Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej techniki
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model mysi transplantacji in utero
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transplantacja komórek macierzystych i wirusów in utero ma ogromny potencjał w leczeniu wad wrodzonych u ludzkiego płodu. Na przykład transplantacja in utero (IUT) hematopoetycznych komórek macierzystych została z sukcesem zastosowana w leczeniu pacjentów z ciężkim złożonym niedoborem odporności.1,2 Jednak w przypadku kilku innych schorzeń próby IUT nie przyniosły sukcesu.3 Biorąc pod uwagę te niejednoznaczne wyniki, dostępność wydajnego modelu pozaludzkiego do badania biologicznych następstw transplantacji komórek macierzystych i terapii genowej jest kluczowa dla rozwoju tej dziedziny. My oraz inni badacze wykorzystaliśmy mysi model IUT do badania czynników wpływających na pomyślny rozwój graftu z hematopoetycznych komórek macierzystych transplantowanych in utero zarówno u myszy typu dzikiego4-7, jak i u myszy z chorobami genetycznymi.8,9 Środowisko płodowe oferuje również znaczne korzyści dla powodzenia terapii genowej in utero. Na przykład dostarczenie do płodu wektorów adenowirusowych10, wirusów adeno-zależnych10, retrowirusowych11 oraz lentiwirusowych12,13 doprowadziło do transdukcji wielu narządów oddalonych od miejsca wstrzyknięcia z długotrwałą ekspresją genu. Terapia genowa in utero może zatem być rozważana jako możliwa strategia leczenia schorzeń monogenowych, takich jak dystrofia mięśniowa czy mukowiscydoza. Inną potencjalną zaletą IUT jest zdolność do indukowania tolerancji immunologicznej na konkretny antygen. Jak zaobserwowano u myszy z hemofilią, wprowadzenie czynnika IX we wczesnej fazie rozwoju skutkuje tolerancją na to białko.14
Oprócz zastosowania w badaniach nad potencjalnymi terapiami dla ludzi, mysi model IUT może być potężnym narzędziem do badania podstawowych zagadnień z zakresu biologii rozwoju i biologii komórek macierzystych. Na przykład można dostarczać różne małe cząsteczki, aby indukować lub hamować ekspresję konkretnych genów na określonych etapach rozwoju płodowego i manipulować szlakami rozwojowymi. Wpływ tych zmian można oceniać w różnych punktach czasowych po wstępnej transplantacji. Co więcej, do środowiska płodowego można przeszczepiać pluripotencjalne lub liniowo specyficzne komórki progenitorowe, aby badać różnicowanie komórek macierzystych w nienaświetlonym i niezakłóconym środowisku gospodarza.
Myszie modele IUT dostarczyły już licznych informacji w dziedzinie immunologii oraz biologii rozwojowej i komórek macierzystych. W tym protokole wideo opisujemy krok po kroku sposób przeprowadzania IUT u płodów myszy oraz przedstawiamy kluczowe etapy i potencjalne trudności związane z tą techniką.
Protokół
1. Przygotowanie pipet do iniekcji
- Skalibruj wyciągacz pipet w taki sposób, aby oddzielenie szklanej pipety następowało w ciągu 15 sekund (patrz instrukcje producenta dotyczące kalibracji). Pipeta będzie miała zwężenie w miejscu oddzielenia.
- Odetnij koniec pipety tak, aby odległość od początku zwężenia do końca pipety wynosiła od 1,04 cm do 1,05 cm. Długość pipety jest odwrotnie proporcjonalna do kalibru otworu pipety. Należy pamiętać, że wykonanie dłuższej pipety skutkuje również słabszą końcówką, która jest bardziej podatna na złamanie podczas wstrzykiwania.
- Kolejnym krokiem w przygotowaniu pipety jest stworzenie gładkiego ścięcia poprzez ostrzenie końcówki na diamentowej tarczy szlifującej. W momencie przycinania pipety do odpowiedniego rozmiaru często pęka ona, tworząc naturalne ścięcie na końcówce, które należy wykorzystać podczas przykładania pipety do tarczy. Podczas tego procesu ważne jest, aby delikatnie opierać pipetę o tarczę szlifującą i okresowo sprawdzać, czy pipeta nadal z nią styka), ponieważ w miarę wygładzania ścięcia będzie ona tracić kontakt z tarczą szlifującą.
- Gdy ścięcie będzie gładkie, należy zaostrzyć końcówkę pipety (Rycina 1). Unieś pipetę tak, aby nie dotykała już tarczy szlifującej, obróć ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 10-50 stopni i ponownie umieść pipetę na obracającej się tarczy szlifującej przez około 10 sekund. Wyjmij pipetę z tarczy szlifującej i sprawdź krawędź. Ten krok zazwyczaj musi być powtórzony z kilkoma niewielkimi korektami, aby uzyskać ostrą krawędź. Jeśli pipeta będzie opierać się o krawędź zbyt długo, istnieje większe prawdopodobieństwo powstania nierównej powierzchni (Rycina 1). Po ukończeniu jednej strony można przejść do ostrzenia przeciwległej krawędzi, powtarzając powyższe kroki.
- Użyj permanentnego markera, aby narysować linię okrężną co 4 mm, zaczynając od miejsca, w którym zaczyna się zwężenie pipety. Oznaczenia te odpowiadają objętości 5 µL.
2. Transplantacja in utero
- Po przygotowaniu materiału do wstrzyknięcia (np. komórek, wirusa itp.) można przystąpić do przygotowania mikroiniekcji. Używamy mikroinjektora podłączonego do sprężonego powietrza z następującymi ustawieniami: (Ustawienia ciśnienia: wejście 60-80 psi, napełnianie 40 psi, wtrysk 8-12 psi, balans 0 psi, podtrzymanie 0 psi; czas wtrysku 100 milisekund).
- Aby wysterylizować pipetę do iniekcji, należy ją dwukrotnie przemyć 70% EtOH, a następnie dwukrotnie sterylnym 1X PBS. Ze względu na to, że końcówka pipety jest bardzo krucha, nie zaleca się autoklawowania pipet do iniekcji.
- Iniekcje można wykonywać przy użyciu lup o powiększeniu 2,5X-3,5X lub mikroskopu sekcyjnego. Przygotuj obszar zabiegowy, zapewniając podgrzewacz, oświetlenie i niezbędne instrumenty chirurgiczne.
- Zpodaj znieczulenie ciężarnej myszy (stosujemy izofluran i tlen dostarczane przez jednostkę do ciągłego przepływu gazów anestezjologicznych). Umieść mysz na macie grzewczej w pozycji na plecach i przymocuj każdą kończynę taśmą, aby unieruchomić zwierzę.
- Ogol futro. Następnie, w sterylnych rękawiczkach chirurgicznych, przygotuj brzuch, przemywając go 10% powidon-jodem, a następnie alkoholem, i podaj lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina.
- Wykonaj cięcie o długości 1 cm w dolnej części brzucha (dolna krawędź cięcia powinna znajdować się około 1 cm powyżej introitus). Przetnij skórę i powięź. Należy uważać, aby nie uszkodzić narządów brzusznych (jelit i pęcherza), które znajdują się bezpośrednio pod cienką warstwą powięzi.
- Używając patyczków waty, delikatnie rozszerz powięź i wysuń ciążową macicę przez nacięcie. Policz całkowitą liczbę płodów, identyfikując najpierw prawy i lewy jajnik, aby upewnić się, że cała macica jest widoczna. Przed przejściem do dalszych kroków umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej, aby płody pozostały ciepłe podczas przygotowań do iniekcji.
- Pobierz odpowiednią objętość materiału dla liczby płodów, którym planujesz wykonać iniekcje. Podczas napełniania igły próbką ważne jest, aby końcówka pipety pozostała zanurzona, co zapobiegnie zassaniu próbki do przewodów mikroinjektora. Ponieważ komórki zazwyczaj znajdują się w małej objętości, zazwyczaj umieszczamy je w małej probówce do wirówki (np. 0,5 mL) lub bezpośrednio na kawałku Parafilmu, aby móc napełnić igłę bez złamania końcówki pipety.
- Delikatnie chwyć każdego płoda i zidentyfikuj część ciała, w którą planujesz wstrzyknąć materiał (np. wątrobę, jamę otrzewną, nogę itp.). Kciukiem i palcem wskazującym należy ustabilizować płód w jamie owodniowej, aby nie obracał się podczas wykonywania iniekcji. Ważne jest, aby trzymać płoda wystarczająco mocno, by go ustabilizować, ale jednocześnie delikatnie, aby go nie uszkodzić.
- Ostrożnie wprowadź pipetę przez macicę, owodnię i skórę płoda, aż do organu docelowego. Jeśli pipeta jest ostra, powinna łatwo przejść przez te tkanki. Jeśli końcówka pipety jest tępa, zauważysz napinanie się macicy i błon owodniowych. Wstrzyknij pożądaną objętość do każdego płoda. Niezbędne jest, aby ruchy podczas wprowadzania, wtryskiwania i wycofywania pipety były stabilne.
- Po wstrzyknięciu pożądanej objętości ostrożnie wycofaj pipetę. Jeśli zabieg wykonano prawidłowo, materiał nie powinien wyciekać z jamy owodniowej ani macicy. Jeśli w owodni powstanie duży otwór, co można rozpoznać po wycieku płynu owodniowego, przeżycie płoda jest zagrożone. W przypadku badań obejmujących pobieranie materiału po narodzinach, wszystkie płody muszą otrzymać technicznie idealne iniekcje, ponieważ po urodzeniu nie ma możliwości odróżnienia płodów wstrzykniętych od niewstrzykniętych.
- Jeśli wykonujesz iniekcje do wątroby płodowej, po wycofaniu pipety możesz czasami zauważyć krew w jej końcówce – potwierdza to prawidłowe umiejscowienie i nie powinno wpłynąć na przeżywalność. W przypadku iniekcji dosytrawnowych celuj nieco poniżej wątroby płoda. W przypadku iniekcji domięśniowych możesz ułożyć płoda tak, aby zidentyfikować biodro i kość udową, a następnie wstrzyknąć materiał w mięsień pośladkowy. W przypadku iniekcji domózgową do komór bocznych, łatwo jest zlokalizować szwy wieńcowe, aby skierować pipetę do odpowiedniego celu. Do tych iniekcji wymagane są pipety o nieco większym przekroju, aby przebić czaszkę bez złamania narzędzia.
- Następnie ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej. Upewnij się, że nie jest ona skręcona ani nie uciska swoich naczyń krwionośnych. Podaj 1 mL sterylnego 1X PBS do jamy otrzewnej matki, aby uzupełnić płyny utracone podczas procedury. Zamknij nacięcie w dwóch warstwach za pomocą plecionej wchłanialnej nici 5-0 (np. Vicryl). Najpierw zamknij powięź, nie uszkadzając leżących poniżej jelit ani pęcherza, a następnie zamknij skórę.
- W tym momencie można podać leki przeciwbólowe po zabiegu. Przenieś każdą wstrzykniętą samicę do osobnej klatki i ustaw klatkę na podgrzewaczu. Monitoruj mysz, aż odzyska pełną sprawność i stanie się aktywna. Włóż ściółkę do klatki i umieść mysz w spokojnej części pomieszczenia dla zwierząt, gdzie nie będzie ona niepokojona (np. poprzez sprzątanie klatki) przez kilka dni po porodzie. Minimalizowanie dodatkowego stresu zwierzęcia zmniejszy ryzyko przedwczesnego porodu.
- Po zakończeniu iniekcji przemyj pipetę dwukrotnie sterylnym 1X PBS i raz 70% EtOH.
- Samicami po zabiegu należy opiekować się codziennie, aby upewnić się, że powracają do zdrowia bez trudności. Nacięcie powinno być monitorowane pod kątem obrzęku, stanu zapalnego, rozejścia się rany oraz innych oznak infekcji. W razie potrzeby można podawać przeciwbólowe leki pooperacyjne.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przeżywalność wstrzykniętych płodów do terminu porodu jest głównym czynnikiem ograniczającym sukces tej techniki. W zależności od wstrzykniętego materiału i użytej szczepu myszy, wskaźniki przeżywalności mogą się różnić. Ogólnie wstrzyknięcie komórek krwiotwórczych do myszy typu dzikiego w dniu E14 powinno skutkować narodzinami co najmniej 50% żywych szczeniąt. Wyższe wskaźniki przeżywalności są możliwe w zależności zarówno od aspektów technicznych wstrzyknięcia, jak i od charakterystyki wstrzykiwanych myszy.
Minimalizacja urazów macicy i błon płodowych jest najważniejszym aspektem technicznym niniejszego protokołu. Zastosowanie ostrych pipet o małej średnicy pozwoli ograniczyć urazy macicy podczas wstrzykiwania. Nie zalecamy stosowania standardowych igieł do iniekcji, ponieważ ich średnica jest zbyt duża, co doprowadziłoby do powstania dużego otworu w macicy. Ręcznie wykonane szklane pipety do iniekcji są jedynymi igłami o małej średnicy, które można wykorzystać do iniekcji in utero. Dla uzyskania optymalnych wyników kluczowa jest również uważna i precyzyjna technika chirurgiczna, obejmująca delikatne obchodzenie się z macicą oraz krótkotrwałe znieczulenie.
Na przeżywalność mogą wpływać również specyficzne cechy myszy biorców, takie jak tło genetyczne, wiek ciążowy oraz wielkość miotu. Pewne szczepy myszy są bardziej podatne na przedwczesny poród i utratę ciąży w zależności od ich tła genetycznego.15 Zwierzęta transgeniczne z wadami mięśniowymi lub neurodegeneracyjnymi mogą mieć upośledzoną zdolność do rodzenia płodów drogą pochwową po wykonaniu laparotomii w linii pośrodkowej.8 U tych ciężarnych samic może być konieczne zastosowanie cięcia cesarskiego. Stwierdziliśmy również, że wiek ciążowy w momencie iniekcji może wpływać na żywotność. Płody młodsze niż w 12. dniu embrionalnym wykazują niższą przeżywalność niż płody starsze. Wreszcie zauważyliśmy, że w przypadku dużych miotów (>10 płodów) występuje tendencja do wyższej śmiertelności płodów po iniekcji. Dbałość zarówno o aspekty techniczne tej metody, jak i o specyficzne cechy iniekcyjnych myszy, może zmaksymalizować przeżywalność wstrzykniętych płodów.
Przy prawidłowym wykonaniu tych metod można oczekiwać, że wszystkie płody zostaną poddane działaniu wstrzykniętego materiału. Jednak podobnie jak w warunkach pozłodowych, skuteczne dostarczenie komórek lub wirusów in utero nie zawsze skutkuje odpowiednio przyjęciem komórek donora lub ekspresją genów. Przyjmowanie komórek macierzystych zależy na przykład od kilku czynników, takich jak dawka i źródło przeszczepianych komórek. Podobnie sukces transdukcji wirusowej jest częściowo określany przez rodzaj zastosowanego wektora wirusowego. Aby osiągnąć sukces w realizacji tego protokołu, należy zrozumieć liczne czynniki wpływające na przeżywalność młodych, przyjęcie komórek oraz transdukcję wirusową.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający prawidłowe ostrzenie pipet wstrzykujących (Krok 1.4)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ponad 50 lat temu Billingham, Brent i Medawar wykorzystali transplantację in utero u myszy w celu wywołania tolerancji immunologicznej na obce białka.16 Od tamtego czasu kilka wariantów tej techniki było stosowanych do rozwiązywania problemów w immunologii i biologii komórek macierzystych.
Opisany tutaj protokół jest jedną z najłatwiej dostępnych metod IUT. Wątroba płodu stanowi łatwo widoczny cel i zapewnia dostęp do krążenia systemowego poprzez żyłę wrotną i żyły wątrobo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować naszym sponsorom: California Institute for Regenerative Medicine Clinical Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Perstein Award (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association (TCM) oraz March of Dimes (TCM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipety | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Wytwarzarka pipet | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Mikroinjektor | Narishige International | IM-300 | |
| Ostrzałka do pipet | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
Bibliografia
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S. In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI). Lancet. 348, 1484-1487 (1996).
- Flake, A. W., Zanjani, E. D. in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers. Blood. 94, 2179-2191 (1999).
- Merianos, D. J. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).
- Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood. 109, 1331-1333 (2007).
- Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice. J Surg Res. 77, 1-5 (1998).
- Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras. Blood. 112, 5245-5253 (2008).
- Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice. J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).
- Hayashi, S. Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy. Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).
- Bouchard, S. Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice. J Gene Med. 5, 941-950 (2003).
- Meza, N. W. Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme. Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).
- MacKenzie, T. C. Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther. 6, 349-358 (2002).
- MacKenzie, T. C. Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors. J Gene Med. 7, 50-58 (2005).
- Sabatino, D. E. Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice. Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).
- Mellor, A. L., Munn, D. H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, 603-606 (1953).
- Endo, M. Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector. Mol Ther. 15, 579-587 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
