Zoptymalizowana strategia transfekcji do ekspresji i elektrofizjologicznego zapisu rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w komórkach HEK-293T

Podsumowanie

Niezawodna metoda wysoce efektywnej ekspresji in vitro i późniejszej elektrofizjologicznej rejestracji rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w hodowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293T).

Streszczenie

Ekspresja in vitro i elektrofizjologiczny zapis rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w hodowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293T) jest wszechobecną strategią badawczą. Ogniwa HEK-293T muszą być powlekane na szklanych szkiełkach nakrywkowych o wystarczająco małej gęstości, aby nie stykały się ze sobą, aby umożliwić zapis elektrofizjologiczny bez zakłócających efektów spowodowanych kontaktem z sąsiednimi komórkami. Transfekowane kanały muszą również wyrażać się z wysoką wydajnością na błonie plazmatycznej w celu rejestrowania wykrywalnych prądów powyżej poziomów szumów za pomocą zacisków krosowych całej komórki. Heterologiczne kanały jonowe często wymagają długich okresów inkubacji w temperaturze 28°C po transfekcji w celu uzyskania odpowiedniej ekspresji błony, ale w tej temperaturze występują coraz większe straty adhezji komórka-szkiełko nakrywkowe i stabilność błony. Aby obejść ten problem, opracowaliśmy zoptymalizowaną strategię transfekcji i płytki komórek HEK-293T. Metoda ta wymaga, aby komórki były transfekowane przy stosunkowo dużej konfluencji i inkubowane w temperaturze 28°C przez różne okresy inkubacji po transfekcji, aby umożliwić odpowiednią ekspresję białka kanału jonowego. Transfekowane komórki są następnie powlekane na szklanych szkiełkach nakrywkowych i inkubowane w temperaturze 37°C przez kilka godzin, co pozwala na sztywne przymocowanie komórek do szkiełek nakrywkowych i ponowną stabilizację membrany. Komórki mogą być rejestrowane wkrótce po posiewie lub mogą być przenoszone do temperatury 28°C w celu dalszej inkubacji. Odkryliśmy, że początkowa inkubacja w temperaturze 28°C, po transfekcji, ale przed posiewem, jest kluczowa dla efektywnej ekspresji heterologicznych kanałów jonowych, które normalnie nie wyrażają się dobrze na błonie plazmatycznej. Dodatnio transfekowane, hodowane komórki są identyfikowane przez koekspresję eGFP lub eGFP wyrażaną z wektora bicystronicznego (np. pIRES2-EGFP) zawierającego rekombinowany kanał jonowy cDNA tuż przed wewnętrznym miejscem wejścia rybosomu i sekwencję kodującą eGFP. Nagrywanie z użyciem clampów krosowych całych ogniw wymaga specjalistycznego sprzętu, a także wykonania polerowanych elektrod rejestrujących i elektrod uziemiających w kształcie litery L ze szkła borokrzemianowego. Dostarczanie leków w celu zbadania farmakologii kanałów jonowych można osiągnąć poprzez bezpośrednie mikropipetowanie leków do naczynia rejestrującego lub za pomocą systemów mikroperfuzji lub przepływu grawitacyjnego, które wytwarzają nieprzerwane strumienie roztworu leku nad zarejestrowanymi komórkami.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

1. Ludzkie embrionalne komórki 293T nerki (HEK-293T, Invitrogen) są hodowane w przylegających monowarstwach w wentylowanych kolbach o średnicy 25 cm² (hodowla tkankowa poddana obróbce; Gwiazda komórki; greiner bio-one) zawierający 6 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; Sigma Aldrich) uzupełniony 10% v/v płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sigma Aldrich), 1% pirogronianu sodu i 250 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37°C z 5% CO₂ ).
   
   Komórki inkubuje się w inkubatorach CO₂ (5% CO₂) ustawionych na 37°C lub 28°C. Wszystkie prace z ogniwami odbywają się w okapie z przepływem laminarnym.
   
   
2. Komórki są zwykle dzielone co dwa tygodnie, od ~90% zbiegu, w rozcieńczeniu 1:8 w poniedziałki i 1:12 w czwartki. (Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z obrazami komórek HEK-293T posianych w różnych gęstościach)
3. W celu rozszczepienia pożywkę usuwa się z kolb komórek przez aspirację, a komórki odłącza się, nakładając 1 ml roztworu trypsyny (Sigma Aldrich) podgrzanego do 37°C do odwróconej kolby. Kolba jest następnie odwracana i delikatnie kołysana ręcznie, tak aby roztwór trypsyny kilkakrotnie przesuwał się po przyczepionych komórkach. Trypsyna jest następnie szybko usuwana przez aspirację, a 250 μl trypsyny jest mikropipetowane do kolby, która jest ponownie kołysana, aby przesunąć roztwór trypsyny po komórkach.
4. Kolby są następnie inkubowane w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 ° C przez 3-5 minut, a pipeta jest używana do zawieszenia komórek w 4 ml ciepłego suplementu DMEM. Niepełna trypsyna i zawiesina spowoduje skupiska komórek i może spowodować, że komórki będą rosły w górę, a nie w zamierzonej monowarstwie. Nadmierna trypsyna może uszkodzić komórki.
5. W przypadku podziału 1:8 dodaje się 500 μl zawieszonych komórek do nowej kolby zawierającej 5,5 ml DMEM; w przypadku podziału 1:12 (patrz rysunek 1), 333 μl komórek dodaje się do nowej kolby zawierającej 5,7 ml DMEM. Kolby delikatnie miesza się, a następnie przenosi do inkubatora o temperaturze 37°C. Podczas 3-4 godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C po rozszczepieniu komórki osadzają się i przylegają do kolby. Komórki początkowo wyglądają na okrągłe, ale spłaszczają się i mają przedłużenia (pseudopodia) z mocniejszym przyczepem (ryc. 1).
   
   Komórki powinny rosnąć w przylegającej monowarstwie w przewidywalny sposób. Jeśli wzrost i wygląd komórek są nietypowe lub niespójne, należy wziąć pod uwagę złą technikę lub zanieczyszczenie (bakterie/mykoplazma). Kluczem do udanej hodowli tkankowej jest spójność.
   
   

2. Transfekcja HEK-293T za pomocą rekombinowanych kanałów jonowych cDNA

1. W tym przypadku cDNA z różnych kanałów jonowych są klonowane do plazmidu pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech), który pozwala na identyfikację dodatnio transfekowanych komórek poprzez wzmocnioną fluorescencję białka zielonej fluorescencji (eGFP). eGFP jest wytwarzany w transfekowanych komórkach z tego samego transkryptu, co sklonowany cDNA z wstawką, poprzez translację zainicjowaną w wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu tuż za wstawką cDNA i przed sekwencją kodującą eGFP (Figura 2). Na rysunku 3 przedstawiono obrazy fluorescencyjnego HEK-293T, dodatnio transfekowanego podjednostkami kanału wapniowego w konstruktach pIRES2-EGFP.
2. Przed transfekcją w pełni zlewającą się kolbę dzieli się w stosunku 1:4 do nowej kolby, a komórki pozostawia się do przyłączenia w temperaturze 37°C w inkubatorze CO₂ przez 3-4 godziny (patrz rysunek 1).
3. Po przyłączeniu komórek stosuje się standardową strategię transfekcji fosforanu wapnia (protokoły Cold Spring Harbor) w celu wprowadzenia do komórek HEK konstruktów zawierających kanały jonowe i dodatkowe podjednostki cDNA. Zazwyczaj stosuje się łącznie 12 μg DNA w 600 μl roztworu do transfekcji na kolbę/transfekcję.
4. Po pipetowaniu roztworu do transfekcji na komórki kroplami, kolbę umieszcza się na noc w inkubatorze o temperaturze 37°C.
5. Po transfekcji komórki są ostrożnie przemywane trzykrotnie ciepłym podłożem lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (4-5 ml), pipetując roztwór płuczący do odwróconej kolby, a następnie powoli obracając kolbę do góry i kołysząc kolbą tak, aby roztwór płuczący przesuwał się po komórkach. Jeśli nie zostanie to zrobione ostrożnie, komórki mogą się odczepić i niewiele pozostanie po trzech etapach mycia. Mycie powtarza się jeszcze dwa razy, następnie do kolby dodaje się 6 ml pożywki i inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny, a następnie przenosi do inkubatora o temperaturze 28°C.
6. Pomyślną transfekcję konstruktów pIRES2-EGFP można potwierdzić od 1 do 3 dni po transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Komórki, które fluoryzują na zielono pod wpływem światła UV, są dodatnio transfekowane i powinny wyrażać heterologiczny kanał jonowy i białka eGFP.

3. Posiewanie transfekowanych komórek HEK293T w ramach przygotowań do zapisu elektrofizjologicznego

Różne kanały jonowe wyrażają się z różną wydajnością na błonie komórkowej komórek HEK, i jako takie, pozostała część tego protokołu wymaga pewnej optymalizacji, aby zmaksymalizować ekspresję powierzchni kanału, co pozwala na udany zapis elektrofizjologiczny. Ekspresja heterologicznych kanałów jonowych w komórkach HEK, szczególnie tych pochodzących ze źródeł innych niż ssaki, może stanowić pewne wyzwania, w tym (1) duże rozmiary białek wymagające długiego czasu na translację i lokalizację w błonie plazmatycznej, (2) brak lub różnice w motywach fałdowania i kierowania na białku kanałowym niezbędnym w linii komórkowej ssaków, (3) różnice w częstości użycia kodonów w zależności od gatunku. Wszystkie te czynniki w połączeniu mogą skutkować koniecznością długiego czasu inkubacji w temperaturze 28°C, co zapewnia efektywną ekspresję białek i lokalizację powierzchniową bez podziału komórki (co rozcieńczyłoby heterologiczne cDNA i białka). Niestety, inkubacja przez dłuższy czas w temperaturze 28°C prowadzi do oderwania komórek i słabej stabilności błony, co utrudnia zapis elektrofizjologiczny. Zdecydowaliśmy się zmodyfikować konwencjonalne strategie transfekcji (omówione w Thomas i Smart 2005) w celu zminimalizowania inkubacji w temperaturze 28°C przed nagrywaniem i maksymalizacji ekspresji powierzchniowej. Nasza metoda wymaga, aby komórki były transfekowane, inkubowane przez okres 3-7 dni w temperaturze 28°C, następnie komórki są odłączane przez trypsynizację i ponownie powlekane na szkiełkach nakrywkowych i inkubowane w temperaturze 37°C, co restabilizuje błony i pozwala na silne przyleganie komórek do szkiełek nakrywkowych. Komórki mogą być wtedy rejestrowane od razu lub mogą być inkubowane przez dodatkowe okresy czasu w temperaturze 28°C. Uważamy, że ponowne powlekanie komórek na szkiełkach nakrywkowych na tym późniejszym etapie naszej metody jest absolutnie niezbędne do wytworzenia szkiełek nakrywkowych z dużą liczbą oddzielnych komórek przyłączonych do kanałów.

Prezentujemy dwie alternatywne strategie, jedną, którą preferujemy stosować dla kanałów jonowych i kompleksów kanałów jonowych, które nie zawierają dużych domen zewnątrzkomórkowych, które mogą być podatne na trawienie trypsyny (np. kanały wapniowe bramkowane napięciem Cav3; Senatore i Spafford 2010) i taki, którego używamy dla kanałów jonowych, które zawierają duże domeny zewnątrzkomórkowe (np. kanały wapniowe bramkowane napięciem typu L i ich podjednostki dodatkowe; Senatore i in. 2010).

1. 1. Komórki inkubuje się w temperaturze 28°C przez 2-6 dni, aby zapobiec podziałowi komórek i umożliwić akumulację translowanego białka. Ten czas inkubacji musi być określony empirycznie dla każdego kanału jonowego, ponieważ ekspresja powierzchniowa zależy od wewnętrznych czynników, które dyktują, w jaki sposób powstające sekwencje mRNA i polipeptydowe kanałów oddziałują odpowiednio z maszynerią translacyjną i szlakiem wydzielniczym.
   2. Przed poszyciem okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (koła nr 1 - grubość od 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) są pokryte poli-L-lizyną (Sigma) zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Pożywkę usuwa się przez aspirację z transfekowanych komórek, a 1 ml roztworu trypsyny (Sigma) o temperaturze 37°C umieszcza się w mikropipetowaniu do odwróconej kolby (komórką do góry). Kolba jest następnie delikatnie odwracana do pozycji pionowej, aby trypsyna mogła przepływać przez komórki, a kolba jest następnie ponownie odwracana, a trypsyna usuwana przez aspirację. Następnie dodaje się 250 μl ciepłej trypsyny bezpośrednio na komórki, a kolbę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 3-5 minut, aż komórki się odczepią.
   4. W międzyczasie szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną umieszcza się w naczyniach hodowlanych o średnicy 6 mm (3-8 na naczynie) i do każdej pożywki dodaje się 5 ml ciepłej pożywki hodowlanej.
   5. Trypsynizowane komórki są ponownie zawieszane w 4 ml ciepłej pożywki hodowlanej, pipetując w górę iw dół ~ 6 razy, a następnie 250-500 μl ponownie zawieszonych komórek jest mikropipetowane do szalek hodowlanych zawierających szkiełka nakrywkowe. Przed dodaniem komórek końcówka mikropipety jest używana do dociśnięcia szkiełek nakrywkowych, aby upewnić się, że znajdują się one na dnie naczynia.
   6. Komórki są następnie inkubowane w temperaturze 37°C przez 3 godziny, aby mogły przylgnąć do szkiełek nakrywkowych, a następnie przenosi się je do temperatury 28°C. W tym momencie ogniwa są gotowe do zapisu elektrofizjologicznego, który najlepiej jest wykonać za pomocą oddzielnych ogniw (rys. 3 ilustruje transfekowane komórki przed i po posiewie na szkiełkach nakrywkowych). Pozostawienie komórek na zbyt długo w temperaturze 37°C spowoduje podział komórek.
2. 1. Przygotowanie komórek wykazujących ekspresję kanałów/kompleksów kanałów z dużymi domenami zewnątrzkomórkowymi odbywa się w taki sam sposób, jak wskazano powyżej, z wyjątkiem tego, że szkiełka nakrywkowe inkubuje się w temperaturze 28°C przez dodatkowe 2-4 dni przed przeprowadzeniem zapisu elektrofizjologicznego. Pozwala to na ponowną akumulację kanałów/kompleksów kanałów na błonie komórkowej po trypsynizacji.

4. Elektrofizjologiczny zapis kanałów rekombinowanych w komórkach HEK-293T

Dostępnych jest kilka obszernych zasobów, które opisują ogólne koncepcje leżące u podstaw zapisu elektrofizjologicznego (np. Ogden i Stanfield 1987; Molleman 2003).

4.1 Stanowisko do elektrofizjologii

Typowy zestaw do elektrofizjologii (Rysunek 4) zawiera wzmacniacz (np. wzmacniacz Axopatch 200B lub Multiclamp 700B; Axon Instruments, Union City, Kalifornia), komputer PC wyposażony w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A w połączeniu z oprogramowaniem pClamp10.1 (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia), zmotoryzowanymi manipulatorami z podwójnymi pipetami (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), mikroskopem epifluorescencyjnym (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) i systemami perfuzyjnymi (rysunki 4 i 5). Drgania są ograniczone poprzez zamontowanie urządzenia na stole wibroizolacyjnym serii TMC 63-500 (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Rozproszony szum elektryczny jest ograniczony za pomocą 40-calowej klatki Faradaya typu II (TMC) otaczającej sprzęt elektryczny zamontowany na stole wibroizolacyjnym. Elektroniczne systemy sterowania (takie jak komputer i monitor, wzmacniacz, przetwornik analogowo-cyfrowy, zmotoryzowany manipulator i system kontroli perfuzji Valvelink) są zamontowane na zewnątrz klatki Faradaya na wolnostojącej metalowej szafie elektrycznej (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). Wszystkie urządzenia elektryczne są uziemione do miedzianego dystrybutora i podłączone do transformatora izolacyjnego klasy medycznej (1800 W, Tripp Lite UL60601-1), który zapewnia izolację linii, spójne uziemienie i tłumienie przepięć.

4.2 Pipety z łatką

Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (średnica zewnętrzna 1,5mm, średnica zewnętrzna 0,86mm, długość 15cm; Zobacz materiał BF150-86-15; Sutter Instrument Company) są przecinane na pół i wkładane do flamingowo-brązowego ściągacza do mikropipet model P-97 (Sutter Instrument Company). Program ściągacza do pipet jest zoptymalizowany pod kątem spójnego generowania pipet o rezystancji od 2 do 5 MΩ od elektrody do masy (po polerowaniu ogniowym; Rys.6) Pipety są indywidualnie polerowane ogniowo w celu wygładzenia powierzchni końcówek pipet, co pozwala na szczelne uszczelnienie błon komórkowych (Micro Forge MF-830; Narishige, Japonia; Rysunek 6). Mikropipety montowane są na głowicy za pomocą specjalistycznego uchwytu (1-HL-U; Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia).

4.3 Elektrody uziemiające

Rurki ze szkła borokrzemianowego używane do produkcji pipet łatek są również używane do produkcji elektrod referencyjnych. Rurki o długości 15 cm są cięte na 3 części. Za pomocą 2 kleszczyków z cienką końcówką rurki są utrzymywane w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło stanie się plastyczne, a rurkę można wygiąć do kształtu "L" lub "kija hokejowego" pod kątem 90o. Podczas gdy szklane rurki są nadal gorące, jeden koniec jest natychmiast zanurzany w gorącym 3M CsCl i 1,5% roztworze agarozy, który jest wciągany do probówki przez działanie kapilarne. Gdy elektroda referencyjna zostanie całkowicie wypełniona roztworem, umieszcza się ją w zlewce z zimną wodą. Po napełnieniu wszystkich elektrod referencyjnych są one indywidualnie przecierane chusteczkami Kimwipes w celu usunięcia dodatkowej agarozy z zewnątrz i zanurzane w roztworze 3M CsCl. W celu zapisu elektrofizjologicznego elektrody referencyjne są utrzymywane w półogniwach z uchwytem mikroelektrod (Holder 90 F Pellet 1,5 mm; #MEH3RF15; World Precision Instruments Inc., Sarasota na Florydzie) wypełnione roztworem 3M CsCl. (Patrz rysunek 7 w celu zilustrowania elektrody uziemiającej w roztworze do kąpieli)

4.4 Rozwiązania do rejestracji elektrofizjologii

Różne typy kanałów jonowych bramkowanych napięciem wymagają różnych rozwiązań rejestrujących w zależności od przepuszczalności/selektywności jonów. W przypadku kanałów wapniowych bramkowanych napięciem komórki są zwykle kąpane w zewnętrznych roztworach zawierających bar lub wapń w różnych stężeniach. Na przykład elektrofizjologiczny zapis kanału wapniowego bramkowanego napięciem Cav3 (LCav3) bezkręgowców można przeprowadzić przy użyciu zewnętrznego roztworu zawierającego 5mM CaCl₂, 166mM tetraetyloamonu (TEA-Cl), 10mM HEPES o pH dostosowanym do 7,4 za pomocą TEA-OH. Pipety krosowe są wypełnione wewnętrznym roztworem 125mM CsCl, 10mM EGTA, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 4mM MgATP, 0,3mM Tris-GTP i 10mM HEPES o pH 7,2 (Senatore i Spafford, 2010). Kanał wapniowy bramkowany napięciem typu L bezkręgowców (LCav1) można rejestrować przy użyciu zewnętrznego roztworu zawierającego bar jako nośnik ładunku (15mM BaCl2, 1mM MgCl₂, 10mM HEPES, 40mM TEA-Cl, 72,5mM CsCl, 10mM glukozy, przy pH dostosowanym do 7,2 za pomocą TEA-OH) i roztworze wewnętrznym zawierającym 108mM Cs-metanosulfonian, 4mM MgCl₂, 9mM EGTA, 9mM HEPES, pH dostosowane do 7,2 za pomocą CsOH (Senatore i wsp., 2010).

4.5 Nagrywanie całej komórki

1. Szkiełko nakrywkowe zawierające transfekowane komórki (wyrażające heterologiczne kanały jonowe lub kompleksy kanałów jonowych) przenosi się na 35-milimetrową plastikową szalkę Petriego zawierającą ~ 3 ml zewnętrznego roztworu rejestrującego. Objętość roztworu rejestrującego musi być dokładnie zmierzona podczas przeprowadzania eksperymentów z narkotykami, w których znane ilości leku mają być dodane do naczynia za pomocą mikropipety. Zapisy elektrofizjologiczne są zwykle wykonywane w temperaturze pokojowej, chociaż badacz może chcieć zmienić tę temperaturę w zależności od eksperymentu.
2. Komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a izolowana, dodatnio transfekowana, przylegająca zielona komórka jest wyśrodkowana w środku pola widzenia.
3. Pipeta z plastrem jest opuszczana do roztworu kąpieli za pomocą mikromanipulatora, który zamyka obwód między elektrodą w pipecie z plastrem a elektrodą referencyjną. W trybie kąpielowym oprogramowanie pClamp10.1 powoduje, że wzmacniacz generuje niewielkie, powtarzające się kroki napięcia między pipetą a elektrodą odniesienia i wyświetla wynikowy prąd jako ścieżkę fali prostokątnej (ilustracja 8A). Ta ścieżka fali prostokątnej musi zostać wyzerowana za pomocą przesunięcia pipety na wzmacniaczu przed załataniem komórki. Rezystancja pipety jest mierzona za pomocą oprogramowania pClamp10.1 i powinna mieścić się w zakresie 2-5 MΩ.
4. W trybie kąpieli pipeta jest zbliżana do ogniwa, co można zobrazować jako gwałtowne wahania śladu fali prostokątnej, a następnie niewielka ilość ssania jest nakładana na pipetę z plastrem, aby utworzyć gigaomowe uszczelnienie między pipetą a membraną (powoduje całkowitą płaską linię śladu fali prostokątnej; Rysunek 8B).
5. Program jest następnie przełączany w tryb krosowy i pojemność pipety (widoczne jako małe impulsy prądu na krawędzi natarcia i spływu płaskiej ścieżki prądu; Rysunek 8B) jest kompensowany za pomocą kompensacji pojemności pipety na wzmacniaczu.
6. Niewielka, ale ostra ilość ssania jest stosowana w celu pęknięcia membrany w plastrze i umożliwienia dostępu elektrody do wnętrza ogniwa. Na udane pęknięcie membrany wskazuje pojawienie się dużych pojemnościowych stanów przejściowych również na krawędziach natarcia i spływu śladu fali prądowej (rysunek 8C). Po osiągnięciu przebicia program jest przełączany w tryb ogniwa, a kompensacja pojemności całego ogniwa jest regulowana na wzmacniaczu w celu usunięcia pojemnościowych stanów nieustalonych. Występuje kilkuminutowe opóźnienie, aby umożliwić zrównoważenie wewnątrzkomórkowego roztworu rejestrującego do komórki przed rejestracją.
7. Polecenia napięciowe są generowane, a dane są pozyskiwane za pomocą komputera wyposażonego w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A w połączeniu z oprogramowaniem pClamp10.1. Dla każdego eksperymentu pisane są unikalne protokoły cęgów napięciowych, które służą do rejestrowania prądów kanałów jonowych z transfekowanych komórek. Rysunek 9 ilustruje prądy wapniowe zarejestrowane z komórki HEK-293T wyrażającej kanał wapniowy bramkowany napięciem LCav3 bezkręgowców. Ogniwo utrzymywano pod napięciem -110 mV, a stopniowe depolaryzacje w zakresie od -70 mV do +20 mV były pobierane w celu wywołania wewnętrznych prądów wapniowych.
8. Zarejestrowane prądy są filtrowane z częstotliwością 10 kHz za pomocą dolnoprzepustowego filtra Bessela i digitalizowane z częstotliwością próbkowania 2 kHz. Do analizy wykorzystywane są tylko nagrania z minimalnym wyciekiem (<10%), a odejmowanie przecieków offline odbywa się za pomocą oprogramowania Clampfit 10.1.

4.6 Badania nad zarejestrowanymi komórkami

Narkotyki mogą być bezpośrednio pipetowane do nagrywanego naczynia. Stężenie leków można obliczyć, jeśli znana jest objętość dodanego leku i objętość roztworu do kąpieli. Drogie lub ograniczone ilości leku mogą być również dodawane przez mikroperfuzję z wielolufowego kolektora poliimidowego z wyjmowaną końcówką o średnicy 250 mikronów, przy użyciu ośmiokanałowego ciśnieniowego systemu mikroperfuzji Smartsquirt (AutoMate Scientific) lub systemu przepływu grawitacyjnego obsługiwanego przez zawory teflonowe i sterowniki zaworów Valvelink8 (AutoMate Scientific; patrz rysunek 5 dla konfiguracji systemu perfuzyjnego). Natężenia przepływu z systemów mikroperfuzyjnych są ustawione na 0,1 ml na minutę w strumieniu wychodzącym z ołówka perfuzyjnego 400 mikronów od zarejestrowanej komórki. Odległość końcówki ołówka perfuzyjnego od końcówki elektrody rejestrującej powinna być stała od łaty do łatki; Rysunek 10 ilustruje sugerowaną odległość widoczną przy 40-krotnym powiększeniu. Odpowiednie natężenia przepływu zapewniają nasycającą perfuzję zarejestrowanej komórki. Zanim eksperyment z lekiem zostanie przeprowadzony przy użyciu mikroperfuzji, komórki są równoważone z mikroperfuzją roztworu kąpieli kontrolnej w ciągłym strumieniu. Unika się minimalnych przerw w strumieniu podczas eksperymentu poprzez szybkie przełączanie z kąpieli kontrolnej, leku lub roztworu do mycia. Ssanie zamontowane na krawędzi czaszy rejestrującej może być wykorzystane do usunięcia nadmiaru roztworów, poprzez ręczne odsysanie za pomocą strzykawki lub za pomocą urządzenia napędzanego pompą perystaltyczną (np. MINISTAR Miniature DC Peristaltic Pump, World Precision Instruments). Należy zachować ostrożność, ponieważ niezwykle szybka perfuzja indukuje siły ścinające, które mogą zmienić prąd wapnia (Peng i in. 2005), mogą zmyć rejestrowaną komórkę i zbyt szybko wyczerpują rezerwuar leku.

Bezpośrednie pipetowanie do naczyń vs. systemy perfuzyjne

  Pipetowanie bezpośrednie System mikroperfuzji System perfuzji grawitacyjnej Potrzebna objętość leku umiarkowany niski wysoki Umiejętności techniczne niski Średni Średni Koszt sprzętu niski znaczący znaczący Codzienny czas na konfigurację i sprzątanie żaden 20+ minut 20+ minut Zanieczyszczenie sprzętu żaden tak tak Rozwiązywanie problemów łatwy kompleks kompleks Gwarantowany lek w naczyniu tak Nie Nie Utrata komórek z dodatkiem leku tak tak tak Znacznie zmniejszyć stężenie leku poprzez mycie trudny Proste Proste Łatwość wykonania krzywej odpowiedzi na wielokrotną dawkę Mniej niż optymalnie Proste Proste Powtarzalność wyników OK - w zależności od lokalizacji pippetingu dobry dobry

Dyskusja

Możliwość rejestrowania prądów całokomórkowych przy użyciu opisanych protokołów i rozwiązań wskazuje, że transfekcja zakończyła się sukcesem i że pożądane kanały jonowe bramkowane napięciem lub kompleksy kanałów jonowych są obecne w znacznych ilościach na błonie komórkowej. Jeśli komórki są transfekowane dodatnio (tj. fluorescencyjnie zielone), ale nie mają rejestrowanych prądów, może być wymagany dodatkowy czas w temperaturze 28°C, aby umożliwić prawidłowe upakowanie białka kanałowego i wprowadzenie go do błony komórko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pIRES2-EGFP plazmid	Clontech Laboratories	6029-1
Szkiełka nakrywkowe okrągłe	Fisher Scientific	12-545-80	Koła nr 1 - grubość od 0,13 do 0,17 mm, Rozmiar: 12 mm
Wzmacniacz	Axon Instruments	Axopatch 200B lub Multiclamp 700B
System akwizycji danych	Axon Instruments	Digidata 1440A
Elektrofizjologia Oprogramowanie	Axon Instruments	pClamp10.1
Manipulatory do pipet	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
Mikroskop odwrócony epifluorescencji	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 40 CFL
Headstage	Axon Instruments	CV-7B
Uchwyt elektrody headstage	Axon Instruments	1-HL-U
Micr– uchwyt na elektrodę uziemiającą	World Precision Instruments, Inc.	MEH3RF 15
Rurki kapilarne do elektrofizjologii	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	Szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,5 mm, OD 0,86 mm, 15 cm długości
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97
Polerka ogniowa do mikropipet	Narishige International	Micro Forge MF-830
System perfuzji mikroleków	AutoMate Scientific, Inc.	SmartSquirt8 Valvelink8.2
System perfuzji leków	AutoMate Scientific, Inc.	Valvelink8.2 z zaworami