Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Podsumowanie

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Streszczenie

Szczegółowo wyjaśniamy, jak odsłonić i przeprowadzić rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych dla neuronów ruchowych o wysokiej (fazowej) i niskiej (tonicznej) aktywności wyjściowej, unerwiających mięsień prostownik w nodze chodu raków. Wyraźne różnice występują w fizjologii i morfologii zakończeń nerwowych fazowych i tonicznych. Akson toniczny zawiera znacznie więcej mitochondriów, co pozwala mu na intensywniejsze przyjmowanie barwnika witalnego niż w przypadku aksonu fazowego. Zakończenia toniczne posiadają zgrubienia (varicosities), natomiast zakończenie fazowe jest nitkowate. Zakończenia toniczne charakteryzują się niską skutecznością synaptyczną, ale wykazują gwałtowne odpowiedzi ułatwione. W przeciwieństwie do nich, zakończenia fazowe mają wysoką skuteczność kwantową, lecz wykazują depresję synaptyczną przy stymulacji o wysokiej częstotliwości. Wyjście kwantowe jest mierzone za pomocą ogniskowej elektrody macropatch umieszczonej bezpośrednio nad wizualizowanymi zakończeniami nerwowymi. Zarówno zakończenia fazowe, jak i toniczne unerwiają te same włókna mięśniowe, co sugeruje, że za różnicowanie morfologiczne i fizjologiczne odpowiadają immanentne różnice w neuronach, a nie zróżnicowana sprzężenie zwrotne wsteczne z mięśnia.

Protokół

1) Wstęp

Neurony ruchowe komunikują się z włóknem mięśniowym w synapsach, które zbiorczo określa się jako złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ). Do NMJ można łatwo uzyskać dostęp w większości preparatów mięśniowych skorupiaka z rodzaju crayfish. Wiele NMJ u tych skorupiaków wykazuje niewybuchowe wzbudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP), podobne do stopniowanych sygnałów elektrycznych generowanych w dendrytach postsynaptycznych w OUN ssaków lub odpowiedzi podprogowych odnotowanych w NMJ kręgowców (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946). NMJ skorupiaków mogą służyć jako fundamentalne modele synaptyczne, dostarczając ogólnej wiedzy na temat przekazywania synaptycznego oraz różnicowania synaptycznego.

Zasadniczo jednostki motoryczne regulują aspekty zachowania zwierząt poprzez rodzaj komunikacji synaptycznej w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJ) oraz właściwości mięśni. Od czasu pierwszej obserwacji „szybkich” i „wolnych” skurczów mięśni w mięśniu przyzęblistym kraba i raków (Lucas, 1907, 1917), podobne różnicowanie kurczliwości mięśni opisano w innych typach mięśni raków, takich jak zginacze brzuszne (Kennedy & Takeda, 1965a, b) oraz prostowniki kończyn (Van Harreveld & Wiersma, 1936). Skurcze „szybkie” inicjują błyskawiczne reakcje; przykładem takiego zachowania jest szybki ruch odwłoka raka. Skurcze „wolne” odpowiadają za powolne ruchy i pomagają w utrzymaniu postawy ciała (Bradacs et al., 1997). Odpowiadająco do „szybkich” i „wolnych” skurczów mięśni, określenia „fazowe/wysoka aktywność” oraz „toniczne/niska aktywność” są szeroko stosowane w odniesieniu do neuronów ruchowych. Różnice w tempie i czasie skurczu mięśnia są częściowo związane z presynaptycznymi różnicami w strukturze i sile synaptycznej (King et al., 196). Ekspresja izoform białek miofibrylarnych jest również istotna dla różnic w kurczliwości, jednak w preparatach takich jak mięsień prostownik kończyny, w którym dane włókno jest unerwione przez oba typy neuronów ruchowych, główną uwagę poświęca się różnicom synaptycznym zakończeń, ponieważ zakończenia te współdzielą tę samą komórkę docelową (Mykles et al., 202). Wcześniejsze badanie analizowało dwa pobudzające aksony ruchowe prostownika kończyny i opisało fenotypy fazowe oraz toniczne (Bradacs et al., 197). W niniejszym raporcie demonstrujemy, jak przeprowadzić sekcję i uzyskać zapisy, aby umożliwić innym dalsze badanie właściwości różnicowania synaptycznego tych zakończeń nerwowych.

Analiza za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej różnych serii przekrojów uzyskanych z terminali tonicznych i fazycznych mięśnia prostownika nogi raków wykazała, że terminale toniczne zawierają więcej pęcherzyków RRP niż terminale fazyczne; w neuronach tonicznych częściej występują mitochondria, a synapsy w terminalach fazycznych są bardziej złożone niż w synapsach o niskiej wydajności, ponieważ zawierają one liczne strefy aktywne o zróżnicowanych odstępach (Miller et al, 2002; Johnstone et al., 2008; King et al., 196; Bradacs et al., 197). Terminale toniczne o niskiej wydajności są również bardziej podatne na wzmocnienie transmisji synaptycznej za pomocą neuromodulatora serotoniny (5-HT) niż terminale fazyczne (Cooper et al., 203).

Fakt, że toniczne i fazowe NMJ występują na tym samym włóknie mięśniowym, ułatwia ocenę różnic presynaptycznych w obrębie danego włókna oraz analizę kwestii zmęczenia mięśni, depresji synaptycznej i interferencji synaptycznej (synaptic cross talk). W tym preparacie wciąż pozostają nierozwiązane kwestie, takie jak to, czy istnieją różnice w gęstości receptorów postsynaptycznych i podtypach receptorów glutaminianu w obszarach postsynaptycznych dla zakończeń tonicznych i fazowych, jednak lepsze zrozumienie fundamentalnych różnic w anatomii i fizjologii tych dwóch jednostek motorycznych pomoże w zbudowaniu głębszej bazy wiedzy. Nadzieją jest, że zasady podstawowe poznane w tym preparacie synaptycznym znajdą zastosowanie w innych synapsach w różnych preparatach i usprawnią przyszłe badania w tym synaptycznym modelu raka rzecznego.

2) Metody

1. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na pierwszej lub drugiej parze odnóży krocznych średniej wielkości raków (Procambarus clarkii). Zwierzęta są przetrzymywane indywidualnie w plastikowych pojemnikach z natlenioną wodą. Temperatura w pomieszczeniu hodowlanym mieści się w zakresie 13°C-16°CZwierzęta są karmione suchym pokarmem dla ryb, a woda jest wymieniana raz w tygodniu.
   
   
   Rysunek 1: Schemat nogi krocznej raków oraz sześciu segmentów dystalnych.
2. Dystalna część nogi krocznej u raka jest anatomicznie podzielona na sześć segmentów (Rysunek 1). Prostownik nogi znajduje się w meropodzie, a pęczek nerwów przeznaczony do izolacji położony jest blisko stawu meropodopodite-ischiopodite. Po odsłonięciu aksony toniczne lub fazowe mogą być stymulowane selektywnie, zgodnie z potrzebami fizjologicznymi.
3. Cooper i Cooper (209) opisali niektóre aspekty wstępnej sekcji, w tym metody odsłaniania ekscytora otwierającego neuronu ruchowego w obszarze meropoditu, jednak ich opis nie uwzględnia środków niezbędnych do ochrony mięśnia prostownika przed uszkodzeniem, ponieważ nie było to wymagane przy przygotowaniu mięśnia otwierającego. W celu ochrony prostownika, u raka o długości ciała 6–10 cm (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), usuwa się pierwszą lub drugą odnóżkę chodną poprzez pobudzenie zwierzęcia do autotomii kończyny poprzez silne ściśnięcie w miejscu dystalnym względem płaszczyzny złamania w segmencie ischiopoditu. Odnóżkę umieszcza się na płytce sekcyjnej stroną boczną (zewnętrzną) skierowaną w stronę obserwatora. Odnóżkę obraca się do momentu, aż obserwator zyska pewność, że strona zewnętrzna (boczna) znajduje się uprawo na płytce sekcyjnej, zazwyczaj z wypukłą stroną skierowaną do góry (Rysunek 2). Umieszczenie odnóżki na kawałku ręcznika papierowego ułatwia obracanie preparatu podczas wykonywania tych nacięć.
   
   
   Rycina 2: Strona boczna meropodytu, zazwyczaj strona wygięta, powinna być skierowana ku górze na płytce sekcyjnej.
4. Przy użyciu łamacza i uchwytu ostrzy skalpela, ostrym ostrzem żyletki wykonuje się nacięcie kutykuli, aż do całkowitego przecięcia, zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 3 dla segmentu meropoditu. Należy uważać, aby podczas cięcia od strony grzbietowej do brzusznej nie przeciąć zbyt daleko w kierunku dystalnym w miejscu stawu meropodito-karpopoditu.
   
   
   Rysunek 3: Segment meropoditu z liniami przedstawiającymi sugerowany wzór trawienia otworu w kutykuli.
   
   
   Preparat umieszcza się w soli fizjologicznej. Pojemnik do sekcji powinien mieć na dnie powłokę z Sylgard (Dow Corning) o grubości 1 cm. Sylgard jest stosowany w celu umożliwienia wbijania w niego szpilek entomologicznych do stabilizacji preparatu. Na tym etapie szpilkę wbija się w środek segmentu karpopoditu oraz w stronę grzbietową segmentu ischiopoditu (Rysunek 4). Przeprowadzone sekcje są zanurzone w standardowej soli fizjologicznej dla raków, zmodyfikowanej z roztworu Van Harrevelda (1936), składającej się z 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.₂; 2H₂O; 2,45 MgCl2₂; 6H₂O; 5 HEPES i dostrojono do pH 7,4 (w mM).
   
   
   
   Rycina 4: Odczepianie segmentu meropoditu z wyciętym okienkiem. Zwróć uwagę na rozmieszczenie szpilek sekcyjnych.
5. Kutikulę delikatnie unosi się w części dystalnej, a następnie odcina włókna mięśniowe od kutikuli, wykonując cięcia w kierunku podstawy nogi. Po tym zabiegu kutikulę można zdjąć.
6. Apodema (ścięgno) zostaje przecięta w stawie meropodytu i karpopodytu. Na wewnętrznej powierzchni ścięgna zginacza umieszcza się szpilkę, aby wskazać miejsce cięcia (Rycina 5). Następnie miejsce przecięcia ścięgna chwyta się pęsetą, a mięsień zginacz odciąga, unosząc go w kierunku kaudalnym (Rycina 6), co odsłania główny nerw nogi oraz mięsień prostownik.
   
   
   Rysunek 5: Apodema mięśnia zginacza została uwidoczniona poprzez odsunięcie jej od mięśnia za pomocą szpilki.
   
   
   
   Rysunek 6: Apodema mięśnia zginacza zostaje przecięta i usunięta z zachowaniem ostrożności, aby nie uszkodzić głównego nerwu kończyny.
7. Główny nerw kończyny przecinamy na stawieniu meropoditu z karpopoditem i ostrożnie odsuwamy go w kierunku mięśnia prostownika. W całym badaniu wykorzystywana jest powierzchnia przyśrodkowa mięśnia. Oddzielenie nerwu mięśnia prostownika od głównego nerwu kończyny można ułatwić, delikatnie odsuwając dystalny kikut głównego nerwu kończyny na bok preparatu. Podczas odsuwania głównego nerwu kończyny znad mięśnia prostownika może zajść konieczność przecięcia małych odgałęzień aksonów. Są to odgałęzienia inhibitoryjnego neuronu ruchowego do mięśnia prostownika. Większy pęczek odchodzący od głównego nerwu kończyny w pobliżu proksymalnego końca meropoditu jest poszukiwanym małym pęczkiem nerwowym.
   
   
   Rysunek 7: Główny nerw kończyny zostaje przecięty i odciągnięty w kierunku proksymalnym.
   
   
   Ten pęczek nerwowy można zaobserwować po barwieniu błękitem metylenowym (Rycina 8) lub po barwieniu fluorescencyjnym 4-Di-2-ASP (Rycina 9).
   
   
   
   Rycina 8: Mięsień prostownik barwiony błękitem metylenowym. Zwróć uwagę na rozgałęzienie aksonów oraz dwa wyraźnie widoczne aksony w obrębie nerwu. Czerwone strzałki wyznaczają przebieg nerwu.
   
   
   
   Rysunek 9: Aksony nerwu ruchowego barwione 4-Di-2-ASP. Akson toniczny jest widoczny wyraźniej ze względu na zwiększoną zawartość mitochondriów.
   
   
   Rysunek 10A: Poszczególne terminale neuronów fazycznych i tonicznych zabarwione 4-Di-2-ASP. Zwróć uwagę na obecność żlebi na terminalach tonicznych oraz na cienką strukturę terminali fazycznych.
   
   
   
   Rycina 10B -Odnotowano napięcie mięśniowe
   
   
   
   Rycina 10C -Odnotowano fazowość

3) Profile fizjologiczne

1. Aby zaobserwować pobudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP) neuronów tonicznych lub fazycznych, jeden z izolowanych aksonów w pęczku nerwowym jest stymulowany za pomocą elektrody ssącej (Rysunek 11) podłączonej do stymulatora Grass, podczas gdy monitorowane są potencjały wewnątrzkomórkowe w mięśniu (Johnstone i wsp.., 208). Stymulację o częstotliwości 70 Hz przykłada się do aksonu tonicznego w celu wywołania odpowiedzi ułatwionej w złączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) o niskiej aktywności lub przykłada się pojedynczy impuls (1 Hz) do aksonu fazycznego, aby uzyskać duże potencjały postsynaptyczne pobudzające (EPSP) w NMJ o wysokiej aktywności, zgodnie z rysunkiem 12. EPSP są rejestrowane przez komputer za pomocą interfejsu PowerLab/4s.
   
   
   Rycina 1: Elektroda stymulująca umieszczona nad pojedynczym aksonem w pęczku nerwowym. Zielona linia obrysowuje dwa główne aksony.
   
   
   
   Rysunek 12: Potencjały postsynaptyczne (EPSP) neuronów tonicznych lub fazycznych uzyskane za pomocą rejestracji wewnątrzkomórkowej.
2. Badania nad naturą ułatwienia synaptycznego i depresji synaptycznej można przeprowadzić za pomocą różnych paradygmatów doświadczalnych z wykorzystaniem połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) o niskiej i wysokiej wydajności. Ułatwienie w NMJ o niskiej wydajności zależy od częstotliwości, co wykazano dla impulsów o częstotliwości 20, 40 i 60 Hz przy około 20 bodźcach (Rysunek 13).
   
   
   Rysunek 13: EPSP w odpowiedzi na pociąg impulsów stymulacyjnych podawanych z trzema różnymi częstotliwościami: 20, 40 i 60 Hz w standardowym roztworze soli fizjologicznej dla raka.
3. Szybkość depresji synaptycznej w zależności od częstotliwości stymulacji jest również związana z wysoką wydajnością połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Rysunek 14 przedstawia ciągłą stymulację z częstotliwością 5 Hz, która prowadzi do depresji NMJ w ciągu 30 min. Przy wyższej częstotliwości stymulacji preparat będzie ulegał depresji szybciej (Bradacs i wsp.., 1997).
   
   
   Rysunek 14: Amplituda EPSP odpowiedzi fazowej podczas stymulacji o częstotliwości 5 Hz w celu wywołania depresji.

4) Reakcje kwantowe

1. W niniejszym preparacie zastosowano procedurę podobną do tej opisanej dla mięśnia otwierającego u raków (Cooper i Cooper, 209). Kwantowe EPSP bezpośrednio nad zidentyfikowanymi obszarami zakończenia nerwowego rejestrowano poprzez umieszczenie światła elektrody do rejestracji makropatch na wzdęgach synaptycznych zwizualizowanych za pomocą barwnika witalnego 4-Di-2-Asp (5 μM, 5-minutowa inkubacja, Cooper i wsp.., 1995; Magrassi i wsp.., 1987). Spontaniczne, jak i wywołane odpowiedzi kwantowe można rejestrować wzdłuż zakończeń nerwowych. Wywołane i spontaniczne potencjały synaptyczne rejestrowane są za pomocą elektrody makro-patch (Dudel, 1981; Wojtowicz i in.., 191; Mallart, 1993). Szkło Kimax (średnica zewnętrzna: 1,5 mm) zostało wyciągnięte i wypolerowane ogniowo w celu wytworzenia końcówek elektrod z wewnętrznymi średnicami w zakresie od 10 do 20 μm (Rysunek 15).
   
   
   Rycina 15: Średnica wnętrza elektrody do rejestracji makropłata.
   
   
   Światło elektrody wypełnia się medium kąpielowym. Wzmacniacz jest taki sam, jak ten użyty do wspomnianych wyżej rejestracji wewnątrzkomórkowych. Opór elektrody i uszczelnienia można określić poprzez przepuszczenie impulsów prądu testowego przez elektrodę. W naszych eksperymentach opory uszczelnienia mieściły się w zakresie od 0,3 do 1,0 MOhm, a opór elektrody w zakresie od 0,5 do 1,0 MOhm. Opór uszczelnienia może być monitorowany przez cały czas trwania rejestracji.
2. Bezpośrednie przeliczanie zdarzeń kwantowych jest możliwe przy niskich częstotliwościach stymulacji. Dla każdej odpowiedzi wywołanej liczbę zdarzeń kwantowych można łatwo określić w przypadku terminali o niskim wyjściu (Rysunek 16). Takie bezpośrednie przeliczenia mogą pomóc w oszacowaniu średniej zawartości kwantowej (Del Castillo & Katz, 1954; Cooper i wsp.., 1995). Ponieważ wywołane odpowiedzi w NMJ o wysokiej wydajności generują wielokwantowe zdarzenia wywołane, średnią amplitudę lub pole wychyleń, wraz ze średnią amplitudą szczytową lub polem zdarzeń spontanicznych, można wykorzystać do przybliżenia średniej zawartości kwantowej (Cooper i wsp.., 1995).
   
   
   Rysunek 16 Ślady ogniskowe zarejestrowane z fazowej i tonicznej złącza neuromięśniowego (NMJ).
   
   
   Rysunek 17

Dyskusja

W niniejszym raporcie zademonstrowaliśmy, jak przeprowadzić sekcję, rejestrację oraz kwantyfikację odpowiedzi synaptycznych w unikalnym preparacie nerwowo-mięśniowym raka, w którym zarówno terminale o wysokiej, jak i niskiej wydajności unerwiają to samo włókno mięśniowe. Preparaty nerwowo-mięśniowe raka oferują wiele zalet w porównaniu z złączami nerwowo-mięśniowymi kręgowców, ponieważ do unerwienia mięśnia potrzeba tylko kilku pobudzeniowych neuronów ruchowych, a neurony te są identyfikowalne w kolejnych preparatach (Atwood, 1976). Ponadto neurotransmiter pobudzeniowy to glutaminian, a pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (EPSP) są stopniowane; zatem biofizyczne właściwości zdarzeń stopniowanych są analogiczne do właściwości dendrytów neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców. Prądy kwantowe mogą być jednak monitorowane bezpośrednio w miejscach postsynaptycznych (Cooper et al., 1995).

Powtarzająca się stymulacja nerwu fazowego z częstotliwością 5 Hz wywołuje duże EPSP, które ulegają znacznemu osłabieniu po kilku minutach. Ten rodzaj depresji jest powszechny w fazowych złączach nerwowo-mięśniowych stawonogów (Atwood and Cooper, 1996). Obecność zakończeń tonicznych obok zakończeń fazowych pozwala ocenić, czy cel postsynaptyczny ulega znacznemu przekształceniu podczas i po depresji fazowego neuronu ruchowego. Dodatkowo, zakończenia o niskiej aktywności stanowią korzystny model do badania mechanizmów leżących u podstaw facylitacji synaptycznej (Desai-Shah et al., 2008; Desai-Shah and Cooper, 2009)

Terminale o wysokiej wydajności stanowią obszar badań nad modulacją tempa depresji synaptycznej oraz procesu regeneracji. Dostępne i żywotne preparaty powinny pomóc w rozszyfrowaniu mechanizmów leżących u podłoża depresji synaptycznej. W tym preparacie prostownika nogi rakiej egzogenna aplikacja serotoniny jest kolejnym narzędziem do badania regeneracji po depresji synaptycznej i potencjalnie sposobem na dalsze badanie mobilizacji pul synaptic vesicle. Preparat ten oferuje kilka zalet eksperymentalnych, ponieważ poszczególne włókna mięśniowe są unerwione zarówno przez fazowe, jak i toniczne neurony ruchowe.

Ponieważ serotonina zwiększa liczbę pęcherzyków uwalnianych podczas stymulacji wywołanej oraz wspomaga regenerację w trakcie depresji synaptycznej, ewidentne jest, że w obecności serotoniny zachodzi pewna modulacja pul pęcherzykowych w celu zwiększenia prawdopodobieństwa fuzji (Johnstone et al., 2008; Logsdon et al., 2006; Sparks et al., 2004). Wśród różnych protokołów eksperymentalnych możliwych do przeprowadzenia z wykorzystaniem tego preparatu należy również rozważyć modele wyjaśniające dynamikę pul pęcherzykowych w obrębie presynaptycznego zakończenia nerwowego podczas stymulacji o niskiej częstotliwości, w przeciwieństwie do stanu depresji synaptycznej.

W innych systemach zauważono, że około 30% puli pęcherzyków podlega szybkemu recyklingowi, podczas gdy pozostałe pęcherzyki recyklingowane przechodzą przez tradycyjną, wolną ścieżkę recyklingu poprzez siateczkę śródplazmatyczną (Harata et al., 2001; Tsien et al., 2001). Takie podwójne ścieżki mogą występować również w tym systemie. Jeśli w stanie depresji zakończenia presynaptycznego brakuje ATP, dokowanie i oddokowywanie mogą nie zachodzić; w konsekwencji znacznie więcej niezaładowanych pęcherzyków pozostałoby na powierzchni synaptycznej. Ponieważ po wystawieniu zakończeń na działanie 5 HT uwalniane jest więcej pęcherzyków, prawdopodobne jest, że więcej z nich znajduje się w puli łatwo uwalnialnej (RRV). Jednak w stanie depresji, przy zmniejszonej ilości ATP, dokowanie i oddokowywanie mogą być zablokowane nawet w obecności 5 HT, co ponownie pozostawia niezaładowane pęcherzyki na powierzchni synaptycznej. Ponieważ wstępne dane sugerują, że wraz z upływem czasu, przy przedłużonej ekspozycji na 5 HT i stymulacji, uwalniane jest więcej pęcherzyków, rozkład puli pęcherzyków z szybkich i wolnych ścieżek recyklingu może być przesunięty tak, aby zapewnić pęcherzyki zdolne do ponownego uwolnienia (za Johnstone et al., 2008; patrz przeglądy – Desai-Shah et al., 2008; Desai-Shah i Cooper, 2009)

Wykorzystując techniki ogniskowych rejestracji makropłatowych prądów postsynaptycznych oraz pomiary pojedynczych kwantów z określonych obszarów zakończeń nerwów ruchowych, można postawić pytania pozwalające ustalić, czy depresja synaptyczna wynika z uwalniania mniejszej liczby pęcherzyków, czy z zaburzeń funkcji receptorów postsynaptycznych. Wykazano, że przy tej samej ekspozycji na wapń pęcherzyki w fazowych złączach neuromięśniowych (NMJ) w tej preparacji są bardziej podatne na fuzję (Miller et al. 2005), co prawdopodobnie wyjaśnia wyższą średnią zawartość kwantową w zakończeniach fazowych (Msghina et al., 1998, 1999). Ponadto różnice w białku wiążącym wapń — frekweninie (Jeromin et al., 1999) — oraz w ultrastrukturze (King et al., 1996) przyczyniają się do zróżnicowanej skuteczności synaptycznej (Cooper et al., 2003).

Niektóre wcześniejsze badania analizowały fenotyp mięśniowy włókien mięśni prostowników (Bradacs et al., 1997; Cooper et al., 2003). Porównanie regulacji różnicowania mięśni dla włókien o charakterze ściśle tonicznym i fazycznym u raka z włóknami mieszanymi, takimi jak w przypadku podwójnie unerwionego prostownika nogi, może dostarczyć wskazówek dotyczących ekspresji i regulacji fenotypu mięśniowego (LaFramboise et al., 2000; Sohn et al., 2000; Griffis et al., 2001; Mykles et al., 2002).

W neurobiologii wciąż pozostaje wiele fundamentalnych pytań, a niniejsze przygotowanie może pomóc w rozwiązaniu niektórych z nich. Kilka aktualnie interesujących obszarów badawczych, które można analizować z wykorzystaniem mięśnia prostownika nogi, obejmuje: 1) określenie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw depresji synaptycznej w terminalach o wysokim wydajności (czy depresja wynika z ograniczenia napływu Ca2+, braku kompetentnej puli pęcherzyków gotowych do uwalniania (RRV) i/lub zmienionej receptywności postsynaptycznej?), 2) określenie mechanicznej roli 5-HT w przypadku jej podania po indukcji depresji synaptycznej w celu przyspieszenia regeneracji oraz 3) ustalenie, czy kształty prądów kwantowych powstających w wyniku stymulacji terminali fazowych ulegają zmianie podczas indukcji depresji, aby zbadać presynaptyczne i postsynaptyczne komponenty depresji synaptycznej.

To NMJ jest istotne dla prowadzeń badań oraz przyszłych badaczy, ponieważ umożliwia uzyskanie odpowiednich informacji dotyczących mechanizmów leżących u podstaw wydajności synaptycznej, mierzonej bezpośrednio w miejscach uwalniania. Obecne badania w tej dziedzinie dostarczają informacji na temat modulacji depresji synaptycznej przez 5-HT oraz dynamiki pul pęcherzykowych. Zagadnienia te odnoszą się do podstawowych zasad przekaźnictwa synaptycznego, które są istotne dla wszystkich układów nerwowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rak (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standardowy roztwór soli fizjologicznej dla raków: Zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl22H2O; 2,45 MgCl26H2O; 5 HEPES, z pH dostosowanym do 7,4 Narzędzia do sekcji: precyzyjne pęsety nr 5, precyzyjne nożyczki, uchwyt do ostrza noża, szpilki entomologiczne nr 26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Kuweta sekcyjna powlekana Sylgardem, kuweta rejestracyjna wyposażona w elektrodę ssącą lub elektroda ssąca z manipulatorem do jej stabilizacji. Mikroskop sekcyjny z funkcją zoom do rejestracji wewnątrzkomórkowych. Do rejestracji ogniskowej na wizualizowanych zakończeniach stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X). Wymagane jest źródło światła Hg. Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/C do rejestracji online na komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą interfejsu PowerLab/4s (ADInstruments, Australia). Używamy standardowego oprogramowania od ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Odczynniki chemiczne: Do wizualizacji wariancji stosujemy żywy barwnik fluorescencyjny, 4 [4 (dietyloamino) styryl] N metylopirydinium jodek (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR) (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). Wszystkie odczynniki do roztworów soli fizjologicznej zostały zakupione w firmie chemicznej Sigma (St. Louis, MO). Do rejestracji wewnątrzkomórkowych używamy szklanych kapilar (katalog nr 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do elektrod macropatch używamy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć rezystancję od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szklanej po wytworzeniu cienkiego wierzchołka za pomocą wyciągacza elektrod. Odłamana końcówka musi być czystym, prostopadłym przełamaniem o średnicy około 20μM. Następnie końcówka jest polerowana termicznie do średnicy wewnętrznej około 10μM. Trzon elektrody jest następnie przepuszczany przez element grzejny, aby wygiąć go o około 45 stopni w sposób łagodny. Pozwala to na uzyskanie płaskiego lub prostopadłego światła elektrody nad zakończeniem nerwowym, ponieważ kąt mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.