsy: CASP można przeprowadzić u małych zwierząt, jest on wysoce powtarzalny, łatwy do monitorowania za pomocą standardowych parametrów, zapewnia dobre możliwości odczytu wyników i ściśle naśladuje warunki kliniczne sepsy brzusznej. W badaniu porównawczym wykazaliśmy, że CASP prowadzi do rozlanego zapalenia otrzewnej z wczesną i stale narastającą infekcją oraz stanem zapalnym układowym (zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej), podczas gdy podwiązanie i nakłucie kątnicy (CLP) stanowi model tworzenia się ropnia wewnątrzbrzusznego z utrzymującymi się, lecz niewielkimi objawami zapalenia układowego (1). Technika CASPI daje możliwość symulacji przebiegu klinicznego zapalenia otrzewnej z następującym po nim chirurgicznym oczyszczeniem ogniska zapalnego, co jest najważniejszą zasadą terapeutyczną u ludzi. CASP może być stosowany we wszystkich zagadnieniach dotyczących sepsy lub zapalenia otrzewnej i jest zatem przydatny dla wszystkich dyscyplin zajmujących się badaniami nad sepsą, na przykład immunologii, farmakologii, chirurgii, medycyny intensywnej terapii itp. Poniżej przedstawiono wybór publikacji dotyczących różnych aspektów sepsy z wykorzystaniem modelu CASP (1-14).
Rozpoczynając pracę z CASP, należy mieć świadomość, że do precyzyjnego i szybkiego wykonania tej procedury niezbędna jest praktyka. Doświadczenie chirurgiczne może być pomocne, ale nie jest wymagane. Jako parametr poprawnego wykonania CASP zalecamy monitorowanie śmiertelności. Należy zacząć od CASP 14G, ponieważ większy stent jest łatwiejszy w obsłudze niż cieńszy. Przeszkolony chirurg wykonujący CASP jest w stanie zoperować jedną mysz w ciągu 10 minut. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów należy upewnić się, że osiąga się zbliżony czas operacji. Po zdobyciu doświadczenia w procedurze chirurgicznej należy przeprowadzić analizę kinetyki przeżywalności w celu sprawdzenia swoich umiejętności. CASP 14G powinien skutkować 100% śmiertelnością. Osoby początkujące w naszym laboratorium muszą udowodnić, że są w stanie uzyskać 100% śmiertelności przy użyciu CASP 14G, zanim przystąpią do eksperymentów. Dodatkowo należy przeprowadzić badania bakteriologiczne oraz pomiary cytokin w celu weryfikacji sepsy. Jeśli na początku pojawiają się problemy z mikrosurgicalnymi etapami CASP, pomocne może być zastosowanie okularów powiększających lub mikroskopu chirurgicznego. Co do zasady jednak CASP można prawidłowo wykonać bez tych narzędzi. Aby powtórzyć nasze wskaźniki przeżywalności, absolutnie konieczne jest zastosowanie tych samych materiałów, a w szczególności tych samych stentów (BD Venflon, patrz poniżej). W przeciwnym razie możliwe są znaczne rozbieżności w wynikach. Dodatkowo sugerujemy, że wyniki mogą się różnić w zależności np. od indywidualnych predyspozycji chirurga, jednak wpływ takich czynników powinien być niewielki.
Podsumowując, CASP jest praktycznym, prostym, powtarzalnym i wartościowym modelem sepsy, który ściśle odzwierciedla sytuację kliniczną sepsy brzusznej. Jest on zatem odpowiedni dla wszystkich dziedzin badań nad sepsą.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Nico Zantlowi, Klausowi Pfefferowi i Bernhardowi Holzmannowi. Badanie to było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, Niemcy (GRK-840; Vo 450/10-1).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płyn narkotyczny | Wymieszać 0,5 mL Rompun z 4,0 mL Ketanest i dodać 5,5 mL roztworu soli fizjologicznej (0,9%). W celu uzyskania pełnej anestezji wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μL/g masy ciała | ||
| Rompun (20 mg/ml Xylazine) | Bayer AG | ||
| Ketanest (25mg/ml Esketamine) | Pfizer Pharma GmbH | 647028001E | |
| BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min) | BD Biosciences | 391457 | |
| BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min) | BD Biosciences | 391455 | |
| BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min) | BD Biosciences | 391456 | |
| Catgut poliestrowy 4/0 biały, niewchłanialny | Catgut GmbH | 17218113 | |
| Mariderm czarny 7/0, niewchłanialny | Catgut GmbH | 18104900 |
Bibliografia
- Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock. 21, 505-511 (2004).
- Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e, Buys, E. S., Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock. , (2009).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R. S., Schutt, C., Heidecke, C. D., Maier, S., Broker, B. M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut. 57, 188-195 (2008).
- Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. J., Ulevitch, R., Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol. 179, 6107-6114 (2007).
- Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S., Heidecke, C. D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis. 21, 64-70 (2006).
- Kerschen, E. J., Fernandez, J. A., Cooley, B. C., Yang, X. V., Sood, R., Mosnier, L. O., Castellino, F. J., Mackman, N., Griffin, J. H., Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J Exp Med. 204, 2439-2448 (2007).
- Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C. D., Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med. 35, 2352-2358 (2007).
- Lustig, M. K., Bac, V. H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C. D., Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock. 28, 59-64 (2007).
- Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).
- Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. van, Heidecke, C. D., Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration. 77, 203-213 (2009).
- Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).
- Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).
- Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).
Przedruki i uprawnienia
