Kompleksowy i efektywny kosztowo monitoring laboratoryjny HIV/AIDS: afrykański wzór do naśladowania

Podsumowanie

Terapia antyretrowirusowa w leczeniu HIV/AIDS jest monitorowana na szeroką skalę w RPA. Cytometria przepływowa jest łączona z badaniami hematologicznymi (CD45), immunologicznymi (CD4) oraz analizą CD38 powiązaną z wiremią. Metody te, zarejestrowane w laboratoriach NHLS-SA w Johannesburgu, są nowoczesne, kostu-efektywne i charakteryzują się wzmocnioną lokalną kontrolą jakości, stanowiąc wzór dla diagnostyki w warunkach ograniczonych zasobów.

Streszczenie

Prezentujemy film dotyczący wspierania terapii antyretrowirusowej (ART) przez odpowiednie usługi laboratoryjne, stanowiące południowoafrykański wzorzec ekonomicznego, wielkoskalowego testowania diagnostycznego. W krajach o niskich dochodach niedroga terapia ART zmieniła perspektywy przeżycia pacjentów seropozytywnych w kierunku HIV, jednak istnieją wątpliwości, czy istnieje potrzeba laboratoryjnego monitorowania ART i jakim kosztem – zwłaszcza w sytuacjach, gdy ogólna jakość usług patomorfologicznych wciąż może być bardzo niska. Odpowiedzią jest ustanowienie ekonomicznie uzasadnionych usług z lepszą koordynacją i surowszą wewnętrzną oceną jakości, niż ma to miejsce w krajach zachodnich. Film ten, zrealizowany w Narodowej Służbie Laboratoriów Zdrowia (NHLS-SA) na Uniwersytecie Witwatersrand w Johannesburgu w RPA, przedstawia taki skoordynowany schemat, rozszerzający oryginalną dwukolorową strategię bramkowania PanLeucoGating (PLG) dla CD4-CD45. Sześć modułów prezentacji wideo ukazuje prostotę 4-kolorowego badania cytometrycznego, które pozwala połączyć testy hematologiczne, immunologiczne i wirusologiczne w jednej probówce. Moduły wideo obejmują: (i) konfigurację instrumentów; (ii) przygotowanie próbek; (iii) oznaczanie liczby bezwzględnej i monitorowanie jakości każdej próbki za pomocą szybkości zliczania kulek (bead-count-rate); (iv) hematologiczny test CD45 w celu oznaczenia liczby i rozkładu leukocytów; (v) liczbę komórek CD4 oraz (vi) aktywację limfocytów T CD8+ mierzoną ekspresją CD38, będącą parametrem powiązanym z wiremią. Potencjalne oszczędności kosztów są znaczące. Taki układ jest doskonałym przykładem możliwości wykonywania > 800-1000 testów dziennie przy surowszej kontroli jakości niż stosowana w laboratoriach zachodnich, a także z transferem technologii do innych laboratoriów w ramach sieci NHLS-SA. Eksperci, kierownicy laboratoriów i decydenci odpowiedzialni za wprowadzanie nowoczesnych technologii medycznych często nie mają możliwości zapoznania się z najnowszymi szczegółami technicznymi wdrażanymi w dużych laboratoriach regionalnych przy ogromnym obciążeniu pracą. Dlatego niniejszy film przedstawia szczegóły tych nowych rozwiązań.

Protokół

Wstęp

Współczesne wysiłki naukowe w dziedzinie biomedycyny prowadzą do wymiernych korzyści, w tym do wprowadzenia wydajnej diagnostyki chorób zakaźnych. Wysokiej jakości i szybka diagnostyka są niezbędne ze względu na ryzyko rozprzestrzeniania się chorób wynikające z globalnych podróży oraz obecny, niszczycielski wpływ infekcji wirusowych i bakteryjnych w dotkniętych ubóstwem regionach świata¹.

W krajach o ograniczonych zasobach z powodzeniem wprowadzono leczenie pacjentów HIV-dodatnich terapią antyretrowirusową (ART)^2,3. Protokoły ART opierają się obecnie na (i) testach serologicznych dla osób HIV+, (ii) przyjmowanych raz na dobę kombinacjach schematów leków genetycznych stosowanych jako ART „pierwszego rzutu” oraz (iii) oznaczeniach CD4 i/lub wiremii w celu podjęcia decyzji o rozpoczęciu ART. Protokoły te ulegają jednak zmianom, ponieważ zakres stosowania ART może zostać obecnie rozszerzony dzięki mniej rygorystycznym wytycznym, pozwalającym na wcześniejsze wdrożenie ART przy wyższych wartościach CD4 ². Co istotne, zwiększenie liczby pacjentów HIV+, którzy otrzymują ART przy wyższym stężeniu komórek CD4+/μl krwi, może nawet spowolnić rozprzestrzenianie się HIV, mimo obecnego braku szczepionki przeciwko HIV ^{4, 5}.

W związku z tym zakażenie HIV może stać się chorobą przewlekłą u coraz większej liczby osób będących w stanie remisji, co w stopniu większym niż kiedykolwiek będzie wymagać zorganizowanej opieki medycznej, jednak zły stan medycyny laboratoryjnej w Afryce wciąż może stanowić barierę dla skutecznej opieki zdrowotnej ⁶. Pojawiają się głosy podkreślające, że udzielanie krótkoterminowych grantów nie zapewnia zrównoważonych rozwiązań ^7-9, a fundusze związane z HIV przekazywane przez kraje zachodnie w obecnej skali nie mogą być kontynuowane w nieskończoność ^8,9. W 2008 roku na programy zwalczania AIDS w krajach o niskim i średnim dochodzie wydano 15,6 miliarda USD, z czego około 50% pochodziło ze źródeł zewnętrznych, w tym z Ameryki Północnej. Obliczone trendy wskazują, że wydatki te wzrosną do poziomu 2-3 razy wyższego i że epidemia nadal będzie występować w 2031 roku, chyba że zmieni się obecne ogólne podejście ⁹.

W związku z tym kraje afrykańskie muszą przyczynić się do poprawy profilaktyki HIV oraz mądrzejszych oszczędności kosztów ⁹. Sugerujemy tutaj, że najnowsze, innowacyjne „wzorce” dla rutynowej pracy zostaną opracowane i wprowadzone w krajach o ograniczonych zasobach (np. w Afryce lub Indiach). Są to obszary globu, w których naukowcy nauczą się w pełni korzystać z obecnego wsparcia międzynarodowego, a następnie wykorzystają swoje umiejętności do dalszej poprawy codziennej technologii, przyczyniając się do globalnego rozwoju.

W medycynie zachodniej działania diagnostyczne w dużych ośrodkach akademickich i szpitalach są często „zdeptamentalizowane”, co oznacza, że dla różnych dyscyplin mogą istnieć oddzielne „strefy zainteresowań”, prowadząc do fragmentacji na laboratoria hematologiczne, wirusologiczne, retrowirusologiczne, bakteriologiczne, serologiczne, immunologiczne i cytologiczne, zamiast stosowania zunifikowanego podejścia z wykorzystaniem minimalnego zestawu wielodyscyplinarnych testów diagnostycznych w laboratorium chorób zakaźnych. Ponadto testy diagnostyczne mogą być zbyt skomplikowane i kosztowne. Ewidentnie usługi te wymagałyby lepszej koordynacji, jednak jest mało prawdopodobne, aby takie wysiłki unifikacyjne pochodziły w całości z krajów zachodnich. W związku z tym wiodące laboratoria i instytuty, takie jak National Health Laboratory Service (NHLS-SA) we współpracy z University of Witwatersrand w Johannesburgu w RPA, stają przed dodatkowym zadaniem dalszego rozwijania, modyfikowania, reorientacji i ulepszania swojej kosztowo efektywnej diagnostyki opartej na nowoczesnej technologii.

W niniejszym filmie opisujemy metody cytometrii przepływowej służące do monitorowania terapii antyretrowirusowej (ART) u pacjentów zakażonych HIV. Technologia ta jest przedstawiona krok po kroku w sześciu modułach, obejmujących kombinację istotnych badań hematologicznych, immunologicznych i wirusologicznych w jednej probówce, w połączeniu z niezbędną wewnętrzną kontrolą jakości (QC) w celu zapewnienia powtarzalności testów ¹⁰. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych wykorzystanych w tej metodzie jest w pełni ugruntowane naukowo. Odczynnik CD45 służy do zliczania białych krwinek ^11-13, a w połączeniu z CD4 do wyliczania limfocytów T „pomocniczych”, które są głównym celem HIV ^12-14. „Konstrukcyjnym zabiegiem” jest wykrywanie w tej samej probówce markera aktywacji CD38 na komórkach T CD8+ jako badania powiązanego z wiremią (VL) HIV ^15-17. Aby podkreślić wkład RPA, zaznaczamy, że koncepcje te oraz ich kosztowo efektywne praktyczne kombinacje zostały opracowane w ramach współpracy NHLS-Wits w oparciu o wiodące technologie zachodnie ^{10,12,13,16,17}.

Testy te, wykonywane w kombinacji, będą niezbędne do prawidłowego monitorowania pacjentów poddawanych długotrwałej ART. Po przeanalizowaniu efektywności kosztowej okazuje się, że ta skoordynowana technologia cytometrii przepływowej jest ekonomiczna ^16,18,19. Te jednoprobówkowe testy stanowią oszczędność kosztów w porównaniu z ich zachodnimi odpowiednikami oraz w stosunku do podobnych testów wykonywanych za pomocą oddzielnych urządzeń i/lub przeprowadzanych jako różne testy zastępcze z wykorzystaniem innych metod. Oszczędności te zostały szczegółowo omówione w dyskusji.

Aby umożliwić wdrożenie tej w zasadzie prostej technologii, która wykorzystuje czterokolorową cytometry przepływową w jednej probówce, niezbędne jest przedstawienie kroków technicznych w formie wideo. Eksperci, kierownicy laboratoriów oraz decydenci odpowiedzialni za wprowadzanie nowoczesnych technologii medycznych często nie mają możliwości zapoznania się z najnowszymi szczegółami technicznymi stosowanymi w dużych laboratoriach regionalnych z ogromnym obciążeniem pracą. W związku z tym niniejsze wideo prezentuje szczegóły nowych rozwiązań wprowadzonych w RPA w celu optymalizacji procesu testowania. >1000 próbek klinicznych każdego dnia roboczego ^10,13,16,17.

Protokół

Cytometria przepływowa

Badania przeprowadzono za pomocą 4-kolorowej cytometrii przepływowej, jednak testy można również wykonać przy użyciu 2 kolorów w dwóch równoległych probówkach (patrz poniżej). Do analiz wykorzystano cytometr Beckman-Coulter XL-MCL o stabilnej hydraulice ²¹, lecz ta sama technologia może być stosowana również w innych cytometrach. Opisana metoda pozwala na obsługę dużych codziennych obciążeń roboczych na poziomie ~800-1100 próbek na dzień^10,13.

Moduł 1: Konfiguracja aparatury

Codzienna konserwacja wewnętrzna polega na czyszczeniu wykonywanym dwa razy dziennie: podczas uruchamiania oraz po zakończeniu analizy ostatniej próbki pacjenta. Obejmuje ona płukanie linii próżniowych i zastosowanie preparatu Clenz (5% podchloryn sodu; BC, Miami, FL). Ponadto, po każdym cyklu 30 probówek w karuzeli, przez system przepuszczany jest preparat Clenz oraz woda destylowana, aby zminimalizować odkładanie się białek.

Podczas codziennego uruchamiania sprawdzane są odczyty próżni i ciśnienia. Potwierdza się, że poziomy tła pozostają na akceptowalnym poziomie (<100 zdarzeń w 100 sec). Po analizie pierwszej próbki krwi ustala się, że w alikwocie płynu osłonowego carryover wynosi <1%. Następnie codziennie monitoruje się ustawienie lasera i czułość fluorescencji, używając próbki FlowCheck ²¹. Obserwuje się, że średnie numery kanałów są spójne (500±50) przy niskiej zmienności (wartości CV połowy piku <2%). Kompensację sprawdza się co tydzień; naniesiono koraliki FlowSet, aby sprawdzić, czy średnie wartości kanałów mieszczą się w granicach 1% z góry ustalonych wartości docelowych ²². Aby wizualnie potwierdzić precyzję na wykresach Leveya-Jenningsa, codziennie wyświetla się średnie numery kanałów oraz wartości współczynnika zmienności połowy piku (HPCV) dla czterech kanałów fluorescencji (FL1-FL4). Następnie potwierdzana jest dokładność zliczania CD4 na dwóch poziomach CD4. Podczas testu PLG-CD4 w procesach kontrolnych z użyciem stabilizowanej krwi (IMMUNOTROL) stosuje się poziom niski normalny (450-700 komórek CD4/μl) oraz poziom niski (100-200 komórek CD4/μl, w zależności od partii; ref 23). Wymagane jest, aby wartości Immunotrol mieściły się w granicach 0,5 SD od średniej przy %CV < 5%, zgodnie z wymogami międzynarodowych programów BC-IQAP ²⁴, UK NEQAS ²⁵ oraz AFREQAS ²⁶. Istotne jest, aby dzięki tym prostym, zorganizowanym środkom, przedstawionym na filmie, wytrzymałe cytometry przepływowe mogły utrzymać wymaganą stabilność zarówno dla bezwzględnego zliczania komórek, takiego jak testy CD4, jak i dla pomiarów intensywności fluorescencji stosowanych w przypadku markera aktywacji CD38. Stabilność ta została niedawno szczegółowo udokumentowana ¹⁷, co potwierdza wcześniejsze badania z wykorzystaniem innych cytometrów ^15,27.

Podczas cotygodniowej konserwacji pliki danych w trybie listy (LMD) są archiwizowane do późniejszego wykorzystania, a następnie zarchiwizowane materiały są usuwane z dysku twardego cytometru.

Miesięczna konserwacja obejmuje czyszczenie pojemników na odczynniki, zbiornika na płyn osłonowy (sheath), zbiornika Clenz oraz zbiornika na odpady. Głowica do próbek w trybie karuzelowym jest czyszczona, a wszystkie filtry są wyjmowane i płukane. Czyszczenie to obejmuje również stacje przygotowawcze TQPrep i PrepPlus2 (BC, FL). Pipety używane do przygotowania manualnego są walidowane wewnętrznie co najmniej raz na 3 miesiące, jednak w przypadku podejrzenia niedokładności pipetowania, pipeta jest natychmiast wycofana z eksploatacji w celu podjęcia działań korygujących. Konserwacja półroczna jest planowana przez firmę Beckman Coulter, SA.

Moduł 2: Przygotowanie próbek

W przypadku protokołu dwubarwnego dla CD45/CD4 z bramkowaniem PanLeuco ⁵ stosowany jest zestaw Beckman Coulter FlowCARE ²⁸ w procedurze lizy bez przemywania (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL). Zestaw ten zawiera CD45-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC; zielony) oraz CD4-fikorytrynę (PE; pomarańczowy). Kulek Flow-Count²⁹ zakupiono w dużych ilościach i dodaje się je w celu ułatwienia pracy operatorowi, ponieważ znana liczba kulek w znanej objętości jest pipetowana bezpośrednio do próbki ³⁰. Odbywa się to przy użyciu tego samego sposobu pipetowania, który służy do odmierzania objętości krwi. W związku z tym szybkość zliczania kulek (BCR) w oczekiwanym zakresie wskazuje, że pipetowanie w danej próbce zostało wykonane precyzyjnie, zgodnie z opisem w Module 3 poniżej. Co ważne, w tym przypadku najlepiej sprawdza się prosta metoda pipetowania, określana jako „pipetowanie bezpośrednie” (forward pipetting), pod warunkiem, że objętości kulek i krwi są dostarczane tym samym pipetorem i końcówką oraz przy identycznym sposobie obsługi 30. Stwierdzono, że pipetowanie bezpośrednie zapewnia optymalną ogólną jednolitość między laboratoriami, zarówno pod kątem operatorów osiągających cele pipetowania w dopuszczalnych granicach tolerancji, jak i powtarzalności wielokrotnego dozowania, mierzonej współczynnikiem zmienności (%CV) ^10,31,32. Metoda ta, prezentowana na lokalnych kongresach ³², jest zatwierdzona do użytku zgodnie z wytycznymi Południowoafrykańskiego Narodowego Systemu Akredytacji (SANAS, www.SANAS.co.za). Takie zastosowanie kulek do BCR różni się od innych wolumetrycznych metod zliczania, w których najczęściej stosuje się liofilizowane produkty z kulkami, takie jak preparaty BDS Trucount, zawierające znaną liczbę kulek. Preparaty te są doskonałe do dokumentowania stabilności układu hydraulicznego analizatorów przepływowych metodą szybkości zliczania przepływu (FCR) ^20,31. Niemniej jednak stosowanie gotowych probówek zawierających kulki komplikuje technologię, ponieważ w tym przypadku niezbędne jest dostarczenie objętości krwi do tych probówek z najwyższą absolutną precyzją. Powszechnie przyjmuje się, że w tym celu, po odpowiednim przeszkoleniu, dopuszczalna jest jedynie technologia „pipetowania odwrotnego” (reverse-pipetting). Nasza metoda BCR jest zatem tańsza, bardziej informacyjna, prostsza i łatwiejsza do opanowania – co pokazano w filmie – w porównaniu z alternatywnymi podobnymi metodami ^10,31,32. Zauważono również, że operatorzy stosujący pipetowanie bezpośrednie rzadziej zasysają próbkę do wnętrza pipetora, co przy pipetowaniu odwrotnym może prowadzić zarówno do uszkodzenia mechanizmu wewnętrznego, jak i konieczności ponownej kalibracji, co jest trudne w lokalizacjach oddalonych. Nasza metoda BCR eliminuje również potrzebę stosowania zautomatyzowanych systemów pipetowania w małych i średnich laboratoriach (Lista 1).

Próbki krwi są zawsze przetwarzane w komorach z laminarnym przepływem powietrza klasy II (biohazard cabinets). Aby uniknąć nadmiernego hałasu podczas filmowania, prezentowane wideo jest inscenizacją z wykorzystaniem bezpiecznych materiałów poza tymi komorami. Protokół akwizycji PLG-CD4 na cytometrach pozwala na zatrzymanie pomiaru po osiągnięciu określonego limitu czasowego lub kontynuowanie akwizycji do momentu zarejestrowania 5000 zdarzeń limfocytów, aby zwiększyć dokładność w przypadku próbek z niską liczbą CD4.

Moduł 3: Szybkość zliczania kuleczek (BCR)

Monitorowanie wskaźników liczby kulek (BCR) w naszym systemie lub dla każdej próbki kontrolnej jest obliczane zgodnie ze wzorem liczba zdarzeń kulek/sekunda ^{10,13,30,32,33}. Wartości średniej, SD i %CV są wykorzystywane w arkuszu kalkulacyjnym do wygenerowania wykresu sekwencyjnego w celu identyfikacji wartości odstających BCR ³⁰. Potwierdzają one optymalne działanie trzech systemów: pipetowania, przetwarzania i analizy, określanych jako weryfikacja przygotowania próbek (SPV), stosowanych zarówno w przypadku próbek pipetowanych ręcznie, jak i przy użyciu automatycznego instrumentu pipetującego PrepPlus2 ¹⁰.

Podczas akwizycji wyniki BCR są wyświetlane w czasie rzeczywistym bezpośrednio na monitorach. W cytometrach BC wartość średniego BCR wynosi 80±5 zdarzeń/s. Wykazujemy, że aberracyjne BCR-y są identyfikowane i ponownie analizowane przed wydaniem wyników pacjenta. Algorytm drzewa decyzyjnego przedstawiono na Rysunku 1 (patrz również ref.10).

Awarie instrumentów są sygnalizowane przez wahania BCR monitorowane podczas weryfikacji precyzji podłużnej (LPV) w celu wykrycia trendów, wzorców i nagłych przesunięć w pipetowaniu¹⁰. Weryfikacja precyzji układu hydraulicznego (FPV) jest opcjonalną procedurą wewnętrzną, w której pojedyncze rozcieńczenie kulek jest rozdzielane do 10 probówek w celu sekwencyjnego pomiaru, co pozwala potwierdzić oznaki niestabilności hydraulicznej w przypadku potencjalnie nieprawidłowo działającego instrumentu ¹⁰.

Moduł 4: CD45

Do rutynowych pomiarów liczby bezwzględnej w naszych badaniach codziennie wykorzystuje się analizator morfologii krwi LH-750 (Beckman Coulter), kalibrowany co miesiąc, który służy jako referencja dla liczenia białych krwinek (WCC), z którą porównywane są cytometry przepływowe. Wyniki WCC generowane na podstawie CD45 w cytometrach przepływowych są również codziennie walidowane poprzez porównanie z trzema poziomami stabilizowanych kontroli pełnej krwi Beckman Coulter 5C. Dopuszczalne granice zgodności WCC pomiędzy pomiarami CD45 w cytometrii przepływowej a analizatorami morfologii krwi wynoszą <5% ¹⁰. Wskazuje to, że w sytuacjach, gdy ograniczenia zasobów są bardziej dotkliwe niż w naszej jednostce, pojedynczy instrument, taki jak cytometr przepływowy, wydaje się być wystarczający do zapewnienia klinicznie odpowiednich wyników WCC, w tym liczby komórek CD4.

Różnicowe obliczenia liczby białych krwinek są przeprowadzane na różnych analizatorach hematologicznych, które różnią się między sobą, szczególnie w zakresie oceny liczby monocytów. Wzorzec różnicowej ekspresji CD45 jest klasycznym zastosowaniem technologii przepływowej do różnicowego obliczania WCC ^{11,12, 34}. Ponieważ WCC dla CD45 oraz obliczenia różnicowe pochodzące z cytometrii przepływowej okazały się dokładne, precyzyjne i niezawodne, mogą one być rutynowo włączane do metody testowej PLG-CD4 i udostępniane klinicystom bez dodatkowych kosztów.

Nieprawidłowe wzorce CD45 są odnotowywane na wykresach CD45/side scatter w protokole PLG-CD4, a następnie weryfikowane na barwionym rozmazie krwi w celu przeprowadzenia dalszej diagnostyki klinicznej. Metoda ta pozwala wykryć infekcje (bakteryjne i wirusowe), białaczkę oraz chłoniaka zarówno u pacjentów HIV-ujemnych, jak i HIV-dodatnich ^{34, 35}. Podczas rutynowej kontroli laboratoryjnej u pacjentów z HIV pełna morfologia krwi często nie jest zamawiana w laboratorium hematologicznym. W związku z tym nieprawidłowe wzorce CD45 mają znaczenie diagnostyczne, gdy zostaną przypadkowo zaobserwowane w próbkach przekazanych do oznaczania liczby CD4. Dodatkową zaletą jest możliwość dokładnego określenia bezwzględnej liczby CD4, nawet u pacjentów z obecnością białaczki lub chłoniaka we krwi ³⁵.

Cytometria przepływowa CD45 jest odpowiednim narzędziem do standaryzacji hematologii. Instrumenty hematologiczne znacząco różnią się od siebie. Sugerujemy wprowadzenie kontroli jakości opartej na cytometrii przepływowej CD45 dla rozmazów WBC w celu porównania i standaryzacji analizatorów hematologicznych ^10,36.

Moduł 5: CD4

Protokół PLG-CD4 wprowadzony w oprogramowaniu Beckman Coulter XL składa się z ośmiu wykresów kropkowych (dot-plots). Z nich 4 służy do oznaczenia liczby komórek CD4, a 4 do monitorowania jakości ^12,13. Wśród nich istotne są dwa wykresy kropkowe przedstawione na Rys. 2. Wszystkie komórki białe są identyfikowane przy użyciu CD45 i rozproszenia bocznego (region A na wykresie kropkowym 2), podczas gdy zanieczyszczenia, erytrocyta/cienie erytrocytów oraz płytki krwi są pomijane. Zdarzenia CD45+ są następnie przenoszone na wykres kropkowy 3, gdzie limfocyty CD4+ są identyfikowane na podstawie silnej ekspresji CD4 i niskiego rozproszenia bocznego (region C). Bezwzględna liczba limfocytów CD4+ jest obliczana na podstawie liczby zdarzeń w regionie C oraz WCC (w regionie kalibracji Flow Count F). Wartości CD4% limfocytów są uzyskiwane z regionu B na wykresie kropkowym 2. Limfocyty T silnie CD4+ oraz monocyty słabo CD4+ są rozróżniane na podstawie intensywności fluorescencji CD4 i cech rozproszenia, bez konieczności stosowania dodatkowego przeciwciała specyficznego dla komórek T CD3 w koktajlu odczynników (omówione w ref. 13).

Moduł 6: CD8/CD38

Barwienie CD8-CD38 jest częścią barwienia czterokolorowego z użyciem CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5. Odczynniki CD4/CD45 są takie same jak opisano powyżej (Flow Care PLG-CD4), a dwa dodatkowe odczynniki to CD8-ECD/CD38-PC5 ¹⁷. W przypadku korzystania z cytometru obsługującego tylko dwa kolory, dodaje się dodatkową probówkę w celu wykonania dwukolorowego barwienia CD8-FITC/CD38-PE, ponownie stosując procedurę lizy bez przemywania (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL). Strategię bramkowania podobną do tej dla CD4 stosuje się do identyfikacji limfocytów T CD8+ poprzez analizę CD8-ECD względem bocznego rozpraszania światła (side scatter) (Rycina 3). Ekspresję CD38 na limfocytach CD8+ przedstawia się na histogramie jednoparametrycznym średniej intensywności fluorescencji (MFI) CD38-PC5 w stosunku do liczby komórek ^16,17. Wartości MFI dla CD38 są nanoszone sekwencyjnie dla każdej wizyty tego samego pacjenta. Pierwsza wizyta (przed rozpoczęciem leczenia) stanowi wartość MFI „wyjściową” (baseline), do której porównywane są wartości MFI dla CD38 z każdej kolejnej wizyty tej samej osoby¹⁶.

Kontrola i stabilność instrumentu, opisane w Module 1, opierają się na codziennym pozyskiwaniu danych Flow Check w celu monitorowania wyrównania laserów i stabilności napięcia. Flow Set służy do ustawienia kompensacji kolorów dla wszystkich czterech kanałów fluorescencyjnych (patrz. powyżej). Immunotrol jest „negatywną” próbką kontrolną procesu. Kontrolami „pozytywnymi” są monocyty w normalnej krwi wykazujące 9 x 10³ liczba cząsteczek CD38 na komórkę oraz znana, nieleczona próbka HIV+ ¹⁷.

Sieć laboratoriów Narodowej Służby Laboratoriów Zdrowia RPA (SA-NHLS) przyjęła

metody kontroli jakości ustandaryzowane w 70 laboratoriach^{13, 33} z scentralizowaną bazą danych zawierającą standardowe procedury operacyjne i materiały szkoleniowe. Laboratoria w sieci otrzymują wsparcie poprzez dyskusje, dalsze szkolenia oraz regularne audyty, w tym weryfikację techniki pipetowania ^32,33. Program oceny jakości jest monitorowany co miesiąc. W ten sposób zarządzanie jakością jest zdecentralizowane regionalnie, ale wysokie standardy są utrzymywane dzięki wsparciu działu QA SA-NHLS^{13, 26}.

Lista 1. Potencjalne oszczędności kosztów przy zastosowaniu skoordynowanej cytometrii w chorobie HIV:

1. Wykorzystanie jednego urządzenia, z którym personel jest zaznajomiony i na które przysługuje kontrakt serwisowy, zamiast stosowania wielu urządzeń hematologicznych, immunologicznych i wiruologicznych
2. Wykonywanie analiz w jednej probówce, bez dodatkowych kosztów i bez konieczności przesyłania próbek pomiędzy różnymi lokalizacjami, obejmujące zarówno WCC, różnicowanie WBC, testowanie CD4 oraz monitorowanie CD38MFI w celu przewidzenia odpowiedzi na ART
3. Natychmiastowe raportowanie odpowiedzi na ART poprzez pomiar CD38 MFI, co znacznie skraca czas oczekiwania na wynik w porównaniu do tradycyjnego raportowania HIV VL (w czasie rzeczywistym)
4. Przejrzystość i użyteczność kliniczna połączonej oceny wyników na tych samych formularzach raportowania
5. Możliwość wyeliminowania potrzeby stosowania automatycznych pipet dzięki zastosowaniu prostej metody „pipetowania do przodu” oraz monitorowaniu próbek za pomocą BCR
6. Wykrywanie błędów w obsłudze próbek podczas pracy i korygowanie problematycznych wyników testów przed ich autoryzacją
7. Proaktywne zarządzanie zapobiegawcze w przypadku awarii urządzenia, prowadzące do wczesnego zamawiania serwisu przed wystąpieniem poważnej usterki
8. Diagnostyka niepodejrzewanych przypadków białaczek/chłoniaków podczas rutynowej działalności serwisowej
9. Rozszerzenie zastosowania podobnej technologii przepływowej do fenotypowania i monitorowania białaczek
10. Koordynacja testu CD38 z przechowywaniem suchych kropli krwi (DBS) do badania HIV VL u wszystkich pacjentów i oszczędność kosztów poprzez wysyłanie DBS do oceny tylko w przypadku wskazań klinicznych lub wyników CD38
11. Zastąpienie metody interferon-γ ELISpot w badaniach gruźlicy podobną technologią przepływową
12. Kontrola jakości w laboratoriach peryferyjnych wykonujących testy CD4 w trybie „point-of-care”
13. Oszczędność kosztów „niepożądanych” odczynników, takich jak przeciwciała przeciwko CD3 i markery subpopulacji (i zakup CD38 zamiast nich)
14. Zakup hurtowy niedrogich kulek do testowania BCR (zamiast kupowania drogich, gotowych do użycia probówek pomiarowych)
15. W ramach sieci – wspólne negocjacje z firmami komercyjnymi w celu uzyskania korzystnych cen hurtowych

Rysunek 1. Drzewo decyzyjne/algorytm stosowany w przypadku, gdy badana próbka wykazuje wynik odstający dla szybkości zliczania kulek (BCR). Głównym zadaniem jest wykluczenie błędu pipetowania w przeciwieństwie do sporadycznej awarii wolumetrycznej. Schemat przedstawia prawdopodobne przyczyny błędów. Wskazano również, które histogramy i statystyki protokołu są przez to dotknięte ¹⁰.

Rysunek 2. Przykład protokołu PLG CD4 obejmujący analizę CD45-FITC (zielony; oś x) względem rozproszenia bocznego (złożoność; oś y) oraz CD4-PE (pomarańczowy; oś X) względem rozproszenia bocznego (złożoność; oś y). Bramka „A” reprezentuje całkowitą populację białych krwinek z zaznaczoną bramką limfocytów „B”. Bramka „A” zostaje przeniesiona na drugi wykres po prawej stronie w celu zidentyfikowania limfocytów CD4+ w bramce „C”.

Rysunek 3. Połączenie analizy bramkowania panleukocytowego CD45/CD4 (na schematach „2” i „3”; patrz również Rys. 2) z analizą CD8/CD38 (na schematach „4” i „6”). Po przeniesieniu wszystkich leukocytów (brama „A”) na schemat „4”, limfocyty CD8+ są bramkowane na podstawie CD8-ECD (oś „x”) oraz rozproszenia bocznego (oś „y”; jak pokazano w bramie „D”). Następnie komórki CD8+ są przenoszone na schemat „6” w celu wizualizacji intensywności barwienia CD38-PC5 na histogramie jednoparametrycznym. Jest to przedstawione jako parametr „G” na schemacie „6”. Rejestrowana jest średnia intensywność fluorescencji (MFI) dla CD38-PC5. Podczas terapii ART wartość ta stopniowo spada ^16,17.

Dyskusja

W ostatnich latach programy finansowane przez organizacje charytatywne i z dotacji pomogły w ustanowieniu doskonałych praktyk klinicznych w regionach świata o ograniczonych zasobach, charakteryzujących się dużym obciążeniem zakażeniami HIV. Programy ART odniosły sukces w redukcji śmiertelności i są obecnie wdrażane przy wyższych wartościach CD4 ^2,3. Już teraz istnieją przesłanki, że te nowe środki ograniczą rozprzestrzenianie się zakażeń HIV ^4,5, mimo braku swoistej szczepionki przeciwko HIV. W naszym filmie dokumentujemy, że podczas monitorowania pacjentów w ramach ART techniki te mogą być lepiej ukierunkowane i stać się bardziej efektywne kosztowo niż te obserwowane w rutynowej praktyce stosowanej w laboratoriach zachodnich (Lista 1).

Taki model prowadzony przez kraje afrykańskie może okazać się niezbędny dla wsparcia modernizacji usług laboratoryjnych w czasie, gdy zakażenie HIV, leczone za pomocą ART, staje się chorobą przewlekłą. Taki monitoring ART wymaga precyzyjnego liczenia limfocytów CD4 oraz technologii monitorowania ładunku wirusowego, co jest zadaniem bardziej wymagającym niż zwykłe oznaczenie liczby CD4 w celu przypisania pacjentów do dowolnych grup pomocniczych przy podejmowaniu decyzji o rozpoczęciu ART ¹⁶. Dzięki zastosowaniu tej diagnostyki, tj. testu CD8/CD38, możliwe jest zmniejszenie kosztów monitorowania VL u >60% pacjentów przyjmujących ART ^16,19. Należy również podkreślić, że to test CD8/CD38 ^16,17, a nie liczenie CD4 ³⁷, pozwala prawdopodobnie na wcześniejsze wykrycie oznak nawrotu VL i/lub braku przestrzegania zaleceń terapeutycznych przez pacjenta w zakresie przyjmowania leków.

Kluczowym elementem skoordynowanej, efektywnej kosztowo usługi centralnej jest dostępność rozległej sieci krajowej lub regionalnej, wspieranej przez ekspertów i doradców akademickich, którzy znają techniczne i medyczne aspekty funkcjonowania takiej sieci. Świadczą o tym działania sieci NHLS w RPA oraz programy szkoleniowe CD4-PLG.net ^{33, 36}, które zapewniają wsparcie, edukację i ocenę jakości dla mniejszych ośrodków, co może obejmować również usługi typu „point-of-care”.

Ważne jest, aby działalność laboratoriów centralnych i laboratoriów w punkcie opieki (point-of-care) była komplementarna. Podczas gdy pierwsze pełnią podwójną rolę, zapewniając kosztowo efektywną operację usługową na dużą skalę oraz podstawowe i zaawansowane szkolenia dla laboratoriów peryferyjnych ^33,38, drugie przyczyniają się do zwiększenia zasięgu ART poprzez rekrutację pacjentów HIV+ kwalifikujących się do ART z szerszej bazy, w tym z klinik wiejskich. Należy tutaj zachować ostrożność, ponieważ diagnostyka w punkcie opieki może być znacznie droższa i nie gwarantuje automatycznie dokładności ³⁸. Rozsądne jest zatem utrzymanie dwustopniowego systemu i ułatwienie koordynacji między tymi dwoma poziomami, bez dopuszczania do zaniku któregokolwiek z nich.

Podsumowując, w dziedzinie monitorowania diagnostycznego w ramach klinicznego leczenia chorób zakaźnych, niezbędne oszczędności kosztów można osiągnąć dzięki odpowiednim usługom wykorzystującym tańszą i lepiej skoordynowaną nowoczesną technologię o znacznie poprawionej jakości ^13,39. Dobrze zorganizowane krajowe (i regionalne) świadczenia usług diagnostycznych powinny być lepiej wspierane ^6-8 poprzez unikanie scenariusza, w którym niemal cały fundusz grantowy jest marnowany na drogie i/lub niesprawdzone metody, gdy tylko zostaną one zaimportowane z krajów bogatych bez uprzedniej, starannej i konstruktywnej analizy. Podobnie, bardziej elastyczny projekt klinicznych badań terapeutycznych z pełnym zaangażowaniem lokalnych lekarzy i personelu medycznego powinien prowadzić do ograniczenia niepotrzebnie częstych i/lub zbyt ambitnych testów laboratoryjnych ³. Taka polityka dałaby większą szansę na pełniejsze wykorzystanie dostępnych, dokładnych wyników diagnostycznych w skoordynowanej ocenie kliniczno-laboratoryjnej pacjentów przyjmujących ART. Te inteligentne metody diagnostyczne mogłyby zostać wprowadzone jako pionierskie w krajach o ograniczonych zasobach ⁸ w obszarach gruźlicy i białaczek, z wykorzystaniem istniejącej, znanej platformy cytometrii przepływowej ⁴⁰.