Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę pobierania próbek z powierzchni pomidorów i innych świeżych produktów z wykorzystaniem taśmy klejącej, a następnie przeprowadzania na taśmie analizy fluorescencyjnej in situ hybrydyzacja in situ fluorescencyjna (FISH) do szybkiego wykrywania bez konieczności hodowli Salmonella Taśmy z naniesionymi komórkami można również przyłożyć stroną klejącą do selektywnego agaru w celu wzbogacenia w fazie stałej przed detekcją. Alternatywnie, na powierzchni taśmy w bulionie nieselektywnym można przeprowadzić wzbogacanie w małej objętości cieczy (płynna minikultura powierzchniowa), a następnie wykonać FISH i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. W celu rozpoczęcia, sterylną taśmę klejącą przykłada się do świeżych produktów, wywiera lekki nacisk, a następnie zdejmuje taśmę, co pozwala na fizyczną ekstrakcję drobnoustrojów obecnych na tych powierzchniach. Taśmy montuje się stroną klejącą do góry na szklanych przedmiotach do mikroskopu, a pobrane komórki utrwala się w 10% formalinie (30 min) i odwadnia, stosując szereg stężeń etanolu (50, 80 i 95%; po 3 min na każde stężenie). Następnie na taśmy z naniesionymi komórkami nanosi się kroplowo bufor zawierający Salmonella-koktajlem sond DNA i hybrydyzowano przez 15–30 min w temperaturze 55°C, po czym wykonano krótkie płukanie w buforze myjącym w celu usunięcia niezwiązanej sondy. Przytwierdzone do podłoża komórki znakowane metodą FISH poddaje się następnie barwieniu kontrastowemu barwnikiem DNA 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), a wyniki analizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu wzbogacania w fazie stałej taśmy z naniesionymi komórkami umieszcza się stroną aktywną do dołu na odpowiedniej selektywnej powierzchni agarowej i inkubuje, aby umożliwić in situ wzrost Salmonella mikrokolonie, a następnie przeprowadzono hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH) oraz mikroskopię zgodnie z powyższym opisem. W przypadku minikultury powierzchniowej w środowisku ciekłym taśmy z naniesionymi komórkami umieszczono stroną klejącą do góry, a następnie zastosowano silikonową komorę perfuzyjną w taki sposób, aby taśma i szkiełko mikroskopowe tworzyły dno szczelnej komory, do której wprowadzono niewielką objętość (≤ 500 μL) pożywki Trypticase Soy Broth (TSB). Porty wlotowe zostały zamknięte, a komory inkubowano w temperaturze 35–37°C, umożliwiając amplifikację mikroorganizmów wyekstrahowanych z taśmy poprzez ich wzrost. Po inkubacji otwarto porty wlotowe, a komórki odspojono i wymieszano za pomocą intensywnego pipetowania w przód i w tył, zebrano metodą wirowania i utrwalono w 10% neutralnym buforowanym formalinie. Na koniec próbki poddano hybrydyzacji i analizie za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia obecności Salmonella spp. Jak opisano w niniejszej pracy, nasza metoda „tape-FISH” umożliwia proste i szybkie pobieranie próbek oraz detekcję Salmonella na powierzchniach pomidorów. Podejścia tego użyto również do pobierania próbek z innych rodzajów świeżych produktów, w tym ze szpinaku i papryczek jalapeño.

Protokół

1. Pobieranie próbek z powierzchni za pomocą sterylnej taśmy klejącej

1. Wybierz taśmę do pobierania próbek. Dostępne w handlu taśmy do pobierania próbek Fungi-Tape lub Con-Tact-It są sterylne i specjalnie zapakowane dla łatwości użytkowania. Stwierdzono jednak, że można również stosować przezroczystą (optycznie czystą) zwykłą taśmę biurową.
2. Używając permanentnego markera, narysuj kwadraty o powierzchni 1 cm² na nielepkiej stronie 10 cm kawałka taśmy klejącej (można użyć szablonu papierowego). Będą one służyć jako pomoc wizualna do odnotowania, która część taśmy została wykorzystana do pobrania próbki z żywności lub powierzchni środowiskowej.
3. Uformuj z taśmy pętlę w kształcie litery „C”, tak aby lepka strona była skierowana w stronę powierzchni, z której pobierana jest próbka. W tym celu przytrzymaj lepkie końce kciukiem i palcem środkowym, a palec wskazujący oprzyj o narysowany kwadrat na odwrocie (nielepkiej stronie) taśmy (Rycina 1).
4. Przyłóż taśmę do powierzchni, z której pobierana jest próbka, i delikatnie dociśnij zaznaczony obszar do powierzchni. Nie puszczając krawędzi taśmy, użyj palca wskazującego, aby upewnić się, że lepka strona taśmy w pełni przylega do powierzchni próbki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
5. Równomiernym ruchem powoli oderwij taśmę od próbki, mechanicznie ekstrahując drobnoustroje związane z powierzchnią. Przymocuj taśmę z pobranymi komórkami lepką stroną do góry do szklanego przedmiotu do mikroskopu, używając zwykłej przezroczystej taśmy biurowej. Zapewnij odpowiednie napięcie/rozciągnięcie taśmy, aby uzyskać płaską powierzchnię bez zmarszczek. Pomoże to zminimalizować problemy z odkształceniem/zwijaniem się taśmy podczas późniejszego podgrzewania w trakcie hybrydyzacji.

2. Wzbogacanie w fazie stałej i minikultura powierzchniowa w cieczy

1. Wzbogacanie w fazie stałej przeprowadza się poprzez przyłożenie taśmy stroną klejącą do agarowych płytek ksylozo-lizyna-Tergitol 4 (XLT-4), tak aby pobrane komórki znalazły się w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią agaru. Część taśmy stykająca się z próbką zostaje dociśnięta do powierzchni agaru, a jeden koniec taśmy lekko przykleja się do ścianki szalki Petriego, aby ułatwić usunięcie taśmy z powierzchni agaru po zakończeniu wzbogacania.
2. Płytki odwraca się do góry dnem (aby uniknąć kondensacji) i inkubuje w temperaturze 35 - 37°C, aby umożliwić wystarczający wzrost Salmonella spp. Długość okresu inkubacji niezbędnego do wzbogacenia komórek do poziomu wykrywalnego zależy od początkowego stopnia zanieczyszczenia Salmonella. Zaobserwowano doskonałe tworzenie się mikrokolonii przy niskim początkowym mianie inokulum po 8 h wzbogacania.
3. Po pożądanym okresie wzbogacania należy otworzyć płytkę agarową. Taśma zachowa swoją lepkość podczas inkubacji. Należy delikatnie docisnąć taśmę do agaru palcem wskazującym, aby zapewnić maksymalny odzysk mikrokolonii powstałych na styku taśmy i agaru. Chwyć taśmę za krawędź przyklejoną do ścianki szalki Petriego i usuń ją powolnym, jednostajnym ruchem. Przymocuj taśmę z komórkami, stroną klejącą do góry, do szkiełka przedmiotowego zgodnie z opisem w sekcji 1.5 powyżej. Przejdź do kroku „Fiksacja i dehydratacja” poniżej.
4. W przypadku minikultury powierzchniowej w cieczy, należy zacząć od przymocowania taśmy użytej do pobierania próbek do szkiełka przedmiotowego, zgodnie z opisem w sekcji 1.5 powyżej. Następnie należy przykryć część taśmy stykającą się z próbką nisterylną silikonową komorą perfuzyjną (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), tworząc szczelną komorę, której dno stanowi taśma z komórkami, skierowana stroną klejącą do góry. Mocno, ale delikatnie dociśnij komorę, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie.
5. Używając elastycznego końcówki do pipety do nakładania żelu, przenieś ≤ 500 μL bulionu Trypticase Soy Broth lub innego odpowiedniego podłoża wzbogacającego przez jeden z małych portów wlotowych komory. Uszczelnij oba porty przezroczystą taśmą biurową, aby zapobiec odparowaniu, i inkubuj szkiełka w temperaturze 35 - 37°C przez czas niezbędny do uzyskania wystarczającego wzbogacenia. Chociaż wszystkie operacje powinny być przeprowadzane zgodnie z dobrą praktyką pobierania i obchodzenia się z próbkami, sterylność taśmy uszczelniającej porty lub komór perfuzyjnych nie jest wymagana podczas minikultury powierzchniowej w cieczy. Połączenie metody FISH i cytometrii przepływowej umożliwi wyraźne odróżnienie Salmonella spp. od bakterii nietarczowych, które mogą być obecne, przy czym oczekuje się, że największy udział flory nietarczowej będzie pochodził z samej próbki. Przejdź do kroku „Fiksacja i dehydratacja” poniżej.

3. Fixacja i dehydratacja

1. W przypadku bezpośredniego pobierania próbek z powierzchni lub wzbogacania w fazie stałej Salmonella spp. na agarze XLT-4, należy przeprowadzić unieruchomienie komórek na taśmie przez 30 min w temperaturze 25°C, pokrywając obszar kontaktu z próbką 500 μL 10% neutralnie buforowanego formaliny.
2. Utrwalacz należy przelać do szczelnego pojemnika (pod wyciągiem chemicznym, aby zminimalizować ekspozycję na drażniące/toksyczne opary).
3. Odwodnić w serii etanolu (50%, 80% i 95%; po 300 μL przez 3 min dla każdego stężenia). Przejść do poniższego etapu „Hybrydyzacji”.
4. W celu unieruchomienia próbek z minikultury powierzchniowej o objętości 500 μL, należy rozszczelnić komory perfuzyjne i użyć elastycznego końcówki do pipetowania żelu do odessania wzbogaconego materiału. Szybkie pipetowanie w górę i w dół pomaga zapewnić skuteczne usunięcie wszelkich pozostałych komórek związanych z taśmą.
5. Następnie całą objętość minikultury (500 μL) przenosi się do probówki do mikrocentryfugi i wiruje przy 2,000 x g (5 min). Nadnadczyn zostaje usunięty, a osad poddany intensywnemu mieszaniu w wortexie przez 30-60 s, następnie resuspensuje się go w równym samym objętości 10% neutralnie buforowanego formaliny. Komórki unieruchamia się przez 30 min w temperaturze 25°C.
6. Następnie usuwa się utrwalacz i resuspensuje próbkę w buforze do przechowywania komórek w następujący sposób. Próbkę wiruje się przy 2,000 x g (5 min, 25°C), usuwa nadnadczyn, osad poddaje intensywnemu mieszaniu w wortexie przez 30-60 s, a następnie resuspensuje w równym samym objętości 50% niedenaturowanego etanolu i 50% soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo. Unieruchomione komórki można przechowywać w nieskończoność (przez lata) w temperaturze -20°C. Uwaga: Przy każdej wymianie cieczy (np. podczas wprowadzania utrwalacza lub innego buforu) ważne jest dokładne resuspensowanie (za pomocą wortexu) osadu komórkowego w minimalnej części (~10-20 μL) „wychodzącego” układu cieczy. Pomoże to zapobiec zlepianiu się komórek i zapewni uzyskanie równomiernych zawiesin pojedynczych komórek. Przejść do poniższego etapu „Hybrydyzacji”.

4. Hybrydyzacja

1. Przygotować bufor do hybrydyzacji/płukania, wykorzystując komercyjne roztwory klasy molecular biology wymienione w tabeli materiałów. Końcowe stężenia składników buforu to 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% dodecylosiarczanu sodu; dopełnić do pożąganej objętości końcowej wodą klasy molecular i przefiltrować za pomocą 0.22 μm filtr strzykawkowy lub filtrujący. Tego samego buforu, bez dodatku sond (patrz poniżej), używa się jako buforu płuczącego. Należy podgrzać bufory do hybrydyzacji i płukania do 55°C.
2. Dodaj znakowany fluorescencyjnie Sal3 (Nordentoft it al., 1997; 5'- AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3') oraz Salm-63 (Kutter i wsp., 2006; 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3') sondy oligonukleotydowe (tabela materiałów) do podgrzanego buforu do hybrydyzacji. Całkowite stężenie sond wynoszące 5 ng μL^-1 stosuje się (np. 2,5 ng μL^-1 każda sonda; Bisha i Brehm-Stecher, 2009a).
3. W przypadku próbek poddanych wzbogacaniu bezpośrednio na taśmie oraz na fazie stałej, należy pokryć obszar kontaktu z próbką matrycową na taśmie za pomocą 300 μL buforu do hybrydyzacji zawierającego koktajl sond i przeprowadzić hybrydyzację komórek związanych z taśmą w wilgotnej, szczelnie zamkniętej komorze inkubacyjnej ustawionej na 55°CJeśli używany jest inkubator z bezpośrednim kontaktem, taki jak urządzenie Slide Moat (Tabela materiałów), próbki poddawane są hybrydyzacji przez 15 min, a następnie >Jednocześnie można przetworzyć 20 slajdów. W przypadku użycia obrotowego pieca do hybrydyzacji, takiego jak urządzenie Bambino (Tabela Materiałów), slajdy umieszcza się do hybrydyzacji w polipropylenowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, po jednym slajdzie na probówkę. Ze względu na brak bezpośredniego przekazywania ciepła, próbki te poddaje się hybrydyzacji przez dłuższy czas (do 30 min).
4. Po hybrydyzacji preparaty wyjmuje się, a nadmiar buforu do hybrydyzacji zawierającego sondę usuwa. Następnie preparaty płucze się krótko i delikatnie podgrzanym buforem do płukania, pipetując niewielką objętość buforu na przechylone szkiełko (3 płukania z 300 μL (każda), lub formalnie przemyte (do 30 min) albo poprzez nałożenie warstwy podgrzanego buforu do przemywania, albo poprzez zanurzenie w polipropylenowej probówce do wirowania o pojemności 50 ml zawierającej podgrzany bufor do przemywania. Z naszego doświadczenia wynika, że choć formalne przemywanie pozwala uzyskać lepsze wyniki (mniejsze zamglenie spowodowane niezwiązaną sondą), zwykłe płukanie jest wystarczające do jednoznacznego wykrycia Salmonella gatunków. Następnie preparaty zostają wysuszone na powietrzu przed przejściem do poniższego etapu „Detekcja”.
5. Hybrydyzację próbek minikultur z powierzchni cieczy przeprowadza się poprzez odwirowanie próbek (świeżo utrwalonych lub przechowywanych w buforze do przechowywania w temperaturze -20°C) przez 5 min przy 2000 x g, a następnie intensywne mieszanie osadu na wirówce typu vortex i resuspensja w 100 μL podgrzany bufor hybrydyzacyjny zawierający koktajl sond. Próbki poddawano hybrydyzacji w 55°C przez 30 min na bloku grzewczym lub w innej odpowiedniej stacji inkubacyjnej (Tabela materiałów), a następnie dodanie 500 μL podgrzany bufor piorący. Podobnie jak w przypadku próbek związanych z taśmą, próbki te można poddać formalnemu przemywaniu przez maksymalnie 30 min z dalszą inkubacją w 55°C w tym buforze płuczącym, stosując przerywane mieszanie w wirówkarce typu vortex. Alternatywnie próbki można dokładnie wymieszać w wirówkarce typu vortex po dodaniu 500 μL podgrzany bufor płuczący, a następnie natychmiastowe zebranie materiału do analizy (poniżej).
6. W ramach przygotowania do detekcji Salmonella gatunki za pomocą cytometrii przepływowej, próbki z minikultury powierzchniowej w cieczy są wirowane z prędkością 2 000 x g przez 5 min, supernatant jest odrzucany, a próbki są resusp endowane w 300 μL temperatura pokojowa (~25°C) PBS. Jeśli próbki wymagają transportu do odległej placówki lub jeśli przewidywane jest opóźnienie pomiędzy hybrydyzacją a analizą, próbki można przechowywać w lodówce lub w lodzie przed przystąpieniem do analizy. Alternatywnie próbki można przenieść do buforu do przechowywania komórek (mieszanina PBS i etanolu bezwodnego w stosunku 50:50) i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie tydzień, bez zauważalnego spadku fluorescencji zapewnianej przez sondę (Bisha i Brehm-Stecher, 2009b).

5. Detekcja

1. Aby wykryć Salmonella spp. bezpośrednio na taśmie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, próbki z bezpośredniego naniesienia na taśmę lub wzbogacone w fazie stałej pokrywa się ~10 μL medium montażowego Vectashield H-1200 zawierającego barwnik jądrowy 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), zamyka szkiełkiem nakrywką, a następnie inkubuje w ciemności przez 10 min.
2. Na szkiełko nakrywkowe nakłada się olej immersyjny, a próbki bada za pomocą obiektywu immersyjnego o dużym powiększeniu (63x lub 100x). Filtr DAPI służy do ustawienia ostrości preparatu, następnie mikroskop przełącza się na odpowiedni filtr (zielony lub czerwony, w zależności od barwnika użytego do znakowania końców sond), a komórki Salmonella ocenia się wizualnie na podstawie ich fluorescencji (Rysunki 2 i 3).
3. Do cytometrycznego wykrywania próbek z płynnych minikultur powierzchniowych można używać różnych instrumentów, w zależności od ich dostępności. W naszym laboratorium próbki zawieszone w PBS przenosi się do 5 mL probówek do pobierania próbek z okrągłym dnem (BD Falcon) i bada za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto z wzbudzeniem przy 647 nm (Tabela materiałów). W przypadku próbek wzbogaconych o wysoką całkowitą liczbę bakterii stosuje się ustawienie „niskiego przepływu” (10 μL min^-1) i zbiera od 5 000 do 50 000 zdarzeń. Dane analizuje się za pomocą oprogramowania FlowJo (wersja 8.8.6, Tree Star, Inc., Ashland, OR) lub innego odpowiedniego oprogramowania analitycznego (Rysunek 4, panele A i B).

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Zastosowanie taśmy klejącej do pobierania próbek Salmonella spp. z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora.

Rycina 2. Typowe wyniki pobierania próbek metodą direct-to-tape oraz detekcji FISH Salmonella Typhimurium ATCC 14028 z powierzchni pomidora (obiektyw olejowy 100 X). Do znakowania tych komórek wykorzystano koktajl dwóch sond znakowanych Texas Red (Sal3/Salm-63).

Rycina 3. Mikrokolonie Salmonella Typhimurium ATCC 14028 powstałe na powierzchni agaru Xylose Lysine Tergitol-4 (XLT-4) po 8 h namnażania na taśmie w temperaturze 37°C. Początkowe inokulum pobrano z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora. Namnażanie w fazie stałej zwiększa liczbę komórek dostępnych do detekcji oraz zwiększa zawartość komórkowego rRNA.

Rycina 4. Zastosowanie taśmy klejącej do pobierania próbek S. enterica serowaru Typhimurium z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora, a następnie bezpośrednia analiza za pomocą FISH i cytometrii przepływowej (panel A) lub po 5 h nieselektywnego płynnego namnażania powierzchniowego w minikulturze w komorze perfuzyjnej wypełnionej 500 μL bulionu sojowo-kazeinowego (panel B).

Dyskusja

Proste i szybkie metody wykrywania patogenów na powierzchniach produktów rolnych mogą pomóc w ograniczaniu chorób przenoszonych przez żywność, dostarczając terminowych i praktycznych danych. Metody pobierania próbek z wykorzystaniem taśm klejących są stosowane w mikrobiologii środowiskowej, klinicznej i żywności od lat 50. XX wieku i polegają na przyciskaniu taśmy typu „Scotch” do powierzchni w celu usunięcia mikroorganizmów, a następnie bezpośrednim badaniu mikroskopowym lub przeniesieniu przylegających mikroorganizmów ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma do pobierania próbek Fungi-Tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Taśma do pobierania próbek Con-Tact-It	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Przezroczysta taśma biurowa, generyczna	Różne		Powinna być optycznie przejrzysta i charakteryzować się niską fluorescencją wewnętrzną
Powierzchnia żywności	Lokalny sklep spożywczy		Użyto tomat–ów (czerwonych tomat–ów na krzaczkach, niewoskowanych i nieolejowanych)
Bulion sojowo-kazeinowy (Trypticase Soy Broth)	Difco Laboratories	211768	Do nieselektywnego wzbogacania minikultur z powierzchni w cieczy
Baza agaru ksylozo-lizyna-Tergitol 4	Difco Laboratories	223420	Do agaru selektywnego dla Salmonella (XLT-4)
Suplement do agaru ksylozo-lizyna-Tergitol 4	Difco Laboratories	235310	Do agaru selektywnego dla Salmonella (XLT-4)
Roztwór formaliny	Sigma-Aldrich	HT5011	Roztwór 10%, neutralny, buforowany (fiksatyw do komórek)
Etanol bezwodny	Sigma-Aldrich	E7023	Klasa do biologii molekularnej (odwadnianie przed hybrydyzacją)
Probówki do mikrocentryfugi 1.5 ml	Różne		Wolne od RNazy i DNazy
Kapturki i szkiełka podstawowe do mikroskopu	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Roztwór NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	Klasa do biologii molekularnej, roztwór 5M (składnik buforu do hybrydyzacji)
Roztwór buforowy Tris-EDTA (koncentrat 100X)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (składnik buforu do hybrydyzacji)
Roztwór dodecylosiarczanu sodu	Sigma-Aldrich	L4522	Roztwór 10% w wodzie 18 megohomowej (składnik buforu do hybrydyzacji)
Sondy oligonukleotydowe Sal3 i Salm-63	Integrated DNA Technologies		Znakowane 5’-6-karboksyfluoresceiną (FAM), Texas Red (do mikroskopii) lub Cy5 (do cytometrii), oczyszczone metodą HPLC
Mikrocentryfuga ze zmienną prędkością	Różne		Należy użyć średnicy rotora do obliczenia RPM potrzebnego dla wartości RCF opisanych w protokole
Komora perfuzyjna CoverWell	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Niesterylna
Końcówki do pipet do nakładania żelu (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Długie, cienkie końcówki dla łatwego dostępu do małych portów pobierania próbek i manewrowania wewnątrz komory
Aluminiowy blok grzejny lub stacja grzewcza z precyzyjną kontrolą	Różne		Użyto wstrząsarki grzejącej i chłodzącej z suchym blokiem Eppendorf Thermomixer R
Miniaturowy piec do hybrydyzacji Bambino	Boekel Scientific	Model 230300	Szkiełka są umieszczane w polipropylenowych probówkach wirówkowych 50 ml do hybrydyzacji, przekazywanie ciepła nie jest bezpośrednie
Hybrydyzator do szkiełek Slide Moat	Boekel Scientific	Model 240000	Zapewnia szybki, bezpośredni przekaz ciepła przez szkiełko
Medium montażowe Vectashield H-1200 z 4’,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimalizuje wygaszanie fluorescencji podczas mikroskopii, zapewnia barwienie kontrastowe DAPI
Mikroskop fluorescencyjny	Różne		Użyto Leitz Laborlux S
Aparat cyfrowy	Różne		Użyto aparatu Canon PowerShot A640
Oprogramowanie do akwizycji obrazu	Różne		Użyto oprogramowania Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss)
Adobe Photoshop	Adobe		Do minimalnej obróbki obrazów (nakładanie obrazów wykonanych w różnych kanałach
Cytometr przepływowy	Różne		Użyto cytometru przepływowego FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA) z wzbudzeniem czerwonym (647 nm)
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	Różne		Użyto oprogramowania FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.)