Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Streszczenie

W wielu zastosowaniach pożądana jest hodowla embrionów myszy ex vivo w formie plastrów organotypowych. Na przykład wykorzystujemy linię myszy transgenicznych (tauGFP), w której ulepszona wersja zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) jest ekspresowana wyłącznie we wszystkich neuronach rozwijającego się ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego¹, co umożliwia zarówno filmowanie unerwienia kończyny przedniej, jak i manipulowanie tym procesem za pomocą technik farmakologicznych i genetycznych². Najbardziej krytycznym parametrem w udanej hodowli takich plastrów jest metoda ich przygotowania. Po obszernych testach różnych metod stwierdziliśmy, że wibrotom jest najlepszym możliwym urządzeniem do krojenia embrionów w taki sposób, aby rutynowo uzyskiwać hodowlę wykazującą żywotność przez okres kilku dni, a co najważniejsze, rozwijającą się w sposób specyficzny dla wieku. W przypadku embrionów w połowie okresu gestacji obejmuje to prawidłowy wzrost nerwów rdzeniowych z rdzenia kręgowego i zwojów rdzeniowych do ich celów w obwodzie oraz właściwe różnicowanie tkanki szkieletowej i mięśniowej.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przetwarzania całych zarodków z dni embrionalnych (E) od E10 do E12 w plastry o grubości 300 - 400 µm do hodowli w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek, które mogą być badane do dwóch dni po przygotowaniu plastrów. Kluczowym elementem sukcesu tego podejścia jest zastosowanie wibratomu do krojenia każdego zarodka zatopionego w agarozie. Następnie plastry hoduje się na wkładkach z membraną hodowlaną Millicell umieszczonych na małej objętości medium, co stanowi technikę hodowli na granicy faz. Jeden miot średnio z 7 zarodkami rutynowo pozwala na uzyskanie co najmniej 14 plastrów (2-3 plastry regionu kończyny przedniej z każdego zarodka), co nieznacznie różni się w zależności od wieku zarodków oraz grubości plastrów. Około 80% hodowanych plastrów wykazuje wypustki nerwowe, co można mierzyć przez cały okres hodowli². Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z wykorzystaniem linii myszy tauGFP.

Protokół

Część 1: Przygotowanie do krojenia i hodowli.

1. Przygotować 10-cm płytki do hodowli tkankowych z pożywką do krojenia (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% płodowa surowica bydlęca, 0,5% glukozy, 1 mM glutaminy, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) oraz 3-cm wkładki z membraną hodowlaną Millicell-CM 0,4-μm i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
2. Podgrzać w mikrofalówce 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w PBS i utrzymać na płycie grzejnej w temperaturze około 37°C.
3. Napełnić 10-cm bakteriologiczne szalki Petriego PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8mM KH₂PO₄) i umieścić na lodzie.
4. Przygotować urządzenie chłodzące do mikrotomu lub upewnić się, że kuweta z buforem i elementy chłodzące są przechowywane w zamrażarce w celu ich schłodzenia.

Część 2: Osadzanie zarodków w medium.

1. Wyjąć zarodki z macicy i zbadać je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w celu sprawdzenia ekspresji GFP.
2. Umieścić zarodki na odwróconej szalce Petri o średnicy 10 cm i ułożyć je za pomocą pasków papieru Whatmana, aby usunąć nadmiar PBS.
3. Nałożyć agarozę na zarodek, aby utrwalić go w tej pozycji. Pozostawić agarozę do stężenia.
4. Ograniczyć obszar wokół zarodka poprzez wycięcie go żyletką.
5. Obrócić zatopiony zarodek na drugą stronę.
6. Nałożyć dodatkową agarozę na tkankę zarodkową, aby upewnić się, że zarodek jest całkowicie zatopiony.
7. Przygotować blok agarozy z czystymi krawędziami i zamontować go na uchwycie wibratomu za pomocą Loctite 406, specjalnego kleju podobnego do "Krazy Glue".

Część 3: Procedura krojenia.

1. Przygotować schłodzoną tackę z buforem oraz element chłodzący.
2. Włożyć uchwyt z przyklejoną tkanką i dodać 1x HBSS (HBSS bez Ca²⁺ i Mg²⁺, bufor HEPES 10 mM pH 7.3, penicylina/streptomycyna 500 U/ml) do momentu całkowitego zakrycia próbki.
3. Włożyć i zamocować uprzednio oczyszczone (70% etanol) ostrze mikrotomu.
4. Przygotować skrawki o grubości 350 - 450 μm i przenieść je za pomocą skróconych szklanych pipet Pasteura do płytek hodowlanych przechowywanych w lodzie.
5. Za pomocą pęsety ostrożnie usunąć agarozę z każdego skrawka i przenieść go na membrany hodowlane Millicell. Na jednej membranie w 10-cm płytce hodowlanej wypełnionej 6 mL pożywki można hodować około 4 skrawków.
6. Inkubować skrawki w temperaturze 37°C i 5% CO₂ (Pożywka: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% płodowa surowica bydlęca, 0.5% glukozy, 1mM glutaminy, 2.5 mM HEPES, pH 7.3). W przypadku wykonywania serii obrazowania time-lapse należy utrzymywać stałą objętość pożywki. Przy krótkich seriach obrazowania w określonych odstępach czasu wystarczy pozostawić pożywkę bez zmian. Przy dłuższych okresach hodowli zaleca się wymianę pożywki co 12-20 godzin.

Część 4: Obrazowanie wypustek nerwów rdzeniowych pod mikroskopem.

1. Wykonaj obrazowanie nerwów rdzeniowych, umieszczając 10-cm płytkę do hodowli tkankowej zawierającą membrany hodowlane Millicell z przekrojami pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Oznacz orientację membran hodowlanych Millicell na stoliku mikroskopu, aby poprawnie je ustawić podczas kolejnego punktu czasowego obrazowania.
3. Obrazuj wypustki nerwów rdzeniowych, używając obiektywów 4x (apertura numeryczna [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) lub 20x (NA 0,5).

Rysunek 1 przedstawia serię obrazów ukazującą wzrost nerwu rdzeniowego podczas 20 godzin hodowli przy użyciu obiektywów 4x i 10x.

Rycina 1 Seria obrazów wzrostu nerwów rdzeniowych w przekroju poprzecznym embrionu tauGPF homozygotycznego. * = neurony ruchowe brzusznej części rdzenia kręgowego, strzałka = DRG. Oznaczono oś grzbietową (D)-brzuszną (V) przekroju. Paski skali: 200 μm.

Dyskusja

W rozległym porównaniu metod przygotowywania kultur plastrów embrionalnych zarodków myszy w połowie okresu gestacji (E10 - E12) zaobserwowaliśmy, że wibratom bezsprzecznie daje najbardziej wiarygodne wyniki, zarówno pod względem ogólnej żywotności kultur, jak i powtarzalności wzorców wyrastania nerwów. W przeciwieństwie do nich, plastry przygotowane przy użyciu siekacza do tkanek McIlwaina³ okazały się całkowicie nieżywotne. Pierwotnie stosowaliśmy metodę gilotynową⁴, w której cały miot zarodków moż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Narzędzia do sekcji	Fine Science Tools	różne
Agaroza L.M.P.	Invitrogen	15517-022
Papier Whatmann	Whatman, GE Healthcare	3030917
Skrócone pipety wypalane ogniowo
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamina 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Wibratom	Microm International	HM 650 V
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Wkładki Millicell-CM	EMD Millipore	PICMORG 50
Płytki hodowlane 10 cm	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Żyletki	Thermo Fisher Scientific, Inc.	brak
Mikroskop sekcyjny	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
Obiektyw x4	Olympus Corporation	seria PL
Obiektyw x10	Olympus Corporation	seria UPLFL –PH
Filtr	Olympus Corporation	U-MNIBA2
Kamera CCD	Soft Imaging System	SIS F-View II
Wyposażenie komory grzewczej	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 i inkubator S #11531171