Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Streszczenie

Receptory sprzężone z białkami G (GPCR) należą do rodziny białek siedmiokrotnie przebiegających przez błonę i pośredniczą w transdukcji sygnałów pozakomórkowych w odpowiedzi wewnątrzkomórkowe. GPCR kontrolują różnorodne funkcje biologiczne, takie jak chemotaksja, wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia oraz regulacja genów w sposób zależny od liganda za pośrednictwem heterotrymerycznych białek G^1-2. Wiązanie liganda indukuje serię zmian konformacyjnych prowadzących do aktywacji heterotrymerycznych białek G, które modulują poziomy drugich przekaźników, takich jak cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP), inozytolotrifosforan (IP3) i diacyloglicerol (DG). Równolegle z aktywacją receptora, wiązanie liganda inicjuje również szereg zdarzeń mających na celu osłabienie sygnalizacji receptorowej poprzez desensytyzację, sekwestrację i/lub internalizację. Proces desensytyzacji GPCR zachodzi poprzez fosforylację receptora przez kinazy receptorów sprzężonych z białkami G (GRK) i następujące po tym wiązanie β-arrestyn³. β-arrestyny są białkami cytozolowymi, które po aktywacji GPCR translokują się do błony, wiążąc się z fosforylowanymi receptorami (w większości przypadków), co ułatwia internalizację receptora ^4-6.

Leukotrien B₄ (LTB₄) jest prozapalną cząsteczką lipidową pochodzącą ze szlaku kwasu arachidonowego, która przekazuje swoje działanie poprzez receptory GPCR: receptor LTB₄ 1 (BLT1; receptor o wysokim powinowactwie) oraz receptor LTB₄ 2 (BLT2; receptor o niskim powinowactwie)^7-9. Wykazano, że szlak LTB₄-BLT1 odgrywa kluczową rolę w kilku chorobach zapalnych, w tym w astmie, zapaleniu stawów i miażdżycy^10-17. Niniejsza praca opisuje metodologie opracowane w celu monitorowania indukowanej przez LTB₄ migracji leukocytów oraz oddziaływań BLT1 z β-arestyną i translokacji receptorów w żywych komórkach przy użyciu technik obrazowania mikroskopowego^18-19.

Komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego myszy C57BL/6 zostały wyizolowane i hodowane zgodnie z wcześniej opisaną procedurą ^20-21. Komórki te poddano badaniom z wykorzystaniem metod obrazowania żywych komórek, aby zademonstrować migrację komórek indukowaną przez LTB₄. Ludzki receptor BLT1 został oznakowany czerwoną białkiem fluorescencyjnym (BLT1-RFP) na C-końcu, a β-arrestyna1 zielonym białkiem fluorescencyjnym (β-arr-GFP>; oba plazmidy transfekowano do linii komórkowej białaczkowej bazofilowej szczura (RBL-2H3)^18-19. Kinetykę oddziaływań między tymi białkami oraz ich lokalizację monitorowano za pomocą wideo mikroskopii żywych komórek. Metodologie opisane w niniejszej pracy przedstawiają wykorzystanie technik mikroskopowych do badania odpowiedzi funkcjonalnych receptorów sprzężonych z białkiem G w żywych komórkach. Praca ta opisuje również zastosowanie oprogramowania Metamorph do kwantyfikacji intensywności fluorescencji w celu określenia kinetyki oddziaływań między receptorem a białkami cytozolowymi.

Protokół

Metodyka

Opis mikroskopu

Eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek przeprowadzono przy użyciu systemu epi-fluorescencyjnego TE-FM przymocowanego do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE30. Mikroskop jest wyposażony w podgrzewany stolik. Do mikroskopu dołączono czarno-białą cyfrową kamerę CCD CoolSnap HQ (Roper Scientific) oraz optyczny zmieniacz filtrów LAMDA 10-2 (Sutter Instrument Company). Długości fal wzbudzenia i emisji są regulowane za pomocą kół filtracyjnych i sterowane kontrolerem kół filtracyjnych Lamba 10-2 (Sutter Instruments Co). Czas ekspozycji 50 ms powinien być wystarczający do obserwacji RFP lub ....

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem do demonstrowania funkcji i oddziaływań konkretnych białek w czasie rzeczywistym. Metody opisane w niniejszym opracowaniu wyraźnie pokazują, że LTB₄ może indukować szybką migrację komórek dendrytycznych. Metody te nie tylko rozszerzają wiedzę na temat funkcji LTB₄ w odniesieniu do różnych typów komórek, ale pozwalają również na zastosowanie podobnych procedur do wielu innych chemokin i badanie ich skuteczności jako czynników chemotaktycznych w różn.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa białaczkowa bazofilowa szczura (RBL-2H3) lub komórki HEK293.	ATCC	CRL-2256
Delbecco’zmodyfikowane podłoże Eagle’pożywka DMEM	Invitrogen	11995
RPMI lub DMEM bez czerwieni fenolowej	Invitrogen	11835-030
Płytka surowica płodowa bydlęca	Invitrogen	16000-044
L-glutamina (200 mM)	Invitrogen	25030
Penicylina-streptomycyna (10 000 J/ml)	Invitrogen	15140
Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór	Invitrogen	25300
HEPES (1 M)	Invitrogen	15630
sterylne szalki Fluoro o średnicy 35 mm z denkiem z szkiełka podstawowego o grubości 0,17 mm (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Sterylna kuweta do elektroporatora Gene Pulser (odległość między elektrodami 0,4 cm) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
elektroporator Gene Pulser II	Bio-Rad
System epi-fluorescencyjny TE-FM przymocowany do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE300	Nikon Instruments
Oprogramowanie Metamorph	Uniwersalne obrazowanie
Pionowy wyciągacz mikropipet	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
Hydrauliczny mikromanipulator MO-188NE	Narishige International
Grubościowy manipulator manualny, MN-188NE	Narishige International
konstrukcje cDNA:
cDNA receptora sprzężonego z białkiem G, znakowanego białkiem fluorescencyjnym o czerwonej barwie na C-końcu (hBLT1-RFP)	Jala i wsp. 2005
cDNA białka cytozolowego znakowanego GFP (β-arrestyna1-GFP w niniejszym badaniu).	Jala i wsp. 2005