Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania salmonelli na świeżych produktach

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proste podejście oparte na taśmie klejącej do pobierania próbek pomidorów i innych świeżych produktów, a następnie szybkie wykrywanie Salmonelli na całych komórkach za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Streszczenie

Ten protokół opisuje proste podejście do pobierania próbek pomidorów i innych świeżych produktów za pomocą taśmy klejącej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu szybkiego, niezależnego od hodowli wykrywania Salmonella spp. Taśmy naładowane komórkami mogą być również umieszczone na selektywnym agarze ekranem do dołu w celu wzbogacenia w fazę stałą przed wykryciem. Alternatywnie, wzbogacanie cieczy o małej objętości (minikultura powierzchni cieczy) można przeprowadzić na powierzchni taśmy w nieselektywnym bulionie, a następnie FISH i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Na początek sterylna taśma klejąca styka się ze świeżymi produktami, wywierany jest delikatny nacisk, a taśma jest usuwana, fizycznie ekstrahując drobnoustroje obecne na tych powierzchniach. Taśmy są montowane lepką stroną do góry na szklanych szkiełkach mikroskopowych, a pobrane komórki są utrwalane 10% formaliną (30 min) i odwadniane przy użyciu stopniowanej serii etanolu (50, 80 i 95%; 3 minuty każde stężenie). Następnie taśmy naładowane komórkami są nakrapiane buforem zawierającym koktajl sondy DNA ukierunkowany na Salmonellę i hybrydyzowane przez 15 - 30 minut w temperaturze 55 ° C, a następnie krótkie płukanie w buforze myjącym w celu usunięcia niezwiązanej sondy. Przylegające, znakowane FISH komórki są następnie barwione przeciwstawnie barwnikiem DNA 4',6-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI), a wyniki są oglądane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu wzbogacenia w fazę stałą, taśmy naładowane komórkami umieszcza się stroną zadrukowaną do dołu na odpowiedniej selektywnej powierzchni agaru i inkubuje, aby umożliwić wzrost mikrokolonii Salmonelli in situ, a następnie FISH i mikroskopię, jak opisano powyżej. W przypadku minihodowli powierzchni ciekłej, taśmy naładowane komórkami umieszcza się lepką stroną do góry i nakłada się silikonową komorę perfuzyjną tak, aby taśma i szkiełko mikroskopowe tworzyły dno wodoszczelnej komory, do której wprowadza się niewielką objętość (≤ 500 μl) bulionu sojowego z tryptikazą (TSB). Porty wlotowe są uszczelnione, a komory są inkubowane w temperaturze 35 - 37°C, co pozwala na amplifikację drobnoustrojów wyekstrahowanych taśmą w oparciu o wzrost. Po inkubacji otwory wlotowe są rozszczelniane, komórki są odłączane i mieszane z energicznym pipetowaniem tam i z powrotem, zbierane przez wirowanie i utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Na koniec próbki są hybrydyzowane i badane za pomocą cytometrii przepływowej w celu ujawnienia obecności Salmonella spp. Jak opisano tutaj, nasze podejście "tape-FISH" może zapewnić proste i szybkie pobieranie próbek i wykrywanie Salmonelli na powierzchniach pomidorów. Zastosowaliśmy to podejście również do pobierania próbek innych rodzajów świeżych produktów, w tym szpinaku i papryczek jalapeño.

Protokół

1. Pobieranie próbek powierzchni za pomocą sterylnej taśmy klejącej

1. Wybierz taśmę, która ma być używana do próbkowania. Dostępne na rynku taśmy do pobierania próbek Fungi-Tape lub Con-Tact-It są sterylne i specjalnie zapakowane w celu ułatwienia użytkowania. Odkryliśmy jednak, że można również zastosować przezroczystą (optycznie przezroczystą) ogólną taśmę biurową.
2. Za pomocą markera permanentnego narysuj 1 cm² kwadraty na nieklejącej się stronie 10 cm kawałka taśmy klejącej (można użyć papierowego szablonu). Będzie to służyć jako wizualny przewodnik do odnotowania, która część taśmy została użyta do pobrania próbki żywności lub powierzchni środowiskowej.
3. Uformuj pętlę z taśmy w kształcie litery "C", z lepką stroną skierowaną w stronę powierzchni, z której ma być pobierana próbka. Aby to zrobić, przytrzymaj lepkie końce kciukiem i środkowym palcem i przyłóż palec wskazujący do narysowanego kwadratu z tyłu (nieklejącej strony) taśmy (Rysunek 1).
4. Umieść taśmę na powierzchni, z której chcesz pobrać próbkę i delikatnie dociśnij zaznaczony obszar do powierzchni. Nie zwalniając krawędzi taśmy, użyj palca wskazującego, aby upewnić się, że lepka strona taśmy w pełni styka się z powierzchnią próbki, unikając pęcherzyków.
5. Równomiernym ruchem powoli odciągnij taśmę od próbki, fizycznie ekstrahując drobnoustroje związane z powierzchnią. Przymocuj taśmę naładowaną komórkami, lepką stroną do góry, do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą zwykłej przezroczystej taśmy biurowej. Upewnij się, że taśma jest odpowiednio napięta/rozciągnięta, aby powstała płaska, niepomarszczona powierzchnia. Pomoże to zminimalizować problemy z deformacją/zwijaniem się taśmy podczas późniejszego ogrzewania podczas hybrydyzacji.

2. Wzbogacanie w fazie stałej i minikultura powierzchni cieczy

1. Wzbogacanie do fazy stałej przeprowadza się poprzez umieszczenie taśmy stroną zadrukowaną do dołu na płytkach agarowych z ksylozy-lizyny-tergitolu 4 (XLT-4) w taki sposób, aby pobrane komórki znajdowały się w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią agaru. Część taśmy z szablonem/próbką stykającą się z próbką jest umieszczana równo z powierzchnią agaru, a jeden koniec taśmy jest luźno przyklejony do bocznej ścianki szalki Petriego, aby ułatwić łatwe usunięcie taśmy z powierzchni agaru po wzbogaceniu.
2. Płytki są odwracane (w celu uniknięcia kondensacji) i inkubowane w temperaturze 35 - 37°C, aby umożliwić wystarczający wzrost Salmonella spp. Długość okresu inkubacji potrzebnego do wzbogacenia komórek do wykrywalnego poziomu będzie zależała od początkowego poziomu zanieczyszczenia Salmonellą. Zaobserwowaliśmy doskonałe tworzenie mikrokolonii z niskiej początkowej inokulacji po 8 godzinach wzbogacania.
3. Po upływie pożądanego okresu wzbogacania otwórz płytkę agarową. Taśma zachowa swoją lepkość podczas inkubacji. Delikatnie dociśnij taśmę do agaru za pomocą palca wskazującego, aby zapewnić maksymalny odzysk mikrokolonii powstałych na granicy taśmy-agaru. Chwyć taśmę od krawędzi przymocowanej do ściany szalki Petriego i usuń ją powolnym, równym ruchem. Zamontuj taśmę naładowaną ogniwami, lepką stroną do góry, na szkiełku mikroskopowym, jak opisano w sekcji 1.5 powyżej. Przejdź do kroku "Utrwalenie i odwodnienie" poniżej.
4. W przypadku minihodowli powierzchni cieczy należy rozpocząć od przymocowania taśmy używanej do pobierania próbek do szkiełka mikroskopowego, jak opisano w sekcji 1.5 powyżej. Następnie przykryj część taśmy z szablonem/próbką niesterylną silikonową komorą perfuzyjną (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), tworząc szczelną komorę, której dno składa się z taśmy naładowanej komórkami, skierowanej do góry. Mocno, ale delikatnie dociśnij komorę na miejsce, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie.
5. Za pomocą elastycznej końcówki pipety z żelem przenieś ≤ 500 μl bulionu sojowego z tryptykazy lub innego odpowiedniego medium wzbogacającego przez jeden z małych portów wlotowych komory. Uszczelnij oba porty przezroczystą taśmą biurową, aby zapobiec parowaniu i inkubuj szkiełka w temperaturze 35 -37°C w razie potrzeby w celu wystarczającego wzbogacenia. Chociaż wszystkie operacje powinny być wykonywane zgodnie z dobrymi praktykami pobierania próbek i obchodzenia się z nimi, sterylność taśmy uszczelniającej port lub komór perfuzyjnych nie jest wymagana podczas minihodowli powierzchni cieczy. Połączenie FISH i cytometrii przepływowej umożliwi wyraźne odróżnienie Salmonella spp. od bakterii niebędących przedmiotem zwalczania, które mogą być obecne, przy czym oczekuje się, że największy udział flory niedocelowej będzie pochodził z samej próbki. Przejdź do kroku "Utrwalenie i odwodnienie" poniżej.

3. Utrwalenie i odwodnienie

1. W przypadku bezpośredniego pobierania próbek z powierzchni lub wzbogacania w fazę stałą Salmonella spp. na agarze XLT-4, należy przeprowadzić utrwalanie komórek na taśmie przez 30 minut w temperaturze 25°C, pokrywając obszar kontaktu próbki 500 μl 10% neutralnej buforowanej formaliny.
2. Wyrzuć utrwalacz do zamykanego pojemnika (pod kapturem chemicznym, aby zminimalizować narażenie na drażniące/toksyczne opary).
3. Odwodnić w serii etanolowej (50%, 80% i 95%; 300 μl/3 min każde stężenie). Przejdź do kroku "Hybrydyzacja" poniżej.
4. W celu utrwalenia 500 μl próbek minikultury powierzchniowej cieczy, komory perfuzyjne są rozszczelniane, a do ekstrakcji wzbogacenia używana jest elastyczna końcówka pipety z żelem. Szybkie pipetowanie w górę i w dół służy do skutecznego usuwania pozostałych komórek związanych taśmą.
5. Następnie cała objętość 500 μl minikultury jest przenoszona do probówki mikrowirówki i odwirowywana w momencie 2.000 x g (5 min). Supernatant jest odrzucany, osad jest energicznie wirowany przez 30-60 s, a następnie ponownie zawieszany w równej objętości 10% obojętnej buforowanej formaliny. Komórki utrwala się na 30 minut w temperaturze 25°C.
6. Następnie utrwalacz jest usuwany, a próbka jest ponownie zawieszana w buforze do przechowywania komórek w następujący sposób. Próbka jest odwirowywana w temperaturze 2 000 x g (5 min, 25°C), supernatant jest odrzucany, osad jest energicznie wirowany przez 30 - 60 s, ponownie zawieszany w równej objętości 50% niedenaturowanego etanolu i 50% soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Stałe ogniwa mogą być przechowywane przez czas nieokreślony (lata) w temperaturze -20°C. Uwaga: Za każdym razem, gdy płyny są zmieniane (na przykład podczas wprowadzania utrwalacza lub innego buforu), ważne jest, aby dokładnie zawiesić (z wirowaniem) osad komórkowy w minimalnej porcji (~10 - 20 μL) "wychodzącego" układu cieczowego. Pomoże to zapobiec zbrylaniu się i zapewni uzyskanie równych zawiesin poszczególnych komórek. Przejdź do kroku "Hybrydyzacja" poniżej.

4. Hybrydyzacja

1. Przygotuj bufor do hybrydyzacji/mycia, używając komercyjnych roztworów klasy biologii molekularnej wymienionych w tabeli materiałów. Końcowe stężenia składników buforowych wynoszą 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% dodecylosiarczanu sodu, uzupełnione do końcowej pożądanej objętości wodą molekularną i przefiltrowane za pomocą strzykawki 0,22 μm lub filtra kubkowego. Ten sam bufor, bez dodawania sond (patrz poniżej) jest używany jako bufor myjący. Podgrzej hybrydyzacyjne i myjące do 55°C.
2. Dodać znakowane fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowe Sal3 (Nordentoft i wsp., 1997; 5'- AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3') i Salm-63 (Kutter i wsp., 2006; 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3') (Tabela materiałów) do podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego. Stosuje się całkowite stężenie sondy wynoszące 5 ng ^μL-1 (np. 2,5 ng ^μL-1 na sondę; Bisha i Brehm-Stecher, 2009a).
3. W przypadku próbek przesyłanych bezpośrednio na taśmę i do wzbogacania w fazę stałą, należy nałożyć na szablonowy obszar styku próbki taśmy z 300 μl buforu hybrydyzacyjnego zawierającego koktajl sondy i zhybrydyzować komórki związane taśmą w wilgotnej, szczelnej komorze inkubacyjnej ustawionej na 55°C. Jeśli używany jest inkubator z bezpośrednim kontaktem, taki jak przyrząd Slide Moat (tabela materiałów), próbki są hybrydyzowane przez 15 minut i można jednocześnie przetwarzać >20 szkiełek. Jeśli używany jest piec do hybrydyzacji typu obrotowego, taki jak instrument Bambino (tabela materiałów), preparaty umieszcza się w probówkach wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 ml w celu hybrydyzacji, po jednym szkiełku na probówkę. Ponieważ wymiana ciepła nie jest bezpośrednia, próbki te są hybrydyzowane przez dłuższy czas (do 30 minut).
4. Po hybrydyzacji szkiełka są usuwane, a nakładka bufora hybrydyzacyjnego zawierająca sondę jest odrzucana. Szkiełka są następnie krótko i delikatnie płukane wstępnie podgrzanym buforem myjącym, odpipetowując niewielką objętość buforu na przechylonym szkiełku podstawowym (3 płukania po 300 μl każde), lub formalnie myte (do 30 minut) za pomocą podgrzanego buforu myjącego lub zanurzane w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml zawierającej podgrzany bufor myjący. Z naszego doświadczenia wynika, że chociaż formalne mycie zapewni lepsze wyniki (mniejsze zamglenie z niezwiązanej sondy), zwykłe płukanie jest wystarczające do jednoznacznego wykrycia Salmonella spp. Następnie slajdy są suszone na powietrzu przed przejściem do poniższego kroku "Wykrywanie".
5. Hybrydyzację płynnych próbek minikultur powierzchniowych przeprowadza się poprzez odwirowanie próbek (świeżo utrwalonych lub przechowywanych w buforze do przechowywania w temperaturze -20 °C) przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g, a następnie energiczne wirowanie osadu i ponowne zawieszenie w 100 μl podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego zawierającego koktajl sondy. Próbki są hybrydyzowane w temperaturze 55°C przez 30 minut na bloku grzewczym lub innej odpowiedniej stacji inkubacji (tabela materiałów), a następnie dodaje się 500 μl wstępnie podgrzanego buforu myjącego. Podobnie jak w przypadku próbek oklejanych taśmą, próbki te można formalnie myć przez okres do 30 minut z dalszą inkubacją w temperaturze 55 °C w tym buforze do płukania, z przerywanym wirowaniem. Alternatywnie, próbki można dokładnie zwirować po dodaniu 500 μl wstępnie podgrzanego buforu myjącego, a następnie natychmiast zebrać do analizy (poniżej).
6. W ramach przygotowań do wykrycia Salmonella spp. za pomocą cytometrii przepływowej, próbki minikultury powierzchniowej cieczy są wirowane przy 2 000 x g przez 5 minut, supernatant jest odrzucany, a próbki są ponownie zawieszane w 300 μl PBS o temperaturze pokojowej (~25°C). Jeśli próbki wymagają transportu do odległego zakładu lub jeśli spodziewane jest opóźnienie między hybrydyzacją a analizą, próbki mogą być przechowywane w lodówce lub na lodzie przed analizą. Alternatywnie, próbki można przenieść do bufora do przechowywania komórek (mieszanina PBS i etanolu absolutnego w proporcji 50:50) i przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do tygodnia bez znaczących strat we fluorescencji nadawanej sondą (Bisha i Brehm-Stecher, 2009b).

5. Wykrywanie

1. W celu wykrycia Salmonella spp. na taśmie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, próbki bezpośrednio na taśmę lub wzbogacone w fazę stałą nakłada się na ~10 μl Vectashield H-1200 pożywki montażowej zawierającej jądrowy barwnik przeciwzapalny 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), zamontowane za pomocą szkiełka nakrywkowego, a następnie inkubowane w ciemności przez 10 minut.
2. Olejek immersyjny umieszcza się na szkiełku nakrywkowym, a próbki bada się za pomocą obiektywu olejowego o dużym powiększeniu (63x lub 100x). Filtr DAPI służy do ustawiania ostrości próbki, mikroskop jest następnie przełączany na odpowiedni filtr (zielony lub czerwony, w zależności od barwnika użytego do końcowego znakowania sond), a komórki Salmonelli są oceniane wizualnie zgodnie z ich fluorescencją (ryc. 2 i 3).
3. Do cytometrycznej detekcji próbek minikultur powierzchniowych cieczy można stosować różne przyrządy, w zależności od lokalnej dostępności. W naszym laboratorium próbki zawieszone w PBS są przenoszone do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 ml (BD Falcon) i badane za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto ze wzbudzeniem przy długości fali 647 nm (tabela materiałów). W przypadku wzbogaconych próbek zawierających dużą liczbę bakterii ogółem stosuje się ustawienie "niskiego natężenia przepływu" (10 μl ^min-1) i zbiera się 5 000-50 000 zdarzeń. Dane są analizowane za pomocą oprogramowania FlowJo (wersja 8.8.6, Tree Star, Inc., Ashland, OR) lub innego odpowiedniego oprogramowania analitycznego (rysunek 4, panele A i B).

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Stosowanie taśmy klejącej do pobierania próbek Salmonella spp. z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora.

Rysunek 2. Typowe wyniki pobierania próbek bezpośrednio na taśmę i wykrywania FISH Salmonella Typhimurium ATCC 14028 z powierzchni pomidora (obiektyw 100 X oil). Do znakowania tych komórek użyto koktajlu dwóch sond z czerwonymi znakami Texas (Sal3 / Salm-63).

Rysunek 3. Mikrokolonie Salmonella Typhimurium ATCC 14028 utworzone na powierzchni agaru Xylose Lysine Tergitol-4 (XLT-4) po 8-godzinnym wzbogacaniu na taśmie w temperaturze 37°C. Początkowe inokulum pobrano z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora. Wzbogacanie w fazę stałą zwiększa liczbę komórek dostępnych do detekcji, a także zwiększa zawartość rRNA w komórkach.

Rysunek 4. Użycie taśmy klejącej do pobierania próbek S. enterica serowar Typhimurium z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora, a następnie bezpośrednia analiza za pomocą FISH i cytometrii przepływowej (panel A) lub po 5 godzinach nieselektywnego wzbogacania powierzchni cieczy w minikulturze w komorze perfuzyjnej wypełnionej 500 μl bulionu sojowego z tryptikazy (panel B).

Dyskusja

Proste i szybkie metody wykrywania patogenów na powierzchniach produktów mogą pomóc w łagodzeniu chorób przenoszonych przez żywność poprzez dostarczanie aktualnych i użytecznych danych. Metody pobierania próbek oparte na taśmach samoprzylepnych są stosowane w mikrobiologii środowiskowej, klinicznej i żywności od lat 50-tych XX wieku i obejmują dociskanie taśmy "Scotch" do powierzchni w celu usunięcia mikroorganizmów, a następnie bezpośrednie badanie mikroskopowe lub przeniesienie przylegających mikroorganizmów do stałych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma do pobierania próbek Fungi-Tape	Laboratorium Urządzeń Naukowych	745	http://www.scientificdevice.com/
Taśma do pobierania próbek Con-Tact-It	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Przezroczysta taśma biurowa, ogólna	Różne		Powinny być optycznie przezroczyste, mieć niską fluorescencję wewnętrzną
Powierzchnia żywności	Lokalny sklep		spożywczyTomat– s (czerwony tomat– s na winorośli, nie woskowane ani nie olejowane) używane tutaj
Tryptykaza Rosół sojowy	Difco Laboratories	211768	Do nieselektywnego wzbogacania powierzchni cieczy w minikulturę
agarowej ksylozy-lizyny-tergitolu 4	Difco Laboratories	223420	Do Salmonella-selektywny agar (XLT-4)
Suplement agarowy ksylozy-lizyny-tergitolu 4	Difco Laboratories	235310	Do Salmonella-selektywny agar (XLT-4)
Roztwór formaliny	Sigma-Aldrich	HT5011	10% roztwór, obojętny, buforowany (utrwalacz komórek)
Absolutny etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Klasa biologii molekularnej (odwodnienie przed hybrydyzacją)
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Różne		wolne od RNaz i DNaz
	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Roztwór NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	Klasa biologii molekularnej, roztwór 5M (składnik buforowy hybrydyzacji)
Roztwór buforowy Tris-EDTA (koncentrat 100X)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8,0], 0,1M EDTA (składnik buforu hybrydyzacyjnego)
Roztwór dodecylosiarczanu sodu	Sigma-Aldrich	L4522	10% roztwór w wodzie o stężeniu 18 megaomów (bufor hybrydyzacyjny składnik)
Sondy oligonukleotydowe Sal3 i Salm-63	Zintegrowane technologie		znakowane 5' 6-karboksyfluoresceiną (FAM) lub czerwienią Texas (do mikroskopii) lub Cy5 (do cytometrii), oczyszczone HPLC
Mikrowirówka o zmiennej prędkości	Różne		Użyj średnicy wirnika do obliczenia prędkości obrotowej potrzebnej dla wartości RCF opisanych w protokole
Komora perfuzyjna CoverWell	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Niesterylne
końcówki do pipet z żelem (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Długie, cienkie końcówki zapewniają łatwy dostęp do małych otworów do pobierania próbek i manewrowość w komorze
Aluminiowy blok grzewczy lub precyzyjnie sterowana stacja grzewcza	Zastosowano tutaj różne		wytrząsarki do ogrzewania i chłodzenia Eppendorf Thermomixer R
Mini piec do hybrydyzacji Bambino	Boekel Scientific	Model 230300	Szkiełka umieszcza się w probówkach wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 ml do hybrydyzacji, nie wymiany ciepła bezpośredni
hybrydyzator szkiełek Slide Moat	Boekel Scientific	Model 240000	Zapewnia szybką, bezpośrednią transmisję ciepła przez szkiełko szkiełkowe
Vectashield H-1200 podłoże montażowe z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimalizuje wygaszanie fluorescencji podczas mikroskopii, zapewnia barwienie przeciwbarwiące DAPI
Mikroskop fluorescencyjny	Różne		Leitz Laborlux S używany tutaj
Aparat cyfrowy	Różne		Używany tutaj aparat Canon PowerShot A640
Oprogramowanie do akwizycji obrazów	Różne		oprogramowanie Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) używane
Adobe Photoshop	Adobe Do		minimalnego przetwarzania obrazów (nakładanie obrazów wykonanych w różnych kanałach)
Cytometr przepływowy	Różne		Zastosowano cytometr przepływowy FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA) z czerwonym wzbudzeniem (647 nm)
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	Używane różne		oprogramowanie FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.)