Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej

Podsumowanie

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.

Streszczenie

Sepsis pozostaje uporczywym problemem na oddziałach intensywnej terapii na całym świecie. Zrozumienie złożonych mechanizmów sepsy jest warunkiem wstępnym do opracowania nowych podejść terapeutycznych w tej dziedzinie. Dlatego wymagane są modele zwierzęce, które są w stanie ściśle naśladować ludzką chorobę i jednocześnie w wystarczającym stopniu odpowiadać na pytania naukowe. Model stentowania okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce zestandaryzowanym modelem polimikrobiologicznej sepsy brzusznej u gryzoni. W tym modelu niewielki stent jest chirurgicznie wprowadzany do okrężnicy wstępującej myszy lub szczurów, co prowadzi do ciągłego wycieku bakterii jelitowych do jamy otrzewnej. Procedura ta skutkuje zapaleniem otrzewnej, systemową bakteriemią, zakażeniem narządów przez bakterie jelitowe oraz ogólnoustrojowym i miejscowym uwalnianiem kilku cytokin pro- i przeciwzapalnych. Śmiertelność w modelu CASP można kontrolować poprzez średnicę wprowadzonego stentu. Wariant tego modelu, tzw. CASP z interwencją (CASPI), daje możliwość usunięcia ogniska septycznego podczas drugiej operacji, zgodnie z powszechnymi procedurami w praktyce klinicznej. CASP jest łatwym do opanowania i wysokoreprodukowalnym modelem, który ściśle naśladuje kliniczny przebieg sepsy brzusznej. Umożliwia on prowadzenie badań nad zagadnieniami w kilku dziedzinach nauki, np. immunologii, infekcjologii czy chirurgii.

Protokół

1. Przygotowanie myszy

1. Zanurz mysz w narkozie poprzez podanie dootrzewnowe płynu znieczulającego (patrz tabela odczynników) i ułóż ją w pozycji grzbietowej.
2. Stopy myszy należy przymocować do płytki za pomocą taśmy, aby zapewnić stabilną pozycję zwierzęcia podczas zabiegu.

2. Obsługa

1. Należy wziąć kaniulę dożylną, powszechnie stosowaną do iniekcji i.v. u ludzi, i naciąć jej plastikową rurkę koliście 2mm od końca. W celu kontrolowania wskaźników śmiertelności stosujemy kaniule o trzech różnych rozmiarach (BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80 mL/min); 16GA (1,7x45mm, 180 mL/min) 14GA (2,0x45mm, 270 mL/min)).
2. Po dokładnej dezynfekcji skóry brzucha należy wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej na długości około 15mm. Otworzyć jamę otrzewnej, nacinając mięśnie brzucha i otrzewną wzdłuż białej linii brzusznej (linea alba).
3. Zidentyfikować biegun kątnicy i ostrożnie wyciągnąć kątnicę, końcowy odcinek jelita krętego oraz okrężnicę wstępującą z jamy brzusznej, używając do tego patyczków bawełnianych.
4. 15mm dystalnie od zastawki kątniczo-krętowej należy przebić ścianę okrężnicy wstępującej szwem 7/0. Należy przy tym unikać uszkodzenia naczyń jelitowych. Szew zostaje utrwalony na ścianie okrężnicy za pomocą dwóch węzłów chirurgicznych.
5. Następnie należy nakłuć okrężnicę wstępującą przygotowaną kaniulą 1-2 mm proksymalnie od szwu 7/0. Ostrożnie wprowadzić kaniulę do okrężnicy, aż wyżłobienie w plastikowej rurce znajdzie się na poziomie błony surowiczej.
6. Wolne końce szwu 7/0 należy owinąć wokół kaniuli i zawiązać podwójny węzeł dokładnie w przygotowanym wyżłobieniu plastikowej rurki.
7. Następnie należy wziąć igłę szwu 7/0 i przeszyć nią antymezentericzną ścianę okrężnicy. Kolejno należy wykonać dwa węzły chirurgiczne, aby dodatkowo utrwalić plastikową rurkę w ścianie okrężnicy. Odciąć końce nici.
8. Należy lekko wysunąć metalową część kaniuli i odciąć plastikową rurkę blisko (1mm) utrwalającego szwu 7/0.
9. Następnie należy ostrożnie „wyżyć” kał z kątnicy w stronę stentu okrężnicy za pomocą patyczków bawełnianych, aż mała ilość kału pojawi się na szczycie stentu.
10. Wprowadzić jelito z powrotem do jamy otrzewnej i przeprowadzić resuscytację płynową poprzeztoreperitonealne podanie 0,5 mL roztworu soli fizjologicznej.
11. Zamknąć otrzewną szwem ciągłym (4/0).
12. Zamknąć skórę szwami pojedynczymi (4/0).

3. Opieka pooperacyjna

1. Umieść zwierzę z powrotem w klatce, w której powinna znajdować się wystarczająca ilość pokarmu i wody. W celu zapewnienia analgezji należy regularnie podawać doćmięśniąnie silny środek przeciwbólowy (stosujemy buprenorfinę).
2. W ciągu pierwszych dwóch dni po operacji należy kontrolować stan zwierząt co 6 godzin.

4. Pozorna procedura CASP

1. Wykonać kroki 1.1-2.4.
2. Nie przebijać okrężnicy. Wykonać jedynie kroki 2.6-2.8.
3. Wykonać kroki 2.10-3.2.

5. CASPI

1. Wykonaj procedurę CASP, używając kaniuli 14G, zgodnie z krokami 1.1-3.1
2. 5h po CASP należy ponownie poddać zwierzę operacji. Ponownie przygotuj i znieczul mysz zgodnie z krokami 1.1-1.2
3. Rozetnij szwy na ścianie brzucha.
4. Wyciągnij okrężnicę wstępującą z wprowadzonym stentem.
5. Ostrożnie przetnij szwy mocujące stent i usuń stent.
6. Zamknij ubytek w okrężnicy pojedynczymi szwami wywijającymi (7/0).
7. Wprowadź jelito z powrotem do jam brzusznej i przepłucz ją dwukrotnie 10 mL roztworu soli fizjologicznej.
8. Zamknij otrzewną szwem ciągłym (4/0).
9. Zamknij skórę pojedynczymi szwami (4/0).
10. Postępuj zgodnie z krokami 3.1-3.2

6. Reprezentatywne wyniki

W ciągu kilku godzin po operacji u zwierząt pojawiają się objawy kliniczne rozpoczynającej się sepsy. Typowe symptomy choroby to zmniejszona ruchliwość, zjeżona sierść, pocenie się, zmniejszone spożycie pokarmu, utrata masy ciała, a także osłabienie odruchu ucieczki. Zwierzęta, u których rozwija się ciężkie zapalenie otrzewnej z następczą infekcją systemową, zazwyczaj giną w ciągu 48h. W zależności od rozmiaru wprowadzonego stentu można uzyskać różne wskaźniki śmiertelności. Stent 14G skutkuje 100% śmiertelnością, 16G daje 70% śmiertelność, a wskaźnik śmiertelności na poziomie 50% można osiągnąć, stosując stent 18G (Rycina 1a). Operacja pozorowana (Sham) skutkuje 100% przeżywalnością. Zazwyczaj wszystkie zwierzęta giną w ciągu pierwszych 48 godzin po CASP. W związku z tym wszystkie zwierzęta żyjące w tym punkcie czasowym można uznać za osobniki, które przeżyły. Zalecamy jednak dodatkowy okres obserwacji wynoszący co najmniej 72 godziny, aby wykryć rzadkie „późne zgony” po CASP.

Wynik CASPI zależy od czasu, jaki upłynął od CASP do momentu usunięcia stentu. Interwencja przeprowadzona 3h po CASP skutkuje przeżywalnością na poziomie 45%. Jeśli stent zostanie usunięty 5h po CASP, procedurę przeżywa jedynie 10% zwierząt. Usunięcie stentu po 9h skutkuje 100% śmiertelnością (Rycina 1b). Zabieg pozorowany (sham CASPI) prowadzi do 100% przeżywalności. W przypadku ustawień CASPI zaleca się 10-dniowy okres obserwacji, ponieważ zazwyczaj zdarzają się zwierzęta, które giną później niż 48 godzin po CASP.

Makroskopowa ocena ułożenia narządów jamy brzusznej 24 godziny po CASP wykazuje typowe objawy zapalenia otrzewnej: obrzęk, rozszerzenie naczyń krwionośnych, rumieniową ścianę jelita, wyraźne odgraniczenie kępek Peyera, porażenie jelit, wolną ciecz oraz wydzielinę septyczną (Rysunek 2).

Zakażenie systemowe można wykazać za pomocą analizy bakteriologicznej. 12 godzin po CASP w płukance otrzewnej, krwi, wątrobie, płucach, śledzionie i nerkach można wykryć masywne ilości bakterii. Analiza jakościowa bakterii wykazuje zakażenie systemowe typowymi bakteriami jelitowymi, takimi jak E. coli, gatunki bacteroides, gatunki enterococcus itp. (Rysunek 3).

Sepsis indukowana przez CASP objawia się miejscowym oraz ogólnoustrojowym uwalnianiem cytokin i chemokin prozapalnych oraz przeciwzapalnych. 12 godzin po CASP, za pomocą testu ELISA, w krwi, a także w supernatantach zawiesin narządowych, np. wątroby, płuc, śledziony i nerek, można zmierzyć znaczne ilości TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 i innych (Ryc. 4).

Podczas wdrażania CASP w laboratorium, wskaźniki przeżywalności, wyniki badań bakteriologicznych oraz uwalnianie cytokin powinny być traktowane jako parametry kontrolne potwierdzające prawidłowe działanie CASP. W dalszej kolejności parametry te mogą służyć jako standardowy system odczytów dla wszystkich ustawień eksperymentalnych.

Rycina 1a: Przeżywalność po CASP. Wskaźniki przeżywalności po zabiegu CASP zależą od średnicy wprowadzonego stentu. CASP 14G skutkuje śmiertelnością na poziomie 100%, CASP 16G skutkuje śmiertelnością 70%, a CASP 18G prowadzi do 50% śmiertelności. Sham CASP wiąże się ze 100% przeżywalnością. n=20/grupa. B: Wskaźniki przeżywalności po zabiegu CASPI zależą od czasu usunięcia stentu. Usunięcie stentu w 3h po CASP 14G prowadzi do śmiertelności na poziomie 55%. Usunięcie stentu w 5h po CASP 14G skutkuje śmiertelnością 90%, natomiast usunięcie stentu w 9h po CASP 14G skutkuje 100% śmiertelnością. Sham CASPI (5h) skutkuje 100% przeżywalnością. n=10/grupa (Sham CASPI; CASPI 9h), n=20/grupa (3h CASPI; 5h CASPI).

Rysunek 2: Położenie narządów jamy brzusznej 24h po CASP. Ścianę brzuszną usunięto odpowiednio 24h po CASP 16G lub pozornej procedurze CASP. Położenie narządów u myszy poddanej operacji pozornej wygląda fizjologicznie. W przeciwieństwie do tego, CASP prowadzi do obrzęku, przekrwienia, rozszerzenia jelit oraz uwidocznienia kępek Peyera, co świadczy o ciężkim zapaleniu otrzewnej.

Rycina 3: Bakteriologia. CASP prowadzi do ciężkiej infekcji kilku przedziałów i narządów przez bakterie jelitowe w ciągu 12 h po operacji. Liczbę bakterii podano odpowiednio jako jednostki tworzące kolonie (cfu) na mL. Kultury bakterii pobrane od myszy z grupy sham są całkowicie sterylne (nie pokazano). 16G CASP, n=5/grupa.

Rysunek 4: Cytokiny. CASP wywołuje systemową odpowiedź immunologiczną, w wyniku czego w plazmie oraz w nadsączach z narządów wykrywalnych jest kilka cytokin i chemokin. Na rysunku przykładowo przedstawiono prozapalne cytokiny: czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukinę-6 (IL-6), a także przede wszystkim przeciwzapalną interleukinę-10 (IL-10). 12h po CASP w plazmie, wątrobie, płucach i śledzionie można wykryć znaczące poziomy tych cytokin. Jednakże po CASP w płucach i śledzionie nie można wykryć IL-10. Operacja pozorowana (sham) nie prowadzi do wydzielania cytokin (nie pokazano). 16G CASP, n=5/grupa.

Dyskusja

CASP jest polimikrobowym modelem sepsy brzusznej, który spełnia większość kryteriów postulowanych dla wartościowego modelu sepsy: CASP można przeprowadzić u małych zwierząt, jest on wysoce powtarzalny, łatwy do monitorowania za pomocą standardowych parametrów, zapewnia dobre możliwości odczytu wyników i ściśle naśladuje warunki kliniczne sepsy brzusznej. W badaniu porównawczym wykazaliśmy, że CASP prowadzi do rozlanego zapalenia otrzewnej z wczesną i stale narastającą infekcją oraz stanem zapalnym układowym (zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej), podczas gdy podwiązanie i nakłucie kątnicy (CLP) stanowi model tworzenia się ropnia wewnątrzbrzusznego z utrzymującymi się, lecz niewielkimi objawami zapalenia układowego (1). Technika CASPI daje możliwość symulacji przebiegu klinicznego zapalenia otrzewnej z następującym po nim chirurgicznym oczyszczeniem ogniska zapalnego, co jest najważniejszą zasadą terapeutyczną u ludzi. CASP może być stosowany we wszystkich zagadnieniach dotyczących sepsy lub zapalenia otrzewnej i jest zatem przydatny dla wszystkich dyscyplin zajmujących się badaniami nad sepsą, na przykład immunologii, farmakologii, chirurgii, medycyny intensywnej terapii itp. Poniżej przedstawiono wybór publikacji dotyczących różnych aspektów sepsy z wykorzystaniem modelu CASP (1-14).

Rozpoczynając pracę z CASP, należy mieć świadomość, że do precyzyjnego i szybkiego wykonania tej procedury niezbędna jest praktyka. Doświadczenie chirurgiczne może być pomocne, ale nie jest wymagane. Jako parametr poprawnego wykonania CASP zalecamy monitorowanie śmiertelności. Należy zacząć od CASP 14G, ponieważ większy stent jest łatwiejszy w obsłudze niż cieńszy. Przeszkolony chirurg wykonujący CASP jest w stanie zoperować jedną mysz w ciągu 10 minut. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów należy upewnić się, że osiąga się zbliżony czas operacji. Po zdobyciu doświadczenia w procedurze chirurgicznej należy przeprowadzić analizę kinetyki przeżywalności w celu sprawdzenia swoich umiejętności. CASP 14G powinien skutkować 100% śmiertelnością. Osoby początkujące w naszym laboratorium muszą udowodnić, że są w stanie uzyskać 100% śmiertelności przy użyciu CASP 14G, zanim przystąpią do eksperymentów. Dodatkowo należy przeprowadzić badania bakteriologiczne oraz pomiary cytokin w celu weryfikacji sepsy. Jeśli na początku pojawiają się problemy z mikrosurgicalnymi etapami CASP, pomocne może być zastosowanie okularów powiększających lub mikroskopu chirurgicznego. Co do zasady jednak CASP można prawidłowo wykonać bez tych narzędzi. Aby powtórzyć nasze wskaźniki przeżywalności, absolutnie konieczne jest zastosowanie tych samych materiałów, a w szczególności tych samych stentów (BD Venflon, patrz poniżej). W przeciwnym razie możliwe są znaczne rozbieżności w wynikach. Dodatkowo sugerujemy, że wyniki mogą się różnić w zależności np. od indywidualnych predyspozycji chirurga, jednak wpływ takich czynników powinien być niewielki.

Podsumowując, CASP jest praktycznym, prostym, powtarzalnym i wartościowym modelem sepsy, który ściśle odzwierciedla sytuację kliniczną sepsy brzusznej. Jest on zatem odpowiedni dla wszystkich dziedzin badań nad sepsą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płyn narkotyczny			Wymieszać 0,5 mL Rompun z 4,0 mL Ketanest i dodać 5,5 mL roztworu soli fizjologicznej (0,9%). W celu uzyskania pełnej anestezji wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μL/g masy ciała
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Bayer AG
Ketanest (25mg/ml Esketamine)	Pfizer Pharma GmbH	647028001E
BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min)	BD Biosciences	391457
BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min)	BD Biosciences	391455
BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min)	BD Biosciences	391456
Catgut poliestrowy 4/0 biały, niewchłanialny	Catgut GmbH	17218113
Mariderm czarny 7/0, niewchłanialny	Catgut GmbH	18104900