Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Podsumowanie

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Streszczenie

Ekspresja in vitro oraz rejestracja elektrofizjologiczna rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowanych ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK-293T) jest powszechną strategią badawczą. Komórki HEK-293T muszą być wysiewane na szklane okładki przy wystarczająco niskiej gęstości, aby nie stykały się ze sobą, co umożliwia rejestrację elektrofizjologiczną bez zakłócających efektów wynikających z kontaktu z sąsiednimi komórkami. Przetransfekowane kanały muszą również wykazywać wysoką wydajność ekspresji w błonie plazmatycznej, aby podczas rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell można było wykryć prądy powyżej poziomu szumów. Heterologiczne kanały jonowe często wymagają długich okresów inkubacji w 28°C po transfekcji w celu uzyskania odpowiedniej ekspresji błonowej, jednak w tej temperaturze wzrasta utrata adhezji komórek do okładki oraz stabilności błony. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zoptymalizowaną strategię transfekcji i wysiewania komórek HEK-293T. Metoda ta wymaga przeprowadzenia transfekcji przy stosunkowo wysokiej konfluencji, a następnie inkubacji w 28°C przez różne okresy po transfekcji, aby umożliwić odpowiednią ekspresję białka kanału jonowego. Przetransfekowane komórki są następnie wysiewane na szklane okładki i inkubowane w 37°C przez kilka godzin, co pozwala na trwałe przytwierdzenie komórek do okładek i restabilizację błony. Rejestracja z komórek może odbywać się krótko po wysiewaniu lub mogą one zostać przeniesione do 28°C do dalszej inkubacji. Stwierdziliśmy, że wstępna inkubacja w 28°C, po transfekcji, ale przed wysiewaniem, jest kluczowa dla wydajnej ekspresji heterologicznych kanałów jonowych, które zazwyczaj nie wykazują dobrej ekspresji w błonie plazmatycznej. Pomyślnie przetransfekowane komórki hodowlane identyfikuje się za pomocą koekspresji eGFP lub eGFP wyrażanego z wektora bicistronowego (np. pIRES2-EGFP) zawierającego cDNA rekombinowanego kanału jonowego bezpośrednio powyżej wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) i sekwencji kodującej eGFP. Rejestracja metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell wymaga specjalistycznego sprzętu oraz wykonania polerowanych elektrod rejestrujących i L-kształtnych elektrod uziemiających ze szkła borokrzemianowego. Podawanie leków w celu badania farmakologii kanałów jonowych można realizować poprzez bezpośrednie pipetowanie leków do naczynia rejestracyjnego lub przy użyciu systemów mikroperfuzji bądź systemów przepływu grawitacyjnego, które wytwarzają nieprzerwane strumienie roztworu leku nad rejestrowanymi komórkami.

Protokół

1. Hodowla komórek

1. Ludzkie komórki embrionalnej nerki 293T (HEK-293T, Invitrogen) hoduje się w adhezyjnych monowarstwach w wentylowanych kolbach o powierzchni 25cm² (przeznaczonych do hodowli tkankowej; Cellstar; greiner bio-one) zawierających 6mL podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium; Sigma Aldrich) uzupełnionego o 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS; Sigma Aldrich), 1% pirogronianu sodu oraz 250 μg/mL penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37°C przy 5% CO₂).
   
   Komórki inkubuje się w inkubatorach CO₂ (5% CO₂) ustawionych na 37°C lub 28°C. Wszystkie prace z komórkami wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
   
   
2. Komórki są zazwyczaj pasażowane dwa razy w tygodniu, przy konfluencji ~90%, w rozcieńczeniu 1:8 w poniedziałki oraz 1:12 w czwartki. (Obrazy komórek HEK-293T wysianych z różną gęstością przedstawiono na Rysunku 1)
3. W celu pasażowania pożywkę usuwa się z kolb z komórkami poprzez aspirację, a komórki odrywa, aplikując 1mL roztworu trypsyny (Sigma Aldrich) podgrzanej do 37°C do odwróconej kolby. Następnie kolbę odwraca się i delikatnie kołysze ręcznie tak, aby roztwór trypsyny kilkakrotnie przepłynął po przytwierdzonych komórkach. Trypsynę szybko usuwa się poprzez aspirację, a następnie do kolby dodaje się mikropipetą 250 μL trypsyny i ponownie kołysze, aby roztwór trypsyny rozprowadził się po komórkach.
4. Kolby inkubuje się następnie w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C przez 3-5 minut, a następnie za pomocą pipety zawiesza się komórki w 4mL ciepłego, uzupełnionego podłoża DMEM. Niepełna trypsynizacja i zawieszenie spowodują powstawanie skupisk komórek i mogą doprowadzić do ich wzrostu w górę, a nie w zamierzoną monowarstwę. Nadmierna trypsynizacja może uszkodzić komórki.
5. Dla pasażowania 1:8 do nowej kolby zawierającej 5,5mL DMEM dodaje się 500μL zawiesiny komórek; dla pasażowania 1:12 (patrz Rysunek 1) do nowej kolby zawierającej 5,7mL DMEM dodaje się 333μL komórek. Kolby delikatnie miesza się, a następnie przenosi do inkubatora 37°C. Podczas 3-4 godzinnej inkubacji w 37°C po pasażowaniu komórki osiadają i przylegają do ścianek kolby. Początkowo komórki mają okrągły kształt, ale następnie spłaszczają się i tworzą wypustki (pseudopodia), mocniej przylegając do podłoża (Rysunek 1).
   
   Komórki powinny rosnąć w adhezyjnej monowarstwie w sposób przewidywalny. W przypadku nietypowego lub niespójnego wzrostu i wyglądu komórek należy rozważyć błędy techniczne lub kontaminację (bakterie/mykoplazmy). Kluczem do sukcesu w hodowli tkankowej jest powtarzalność.
   
   

2. Transfekcja komórek HEK-293T rekombinowanymi cDNA kanałów jonowych

1. W tym przypadku cDNA różnych kanałów jonowych są klonowane do plazmidu pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech), co pozwala na identyfikację komórek pozytywnie transfektowanych poprzez fluorescencję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP). Białko eGFP jest produkowane w transfektowanych komórkach z tego samego transkryptu co klonowany insert cDNA, poprzez translację zainicjowaną w wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu (IRES), znajdującym się bezpośrednio za insertem cDNA, a przed sekwencją kodującą eGFP (Rysunek 2). Obrazy fluorescencyjnych komórek HEK-293T, pozytywnie transfektowanych podjednostkami kanałów wapniowych w konstruktach pIRES2-EGFP, przedstawiono na Rysunku 3.
2. Przed transfekcją w pełni konfluencyjną zawartość kolby rozdziela się w stosunku 1:4 do nowej kolby i pozwala komórkom przytwierdzić się w temperaturze 37°C w inkubatorze CO₂ przez 3-4 h (patrz Rysunek 1).
3. Po przytwierdzeniu się komórek stosuje się standardową strategię transfekcji fosforanem wapnia (protokoły Cold Spring Harbor), aby wprowadzić konstrukty zawierające cDNA kanałów jonowych i podjednostek akcesoryjnych do komórek HEK. Zazwyczaj na jedną kolbę/transfekcję wykorzystuje się łącznie 12μg DNA w 600 μL roztworu do transfekcji.
4. Po kroplowym naniesieniu roztworu do transfekcji na komórki, kolbę umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc.
5. Po transfekcji komórki ostrożnie przemywa się trzykrotnie ciepłą pożywką lub solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (4-5 mL), pipetując roztwór do płukania do odwróconej kolby, a następnie powoli ustawiając kolbę pionowo i delikatnie nią kołysząc tak, aby roztwór przepłynął nad komórkami. Jeśli czynność ta nie zostanie wykonana ostrożnie, komórki mogą się odkleić, przez co po trzech etapach płukania pozostanie ich niewiele. Płukanie powtarza się jeszcze dwukrotnie, następnie do kolby dodaje się 6 mL pożywki i inkubuje w 37°C przez 2 h, a następnie przenosi do inkubatora w temperaturze 28°C.
6. Pomyślną transfekcję konstruktów pIRES2-EGFP można potwierdzić od 1 do 3 dni po transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Komórki wykazujące zieloną fluorescencję pod wpływem światła UV są pozytywnie transfektowane i powinny ekspresować heterologiczne białka kanałów jonowych oraz eGFP.

3. Wysiewanie transfektowanych komórek HEK293T w przygotowaniu do rejestracji elektrofizjologicznej

Różne kanały jonowe wykazują różną efektywność ekspresji w błonie komórkowej komórek HEK, w związku z czym pozostała część niniejszego protokołu wymaga pewnej optymalizacji w celu maksymalizacji powierzchniowej ekspresji kanałów, co umożliwi pomyślne rejestrowanie elektrofizjologiczne. Ekspresja heterologicznych kanałów jonowych w komórkach HEK, szczególnie tych pochodzących z organizmów niemlecznych, może wiązać się z pewnymi trudnościami, takimi jak (1) duże rozmiary białek, wymagające długiego czasu translacji i lokalizacji w błonie plazmatycznej, (2) brak lub odmienność motywów fałdowania i kierowania białka kanałowego, które są niezbędne w linii komórkowej ssaków, (3) różnice w częstotliwości użycia kodonów pomiędzy gatunkami. Wszystkie te czynniki mogą łącznie powodować konieczność stosowania długiego czasu inkubacji w 28°C, co zapewnia efektywną ekspresję białek i ich lokalizację na powierzchni bez podziałów komórkowych (które doprowadziłyby do rozcieńczenia heterologicznych cDNA i białek). Niestety, przedłużona inkubacja w 28°C prowadzi do odklejania się komórek i słabej stabilności błony, co utrudnia rejestrację elektrofizjologiczną. Zdecydowaliśmy się zmodyfikować konwencjonalne strategie transfekcji (przegląd w Thomas and Smart 2005), aby zminimalizować czas inkubacji w 28°C przed rejestracją i zmaksymalizować ekspresję powierzchniową. Nasza metoda wymaga, aby komórki zostały przetransfekowane, inkubowane przez okres 3-7 dni w 28°C, a następnie odklejone poprzez trypsynizację i wysiane ponownie na szkiełka podstawowe oraz inkubowane w 37°C, co stabilizuje błony i umożliwia silne przytwierdzenie komórek do szkiełek. Komórki mogą być następnie rejestrowane natychmiast lub inkubowane przez dodatkowy czas w 28°C. Uważamy, że ponowne wysiewanie komórek na szkiełka podstawowe na tym późniejszym etapie naszej metody jest absolutnie niezbędne do uzyskania szkiełek z dużą liczbą oddzielnie przytwierdzonych komórek wykazujących ekspresję kanałów.

Przedstawiamy dwie alternatywne strategie: jedną, którą preferujemy w przypadku kanałów jonowych i kompleksów kanałów jonowych niewykazujących dużych domen zewnątrzkomórkowych, które mogłyby być podatne na trawienie trypsyną (np. napięciozależne kanały wapniowe Cav3; Senatore i Spafford 2010), oraz drugą, którą stosujemy w przypadku kanałów jonowych posiadających duże domeny zewnątrzkomórkowe (np. napięciozależne kanały wapniowe typu L oraz ich podjednostki akcesoryjne; Senatore, et al. 2010).

1. 1. Komórki inkubuje się w temperaturze 28°C przez 2-6 dni, aby zapobiec podziałom komórkowym i umożliwić akumulację przetłumaczonego białka. Czas tej inkubacji musi zostać ustalony empirycznie dla każdego kanału jonowego, ponieważ ekspresja powierzchniowa zależy od czynników wewnętrznych, które determinują sposób interakcji nowo powstałego mRNA i sekwencji polipeptydowych kanałów odpowiednio z aparatem translacyjnym i szlakiem wydzielniczym.
   2. Przed wysiewaniem okrągłe szkiełka podstawowe (Circles No. 1 – grubość 0,13 do 0,17 mm; rozmiar: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) powleka się poli-_L-lizyną (Sigma) zgodnie z instrukcją producenta.
   3. Pożywkę usuwa się z przetransfekowanych komórek poprzez aspirację, a następnie do odwróconej kolby (stroną z komórkami do góry) pipetuje się 1 mL roztworu trypsyny o temperaturze 37°C (Sigma). Następnie kolbę delikatnie odwraca się do pozycji pionowej, aby trypsyna spłynęła po komórkach, po czym ponownie ją odwraca się i usuwa trypsynę za pomocą aspiracji. Bezpośrednio na komórki dodaje się 250 μL ciepłej trypsyny, a kolbę inkubuje w temperaturze 37°C przez 3-5 minut, aż komórki się odłączą.
   4. W międzyczasie szkiełka podstawowe powleczone poli-_L-lizyną umieszcza się w 6-milimetrowych szalkach hodowlanych (od 3 do 8 szkiełek na szalkę) i do każdej szalki dodaje się 5 mL ciepłej pożywki hodowlanej.
   5. Trypsynizowane komórki resuspensuje się w 4 mL ciepłej pożywki hodowlanej, pipetując ciecz w górę i w dół około 6 razy, a następnie 250-500 μL resuspensji komórek pipetuje się do szalek hodowlanych zawierających szkiełka. Przed dodaniem komórek końcówką mikropipety dociska się szkiełka, aby upewnić się, że znajdują się one na dnie szalki.
   6. Następnie komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 3 h, aby umożliwić im przyleganie do szkiełek, a potem przenosi się je do temperatury 28°C. W tym momencie komórki są gotowe do rejestracji elektrofizjologicznej, którą najlepiej przeprowadzić na oddzielnie przylegających komórkach (rys. 3 przedstawia przetransfekowane komórki przed i po wysianiu na szkiełka). Zostawienie komórek w temperaturze 37°C na zbyt długi czas doprowadzi do ich podziału.
2. 1. Przygotowanie komórek wykazujących ekspresję kanałów/kompleksów kanałowych z dużymi domenami zewnątrzkomórkowymi przeprowadza się w ten sam sposób, co opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że szkiełka inkubuje się w temperaturze 28°C przez dodatkowe 2-4 dni przed przeprowadzeniem rejestracji elektrofizjologicznej. Pozwala to na ponowną akumulację kanałów/kompleksów kanałowych w błonie komórkowej po trypsynizacji.

4. Rejestracja elektrofizjologiczna rekombinowanych kanałów w komórkach HEK-293T

Dostępnych jest kilka kompleksowych źródeł opisujących ogólne koncepcje leżące u podstaw rejestracji elektrofizjologicznej (np. Ogden i Stanfield 1987; Molleman 2003).

4.1 Stanowisko do elektrofizjologii

Typowy zestaw do elektrofizjologii (Rycina 4) obejmuje wzmacniacz (np. wzmacniacz Axopatch 200B lub Multiclamp 700B; Axon Instruments, Union City, CA), komputer PC wyposażony w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A wraz z oprogramowaniem pClamp10.1 (Molecular Devices, Sunnyvale, California), zmotoryzowane, podwójne manipulatory do pipet (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), mikroskop epifluorescencyjny (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) oraz systemy perfuzyjne (Ryciny 4 i 5). Wibracje są ograniczane poprzez montaż sprzętu na stole wibroizolacyjnym z serii TMC 63-500 (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Pasożytniczy szum elektryczny jest ograniczany za pomocą klatki Faradaya typu II o wysokości 40", (TMC) otaczającej sprzęt elektryczny zamontowany na stole wibroizolacyjnym. Elektroniczne systemy sterowania (takie jak komputer i monitor, wzmacniacz, przetwornik analogowo-cyfrowy, zmotoryzowany manipulator oraz system sterowania perfuzją Valvelink) są zamontowane poza klatką Faradaya na wolnostojącym metalowym regale elektrycznym (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). Cały sprzęt elektryczny jest uziemiony do miedzianego rozdzielacza i podłączony do medycznego transformatora izolacyjnego (1800W, Tripp Lite UL60601-1), który zapewnia izolację linii, stałe uziemienie i tłumienie przepięć.

4.2 Przygotowanie pipet patch

Kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknem (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 15 cm; BF150-86-15; Sutter Instrument Company) są przecinane na pół i umieszczane w wyciągaczu do mikropipet Flaming/Brown Micropipette Puller model P-97 (Sutter Instrument Company). Program wyciągacza jest optymalizowany tak, aby powtarzalnie generować pipety o rezystancji od 2 do 5 MΩ między elektrodą a masą (po polerowaniu ogniowym; Rys. 6). Pipety są indywidualnie polerowane ogniowo w celu wygładzenia powierzchni końcówek, co umożliwia szczelne przyleganie do błon komórkowych (Micro Forge MF-830; Narishige, Japonia; Rysunek 6). Mikropipety są montowane na głowicy wzmacniacza za pomocą specjalistycznego uchwytu (1-HL-U; Molecular Devices, Sunnyvale Kalifornia).

4.3 Elektrody uziemiające

Rurki z borokrzemianowego szkła, których używa się do wyrobu pipet patch, służą również do wykonania elektrod odniesienia. Rurki o długości 15 cm są cięte na 3 części. Za pomocą 2 pęset o cienkich końcach rurki są podgrzewane w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło stanie się plastyczne i będzie można je zgiąć w kształt litery „L” lub „kija hokejowego” pod kątem 90o. Gdy rurki szklane są jeszcze gorące, jeden koniec jest bezzwłocznie zanurzany w gorącym roztworze 3M CsCl i 1,5% agarozy, który zostaje wciągnięty do rurki dzięki zjawisku kapilarnemu. Po całkowitym wypełnieniu elektrody odniesienia roztworem, jest ona umieszczana w zlewce z zimną wodą. Po wypełnieniu wszystkich elektrod odniesienia, każda z nich jest osobno wycierana chusteczkami Kimwipes w celu usunięcia nadmiaru agarozy z zewnątrz, a następnie zanurzana w roztworze 3M CsCl. Do rejestracji elektrofizjologicznej elektrody odniesienia są umieszczane w półogniwach uchwytu mikroelektrod (Holder 90 F Pellet 1.5mm; #MEH3RF15; World Precision Instruments Inc., Sarasota Florida) wypełnionych roztworem 3M CsCl. (Ilustrację elektrody uziemiającej w roztworze kąpielowym przedstawiono na Rysunku 7)

4.4 Roztwory do rejestracji elektrofizjologicznej

Różne typy napięciowo zależnych kanałów jonowych wymagają różnych roztworów pomiarowych, w zależności od przepuszczalności i selektywności jonowej. W przypadku napięciowo zależnych kanałów wapniowych komórki zazwyczaj kąpie się w roztworach zewnętrznych zawierających bar lub wapń w różnych stężeniach. Na przykład rejestrację elektrofizjologiczną bezkręgowca napięciowo zależnego kanału wapniowego Cav3 (LCav3) można przeprowadzić, stosując roztwór zewnętrzny zawierający 5mM CaCl₂, 166mM tetraetyloamoniu (TEA-Cl), 10mM HEPES z pH dostosowanym do 7.4 za pomocą TEA-OH. Pipety do techniki patch-clamp wypełnia się roztworem wewnętrznym zawierającym 125mM CsCl, 10mM EGTA, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 4mM MgATP, 0.3mM Tris-GTP i 10mM HEPES o pH 7.2 (Senatore and Spafford, 2010). Bezkręgowca napięciowo zależny kanał wapniowy typu L (LCav1) można rejestrować, stosując roztwór zewnętrzny z barem jako nośnikiem ładunku (15mM BaCl2, 1mM MgCl₂, 10mM HEPES, 40mM TEA-Cl, 72.5mM CsCl, 10mM glukozy, z pH dostosowanym do 7.2 za pomocą TEA-OH) oraz roztwór wewnętrzny zawierający 108mM metanosulfonianu cezu, 4mM MgCl₂, 9mM EGTA, 9mM HEPES, z pH dostosowanym do 7.2 za pomocą CsOH (Senatore et al., 2010).

4.5 Rejestracja metodą whole-cell

1. Kuwetkę z transfekowanymi komórkami (wyrażającymi heterologiczne kanały jonowe lub kompleksy kanałów jonowych) przenosi się do plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej ~3 mL zewnętrznego roztworu rejestracyjnego. Objętość roztworu rejestracyjnego musi być zmierzona dokładnie podczas przeprowadzania eksperymentów z lekami, w których znane ilości leku są dodawane do szalki za pomocą mikropipety. Rejestracje elektrofizjologiczne są zazwyczaj wykonywane w temperaturze pokojowej, choć badacz może chcieć zmienić tę temperaturę w zależności od eksperymentu.
2. Komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a pojedyncza, pozytywnie transfekowana, przylegająca zielona komórka zostaje wycentrowana w polu widzenia.
3. Pipetę patchową opuszcza się do roztworu kąpieli za pomocą mikromanipulatora, co zamyka obwód między elektrodą w pipecie a elektrodą odniesienia. W trybie bath program pClamp10.1 powoduje, że wzmacniacz generuje małe, powtarzające się skoki napięcia między pipetą a elektrodą odniesienia i wyświetla wynikający z tego prąd jako zapis w formie fali prostokątnej (Ryc. 8A). Ten zapis fali prostokątnej musi zostać wyzerowany za pomocą funkcji offsetu pipety we wzmacniaczu przed wykonaniem patchingu komórki. Oporność pipety jest mierzona przez program pClamp10.1 i powinna mieścić się w zakresie 2-5MΩ.
4. W trybie bath pipetę zbliża się do komórki, co objawia się jako szybkie fluktuacje w zapisie fali prostokątnej, a następnie stosuje się niewielkie podciśnienie w pipecie patchowej, aby utworzyć uszczelnienie gigaohmiczne (gigaohm seal) między pipetą a błoną (powoduje to całkowite spłaszczenie zapisu fali prostokątnej; Ryc. 8B).
5. Następnie program przełącza się w tryb patch, a pojemność pipety (widoczną jako małe skoki prądu na krawędziach wznoszącej i opadającej płaskiego zapisu prądu; Ryc. 8B) kompensuje się za pomocą funkcji kompensacji pojemności pipety we wzmacniaczu.
6. Stosuje się krótkie, ale silne podciśnienie, aby przerwać błonę w miejscu patchu i umożliwić elektrodzie dostęp do wnętrza komórki. Prawidłowe przerwanie błony sygnalizowane jest pojawieniem się dużych przejściowych prądów pojemnościowych, również na krawędziach wznoszącej i opadającej zapisu fali prądowej (Ryc. 8C). Po uzyskaniu dostępu program przełącza się w tryb cell, a kompensacja pojemności całej komórki jest regulowana we wzmacniaczu w celu usunięcia przejściowych prądów pojemnościowych. Przed rozpoczęciem rejestracji stosuje się kilkuminutową przerwę, aby umożliwić wyrównanie wewnątrzkomórkowego roztworu rejestracyjnego w komórce.
7. Polecenia napięciowe są generowane, a dane pozyskiwane za pomocą komputera wyposażonego w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A wraz z oprogramowaniem pClamp10.1. Dla każdego eksperymentu opracowywane są unikalne protokoły clampowania napięcia, które służą do rejestracji prądów kanałów jonowych z transfekowanych komórek. Ryc. 9 przedstawia prądy wapniowe zarejestrowane z komórki HEK-293T wyrażającej bezkręgowca bramkowany napięciowo kanał wapniowy LCav3. Komórkę utrzymywano przy napięciu -110mV, a w celu wywołania wewnątrzkomórkowych prądów wapniowych stosowano stopniowe depolarizacje w zakresie od -70mV do +20mV.
8. Zarejestrowane prądy są filtrowane przy 10 kHz za pomocą filtru dolnoprzepustowego Bessela i digitalizowane z częstotliwością próbkowania 2 kHz. Do analizy wykorzystuje się tylko rejestracje z minimalnym prądem upływu (<10%), a odejmowanie prądu upływu offline jest wykonywane przy użyciu oprogramowania Clampfit 10.1.

4.6 Badania farmakologiczne zarejestrowanych komórek

Leki można pipetować bezpośrednio do naczynia, w którym prowadzona jest rejestracja. Stężenie leków można obliczyć, znając objętość dodanego leku oraz objętość roztworu kąpielowego. Drogie leki lub leki dostępne w ograniczonej ilości można również podawać za pomocą mikroperfuzji z wielokanałowego polimidowego urządzenia perfuzyjnego z wymienną końcówką o średnicy 250 µm, wykorzystując ośmiokanałowy system mikroperfuzji ciśnieniowej Smartsquirt (AutoMate Scientific) lub system przepływu grawitacyjnego sterowany za pomocą zaworów teflonowych i kontrolerów zaworów Valvelink8 (AutoMate Scientific; konfiguracje systemu perfuzyjnego przedstawiono na Ryc. 5). Prędkość przepływu w systemach mikroperfuzji ustawia się na 0,1 mL na minutę w strumieniu wypływającym z urządzenia perfuzyjnego w odległości 400 µm od rejestrowanej komórki. Odległość końcówki urządzenia perfuzyjnego od końcówki elektrody rejestrującej powinna być stała dla każdego patcha; Ryc. 10 ilustruje sugerowaną odległość widoczną przy powiększeniu 40x. Odpowiednia prędkość przepływu zapewnia nasycającą perfuzję rejestrowanej komórki. Przed rozpoczęciem eksperymentu z lekiem przy użyciu mikroperfuzji komórki są równoważone poprzez ciągłą mikroperfuzję kontrolnego roztworu kąpielowego. Aby uniknąć minimalnych przerw w strumieniu podczas eksperymentu, stosuje się szybkie przełączanie między roztworem kąpielowym kontrolnym, lekiem a roztworem płuczącym. Do usuwania nadmiaru roztworów można użyć ssania zamontowanego na krawędzi naczynia rejestracyjnego, poprzez ręczne odsysanie strzykawką lub za pomocą urządzenia napędzanego pompą perystaltyczną (np. pompa perystaltyczna DC MINISTAR, World Precision Instruments). Należy zachować ostrożność, ponieważ ekstremalnie szybka perfuzja indukuje siły ścinające, które mogą zmienić prąd wapniowy (Peng et al. 2005), mogą wypłukać rejestrowaną komórkę oraz zbyt szybko opróżnić rezerwuar leku.

Bezpośrednie pipetowanie do naczynia vs. systemy perfuzyjne

	Pipetowanie bezpośrednie	System mikroperfuzji	Grawitacyjny system perfuzji
Wymagana objętość leku	Umiarkowana	Niska	Wysoka
Wymagane umiejętności techniczne	Niskie	Średnie	Średnie
Koszt sprzętu	Niski	Znaczny	Znaczny
Codzienny czas przygotowania i sprzątania	Brak	20+ minut	20+ minut
Kontaminacja sprzętu	Brak	Tak	Tak
Rozwiązywanie problemów	Łatwe	Złożone	Złożone
Gwarancja obecności leku w naczyniu	Tak	Nie	Nie
Ryzyko utraty komórek przy dodawaniu leku	Tak	Tak	Tak
Znaczna redukcja stężenia leku poprzez przemywanie	Trudna	Prosta	Prosta
Łatwość wykonania krzywej zależności dawka-odpowiedź dla wielu dawek	Nieoptymalna	Prosta	Prosta
Powtarzalność wyników	Dopuszczalna – zależna od miejsca pipetowania	Dobra	Dobra

Dyskusja

Możliwość rejestracji prądów z całej komórki (whole-cell) przy użyciu opisanych protokołów i roztworów wskazuje na pomyślną transfekcję oraz obecność znaczących ilości pożądanych napięciowo zależnych kanałów jonowych lub kompleksów kanałów jonowych w błonie komórkowej. W przypadku, gdy komórki są pozytywnie przetransfekowane (tj. wykazują zieloną fluorescencję), ale nie rejestruje się w nich prądów, może być wymagany dodatkowy czas inkubacji w 28°C, aby białko kanału zostało prawidłowo zapakowane i wbudowane w błonę komó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
plazmid pIRES2-EGFP	Clontech Laboratories	6029-1
Okrągłe szkiełka nakrywki	Fisher Scientific	12-545-80	Kółka nr 1 – grubość 0,13 do 0,17 mm, rozmiar: 12 mm
Wzmacniacz	Axon Instruments	Axopatch 200B lub Multiclamp 700B
System akwizycji danych	Axon Instruments	Digidata 1440A
Oprogramowanie do elektrofizjologii	Axon Instruments	pClamp10.1
Manipulatory pipet	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 40 CFL
Przedwzmacniacz (Headstage)	Axon Instruments	CV-7B
Uchwyt elektrody przedwzmacniacza	Axon Instruments	1-HL-U
Uchwyt mikro–elektrody dla elektrody uziemiającej	World Precision Instruments, Inc.	MEH3RF 15
Kapilary do elektrofizjologii	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	Szkło borokrzemianowe z włóknem, średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica zewnętrzna 0,86 mm, długość 15 cm
Wytciągacz mikropipet Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Wypalacz końcówek mikropipet	Narishige International	Micro Forge MF-830
Mikrosystem perfuzji leków	AutoMate Scientific, Inc.	SmartSquirt8 Valvelink8.2
System perfuzji leków	AutoMate Scientific, Inc.	Valvelink8.2 z zaworami teflonowymi