Artykuł metodologiczny

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

59.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2322

⸱

18 stycznia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Streszczenie

Celem niniejszego opracowania jest pomoc w zrozumieniu efektów wywołanych przez gradienty jonowe w obrębie błony biologicznej. Dwoma aspektami wpływającymi na potencjał błonowy komórki, które analizujemy w tych eksperymentach, są: (1) stężenie jonów K+ na zewnątrz błony oraz (2) przepuszczalność błony dla konkretnych jonów. Mięśnie prostowniki brzucha raka są podzielone na grupy, z których niektóre wykazują fenotypy biochemiczne i fizjologiczne oraz strukturę toniczną (wolną), a inne fazową (szybką); neurony ruchowe unerwiające te mięśnie różnią się w analogiczny sposób pod względem charakterystyki funkcjonalnej. Wykorzystujemy te mięśnie, a także powierzchowny, toniczny mięsień zginacz brzucha, aby zademonstrować właściwości przekaźnictwa synaptycznego. Ponadto wprowadzamy obwód sensoryczny-OUN-neuron ruchowy-mięsień, aby wykazać efekt stymulacji sensorycznej kutykuli oraz wpływ neuromodulatorów na niektóre aspekty tego obwodu. Dzięki technikom opanowanym w ramach tego ćwiczenia można zacząć odpowiadać na wiele pytań pozostających bez odpowiedzi w innych preparatach eksperymentalnych, a także w zastosowaniach fizjologicznych związanych z medycyną i zdrowiem. Wykazaliśmy użyteczność modelowych preparatów bezkręgowców w rozwiązywaniu fundamentalnych problemów istotnych dla wszystkich zwierząt.

Protokół

1. Wprowadzenie

Celem tych ćwiczeń laboratoryjnych jest zrozumienie właściwości błon pobudliwych, jonowych podstaw spoczynkowego potencjału błonowego oraz metod pomiaru potencjału błonowego. Ponadto przedstawiono barwienie i histologię mięśni, które mogą być wykorzystane do nauki budowy mięśni. Zastosowano również dwa różne rodzaje preparatów sekcyjnych w celu zademonstrowania właściwości przekaźnictwa synaptycznego w różnych grupach mięśniowych. Wykorzystano także kompletny obwód sensoryczny – ośrodkowy układ nerwowy (OUN) – motoneuron – mięsień w odwłoku raka, aby zaprezentować preparat służący do badania stymulacji sensorycznej oraz wpływu neuromodulatorów i neurotransmiterów na poszczególne aspekty obwodu.

Pierwsza część niniejszego raportu przedstawia metody stosowane do pomiaru spoczynkowego potencjału błonowego oraz wpływu pozakomórkowego K+ na potencjał błonowy. Przedstawimy również strukturę mięśni. W drugiej części ćwiczenia prezentujemy różne sposoby pomiaru odpowiedzi synaptycznych z różnych typów złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ). Pierwsze ćwiczenie wykorzystuje mięśnie prostowniki brzucha raka, a drugie mięśnie zginacze powierzchowne brzucha. Ponadto prezentujemy obwód neuronalny (brzuszny sznur nerwowy raka z wejściami sensorycznymi i wyjściami motorycznymi), który jest łatwy w utrzymaniu i może być wykorzystywany zarówno w celach dydaktycznych, jak i badawczych w różnych aspektach obwodu sensorycznego-OUN-neuron motoryczny-mięsień. Po zakończeniu wyjaśnień dotyczących wstępnych ćwiczeń, przedstawimy fizjologię NMJ oraz obwodu OUN.

Gradient jonowy w poprzek błony biologicznej może prowadzić do powstania różnicy potencjałów. W przypadku komórki w stanie spoczynku różnica ładunków elektrycznych w poprzek błony komórkowej jest znana jako spoczynkowy potencjał błonowy komórki. Omówimy dwa główne czynniki wpływające na potencjał błonowy komórki. Pierwszym z nich jest stężenie jonów po obu stronach błony. Drugim jest przepuszczalność błony dla jonów. Należy pamiętać, że w żywej komórce występuje szereg różnych jonów o zróżnicowanych stężeniach wewnątrz i na zewnątrz komórki. Kluczowymi jonami, którymi się zajmiemy, są sód (Na+), potas (K+) oraz chlorek (Cl-). Ilości i ruch tych jonów przez błonę mięśniową determinują potencjał błonowy. Na tej podstawie możemy przeanalizować potencjały elektryczne obserwowane podczas pobudzenia i hamowania elektrycznego błony w odpowiedziach synaptycznych oraz zbadać działanie czynników farmakologicznych. Możemy również tworzyć modele biofizyczne reprezentujące te procesy, aby eksperymentalnie testować określone koncepcje (Robinson et al., 2010).

Zastosowanie szklanych mikroelektrod kapilarnych umożliwia rejestrację potencjałów błonowych. O ile końcówka elektrody jest odpowiednio mała, może ona zostać wprowadzona przez błonę komórkową bez uszkadzania jej, co pozwala na uzyskanie dokładnego pomiaru potencjału przezbłonowego. Technika ta znajduje szczególne zastosowanie w przypadku dużych komórek, które są mniej podatne na uszkodzenia podczas wprowadzania elektrody wewnątrzkomórkowej. Jest to jedna z podstawowych technik stosowanych w fizjologii.

Równowaga jonów Na+ i K+ przez błonę jest utrzymywana w warunkach fizjologicznych przez pompę Na-K ATPase. W normalnych warunkach pompa przenosi średnio trzy jony Na+ poza komórkę i dwa jony K+ do wnętrza komórki. Warto wspomnieć, że za to odkrycie dokonane pod koniec lat 50. XX wieku w 197 roku przyznano Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Podstawy tego odkrycia uzyskano w badaniach z wykorzystaniem aksonów kraba (Skou, 1965, 198).

Pompa ta jest również uznawana za elektrogenną, ponieważ wykazuje większą zdolność do pompowania w stanie depolaryzacji błony (Skou, 1989a,b). W wielu komórkach szybkość pracy pompy wzrasta, gdy komórka zostaje elektrycznie aktywowana poprzez depolaryzację.

Potas może również przemieszczać się przez kanały „przecieku” potasowego, gdy komórka znajduje się w stanie spoczynku. Ze względu na te kanały przecieku potasowego membrana komórkowa w spoczynku jest bardziej przepuszczalna dla potasu niż dla innych jonów. W związku z tym potencjał spoczynkowy błony komórkowej jest bliższy potencjałowi równowagi dla potasu niż dla sodu. Można następnie zbadać potencjał spoczynkowy błony, aby sprawdzić, czy zależy on od potencjału równowagi potasu.

1) Zmienność mięśniowa

Włókna mięśniowe skorupiaków wykazują większą zmienność cech strukturalnych, elektrycznych właściwości błony oraz właściwości skurczowych niż włókna mięśniowe kręgowców. Fazowe włókna mięśniowe u skorupiaków są przystosowane do skurczów typu drgawek. Charakteryzują się one krótką długością sarkomerów (2-4 mikronów), cienkimi, prostymi liniami Z, niskim stosunkiem cienkich do grubych miofilamentów oraz dobrze rozwiniętymi układami kanalików T i siateczki sarkoplazmatycznej. Błony fazowych włókien mięśniowych mogą generować stopniowane lub zniesione (wszystko albo nic) potencjały czynnościowe. Z kolei toniczne włókna mięśniowe są przystosowane do długotrwałego utrzymywania napięcia. Często mają one długość sarkomerów od 10 do 15 mikronów, grube, pofalowane linie Z, wysoki stosunek cienkich do grubych miofilamentów oraz słabiej rozwinięte układy kanalików T i siateczki sarkoplazmatycznej. Błony tonicznych włókien mięśniowych są często elektrycznie niewzbudliwe lub mogą generować stopniowane odpowiedzi elektryczne („kolce stopniowane”). W mięśniach skorupiaków występuje szeroki zakres pośrednich typów włókien.

2) Równania

Równaniami powszechnie stosowanymi do wyznaczania potencjału równowagi jonu oraz potencjału spoczynkowego błony są odpowiednio równanie Nernsta i równanie Goldmana-Hodgkina-Katza (G-H-K). Istotna różnica między tymi dwoma równaniami polega na tym, że równanie Nernsta stosuje się tylko do jednego konkretnego jonu w celu określenia jego potencjału równowagi, natomiast równanie G-H-K służy do wyznaczenia potencjału spoczynkowego poprzez uwzględnienie przepuszczalności wielu jonów oraz ich gradientów w obrębie błony komórkowej (Nernst, 18, 189; Goldman, 1943; Hodgkin and Huxley, 1952; Hodgkin et al., 1952 ; Hodgkin and Katz, 1949; patrz Hille, 192).

Równanie Nernsta jest zazwyczaj rozważane dla jonów przenikających przez membranę, generujących siłę elektromotoryczną, co najczęściej przedstawia się w następujący sposób:

V= (RT/zF) ln([X]out/ [X]in)

X = analizowany jon
V = napięcie równowagi dla jonu X w obrębie membrany
R = stała gazowa [8.314 J/(mol•K)]
T = temperatura bezwzględna [Kelvin]
Z = walencyjność jonu
F = stała Faradaya [9.649 x 104 C/mol]

W przypadku jonu K+ w temperaturze 20°C, po przekształceniu Ln na Log10 oraz podstawieniu stałych, otrzymujemy:

Potencjał =58 log ([Kin]/[Kout]) ; wyrażony w mV

Przyjmijmy, że tylko K+ przenika drogą dyfuzji. [Kin] to stężenie K+ wewnątrz komórki, a [Kout] to stężenie K+ na zewnątrz komórki.

W ramach ćwiczenia oblicz przybliżoną wartość [Kin]. ______________

Przyjmij do tego obliczenia, że potencjał błonowy zależy wyłącznie od potencjału równowagi K+.

Przyjmij, że stężenie [Kout] dla użytej soli fizjologicznej wynosi 5,4 mM. Załóż również, że potencjał błonowy wynosi -70mV.

Potencjał = 58 log ([Kin]/5,4).

W eksperymencie zmierzymy potencjał spoczynkowy błony komórkowej i określimy, w jaki sposób jest on modyfikowany przez zmianę [Kout]. Nachylenie hipotetycznej linii wiążącej potencjał błony z [Kout] wynosi 58. Po zebraniu danych dotyczących potencjału spoczynkowego przy różnych stężeniach [Kout] (zakres od 5,4 mM do 100 mM) wykreślimy wartości obserwowane, aby sprawdzić, czy są one zgodne z linią hipotetyczną. Do wyznaczenia punktu początkowego linii hipotetycznej i obserwacyjnej na potrzeby porównania wykorzystamy średni potencjał spoczynkowy uzyskany przy stężeniu [Kout] 5,4 mM.

Biorąc pod uwagę, że błona może być przepuszczalna dla więcej niż jednego jonu w stanie spoczynku, a także w różnych stanach depolaryzacji, stosuje się równanie G-H-K, aby uwzględnić przepuszczalność (P w równaniu) dla różnych jonów. Równanie G-H-K sprowadza się do równania Nernsta, jeżeli błona jest przepuszczalna tylko dla jednego jonu.

Oto uogólnione równanie G-H-K dla Na++, K+, i Cl-- jony:

Równanie Nernsta dla równowagi jonowej; wzór reprezentujący elektrochemiczny potencjał błonowy.

Ponieważ Cl- ponieważ posiada ładunek ujemny, w tym równaniu człon stężenia dla wnętrza i zewnętrznej strony jest odwrócony. Pozwala to na pominięcie wartości Z (ładunku jonu).

3) Cele tego ćwiczenia

W tym eksperymencie zmierzymy potencjał błonowy komórki mięśniowej rakowiego skorupiaka i zastosujemy omówione powyżej zasady w celu rozwiązania następujących kwestii:

  1. Sposób pomiaru potencjału błony komórkowej z wykorzystaniem odpowiedniej aparatury i techniki.
  2. Przepuszczalność błony komórkowej komórek mięśniowych dla jonów i jej wpływ na potencjał błonowy.

    Dodatkowo przeprowadzona zostanie wstępna analiza budowy mięśni:
  3. Zastosowanie barwników w celu uwidocznienia anatomii mięśni w części grzbietowej odwłoka raków, wykorzystywanych do przeprowadzenia tych eksperymentów elektrofizjologicznych.
  4. Badanie histologii różnych typów włókien mięśniowych.

W ramach niniejszego ćwiczenia laboratoryjnego wykorzystamy mięśnie prostowniki brzucha raka. Preparat ten był stosowany w przeszłości do nauczania tych zasad fizjologii i anatomii (Atwood and Parnas, 1968). Wykorzystaliśmy wiele procedur z tego źródła, modyfikując niektóre z nich, aby dostosować je do aktualnej aparatury i zrealizować założone cele w ciągu jednego 3-godzinnego bloku laboratoryjnego. Ćwiczenia te stanowią podstawę do innych eksperymentów wykorzystywanych w kursie fizjologii zwierząt w Departamencie Biologii na University of Kentucky (prowadzący dr R.L. Cooper, 2010).

4) Dlaczego ten model zwierzęcy

Istnieje kilka dobrych powodów zastosowania mięśni prostowników odwłoka raków w tym eksperymencie:

  1. Rakowce są powszechnie dostępne, stosunkowo tanie i łatwe w utrzymaniu w warunkach laboratoryjnych.
  2. Sekcja jest stosunkowo prosta dla studentów uczących się technik sekcyjnych w przypadku preparatów żywych.
  3. Mięsień pozostaje stabilny przez kilka godzin w minimalnym roztworze soli fizjologicznej, co jest korzystne dla studentów uczących się technik elektrofizjologicznych. Preparat mięśnia jest dość wytrzymały przy krótkotrwałych zmianach zewnętrznego stężenia [K+].
  4. Różnorodne odpowiedzi synaptyczne można łatwo uzyskać poprzez stymulację neuronów ruchowych.
  5. Układ anatomiczny mięśni prostowników jest łatwy do rozpoznamia, a dzięki ich dużemu rozmiarowi stosunkowo łatwo jest uzyskać stabilne rejestracje wewnątrzkomórkowe.
  6. Mięśnie oraz wzór unerwienia można łatwo zaobserwować przy użyciu barwienia błękitem metylenowym. Ponadto konkretne typy włókien mięśniowych można łatwo poddać obróbce histologicznej w celu obserwacji struktury sarkomerów.
  7. W wielu instytucjach w USA w przypadku preparatów z bezkręgowców wykorzystywanych w eksperymentach laboratoryjnych obecnie nie są wymagane protokoły dotyczące zwierząt.

2. Metody

1) Materiały

  • Nożyczki (1)
  • Pinceta (1)
  • Srebrny drut do elektrody uziemiającej (1)
  • Mikroskop (1)
  • Sonda elektrodowa (1)
  • Szalka Petriego z warstwą Sylgardu na dnie (1)
  • Roztwór soli fizjologicznej (1)
  • Roztwory potasu: 5,4mM (normalna sól fizjologiczna), 10, 20, 40, 80, 10 mM
  • Wybielacz ( niewielka ilość, używany do końcówki srebrnego drutu w celu wytworzenia Ag-Cl)
  • Pipeta szklana (1), do usuwania i dodawania roztworów
  • Strzykawka (1)
  • Wzmacniacz/System akwizycji danych (1)
  • Klatka Faradaya (1)
  • Komputer stacjonarny/laptop (1)
  • Szpilki sekcyjne (4)
  • Rak rzeczny

2) Metody

2.1) Przygotowanie/Disekcja:

  1. Należy pozyskać raka o długości ciała około 6–10 cm (lub o rozmiarze umożliwiającym łatwą manipulację). Raka należy trzymać za tył głowy lub około centymetra za oczami. Należy upewnić się, że szczypce raka lub jego aparat gębowy nie mają możliwości dosięgnięcia osoby wykonującej zabieg. (W celu znieczulenia raka przed odcięciem głowy można go umieścić w kruszonym lodzie na 5 minut).
  2. Używając dużych nożyczek, szybko odetnij głowę. Wykonaj czyste i szybkie cięcie za oczami skorupiaka. Utylizuj głowę oraz odnóża.
    Sekcja raka w celu badania anatomicznego, z uwzględnieniem nacięcia głowopiersia przy użyciu narzędzi sekcyjnych.
    Rysunek 1. Rysunek przedstawia miejsce nacięcia w celu usunięcia głowy raka.
  3. W tym momencie można usunąć odnóża i szczypce raków, aby uniknąć obrażeń. Można również usunąć stylety u samców oraz pleurepodia u obu płci (rycina 2). Następnie oddziel odwłok od tułowia. Wykonaj cięcie wzdłuż błony stawowej łączącej odwłok z tułowiem (rycina 3). Zachowaj część odwłoka raka, a tułów zutylizuj.
    Disekcja okazu skorupiaka do badań anatomicznych z uwzględnieniem morfologii wewnętrznej.
    Rycina 2. Nożyczkami odcina się zgłębiki. Można je następnie usunąć z raka.
    Sekcja, anatomia stawonogów, widok brzuszny, badanie morfologii owadów, badania edukacyjne.
    Rysunek 3. Na obrazie pokazano miejsce nacięcia w celu oddzielenia klatki piersiowej od jamy brzusznej.
    Procedura sekcji; badanie anatomii owadów; sekcja eksperymentalna; badania; biologia edukacyjna.
    Rysunek 4. Oddzielenie klatki piersiowej od odwłoka. Cięcie należy wykonać koliście wzdłuż linii styku segmentów.
    Struktura egzoszkieletu skorupiaków w dłoniach, badanie dotykowe segmentacji i artykulacji.
    Rysunek 5. Górne zdjęcie przedstawia odwłok z przydatkami pływakowymi. Dolne zdjęcie przedstawia odwłok bez przydatków pływakowych.
  4. W obrębie odwłoka należy wykonać nacięcie pancerza wzdłuż dolnej, bocznej krawędzi każdej strony odwłoka. Należy uważać, aby nie przeciąć ciała raka zbyt głęboko. Aby ułatwić proces nacinania pancerza, nacięcie powinno być wykonywane nożyczkami skierowanymi lekko w dół, w stronę strony brzusznej, pod kątem. Należy prowadzić nacięcie wzdłuż naturalnych linii pancerza raka, które biegną wzdłuż każdego segmentu (Rysunek 6).
    Disekcja anatomii owadów; schemat ze strzałkami; badania biologiczne; analiza z bliska.
    Rysunek 6. Nożyczki należy ustawić pod kątem, prowadząc je zgodnie z naturalnym przebiegiem muszli. Należy unikać zbyt głębokich nacięć, aby nie zniszczyć preparatu. Groty strzałek wskazują naturalną linię wzdłuż każdego segmentu, którą należy prowadzić podczas wykonywania nacięć.
  5. Usuń brzuszną część skorupy. Należy uważać, aby nie uszkodzić mięśni brzusznych. Do usunięcia części brzusznej użyj pęsety. Po usunięciu brzusznej części skorupy na mięśniach głębokich zginaczach widoczna jest biała masa tkankowa. Tkankę tę można ostrożnie usunąć pęsetą.
    Proces sekcji z użyciem skalpela, przedstawiający szczegóły tkanki w układzie badania biologicznego.
    Rycina 7. Usunięcie brzusznej części muszli za pomocą pęsety. Należy pociągnąć brzuszną część do góry i do tyłu, aby ją usunąć. Nie należy uszkodzić mięśni znajdujących się pod brzuszną częścią muszli.
    Proces sekcji z obrazowaniem tkanki, studium anatomiczne, edukacyjny schemat biologiczny do analizy.
    Rycina 8. Odciągnięcie brzusznej części skorupy, która ma zostać usunięta.
    Disekcja krewetki; eksperyment biologiczny demonstrujący separację tkanek przy użyciu narzędzi do dyssekcji.
    Rysunek 9. Odciąć nożyczkami część brzuszną preparatu i usunąć ją.
  6. Przewód pokarmowy, niewielka rurka biegnąca wzdłuż linii środkowej głębokich mięśni zginaczy, może zostać usunięty z raka. Przymknąć górną część przewodu pęsetą i odciągnąć go od odwłoka. Przeciąć dół przewodu – na końcu ogona. Przepłukać preparat solą fizjologiczną, aby upewnić się, że resztki kałowe nie zakłócą przygotowania.
    Eksperyment z sekcją błyskawicy, widok z bliska, z uwzględnieniem analizy struktury egzoszkieletu.
    Rysunek 10. Obraz przedstawia usuwanie przewodu pokarmowego z preparatu.
  7. Użyj szpilek sekcyjnych, aby przymocować preparat do szalki Petriego. Górne i dolne narożniki preparatu powinny zostać przypięte do szalki. Do szalki Petriego należy wlać roztwór soli fizjologicznej w ilości całkowicie pokrywającej preparat aż do momentu przeprowadzenia rejestracji wewnątrzkomórkowej.
    Szalka do sekcji powinna posiadać na dnie warstwę Sylgard (Dow Corning) o grubości 1 cm, aby umożliwić wbijanie w nią szpilek entomologicznych.
    Przepłukane preparaty są kąpane w standardowej soli fizjologicznej dla raków, zmodyfikowanej z roztworu Van Harrevelda (1936), przygotowanej z 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl22; 2H2O; 2,45 MgCl22; 6H20; 5 HEPES i dostosowano do pH 7,4 (w mM).

2.2) Rejestracja wewnątrzkomórkowa

Układ do elektrofizjologii w neuronauce z klatką Faradaya, mikroskopem sekcyjnym, wzmacniaczem i elektrodami.
Rycina 1. Ogólny schemat rozmieszczenia sprzętu rejestrującego.

  1. Szalkę Petri z preparatem należy umieścić pod mikroskopem i zabezpieczyć woskiem u podstawy szalki, aby zapobiec jej przemieszczaniu się.
    układ mikroskopii optycznej do analizy komórkowej z elementami źródła światła i regulacji
    Rysunek 12. Umieszczenie preparatu pod mikroskopem. Do zabezpieczenia szalki Petriego i preparatu należy użyć wosku.
  2. Należy przygotować dwa przewody, do których jednego końca przylutowany jest krótki odcinek drutu srebrnego. Drut srebrny należy zanurzyć w niewielkiej ilości wybielacza na około 20 minut, aby uzyskać powłokę Ag-Cl. Przed użyciem drut należy przemyć wodą. Należy przygotować szklaną pipetę wewnątrzkomórkową i ostrożnie napełnić ją od tyłu za pomocą długiej igły przymocowanej do strzykawki z 3M roztworem KCl. Pipetę należy odwrócić (otworem w stronę podłogi) i wypełnić roztworem. Zapewni to wycieknięcie nadmiaru KCl z tyłu elektrody. Należy dopilnować, aby KCl nie spłynął po szklanej pipecie, która będzie zanurzona w kąpieli soli fizjologicznej. Po zakończeniu napełniania roztworem chlorku potasu należy ustawić pipetę pionowo. Następnie w pipecie można umieścić drut srebrny. Drugi koniec drutu należy podłączyć do bieguna +(dodatniego) w przedwzmacniaczu (head stage). Pipetę należy następnie zamocować w uchwycie elektrody. Należy zachować ostrożność, aby nie złamać końcówki elektrody. Trzeci przewód, podłączony do klatki Faradaya, należy wpiąć do zielonego bieguna przedwzmacniacza. Na koniec drut Ag pozostałego przewodu należy umieścić w kąpieli, a drugi jego koniec podłączyć do bieguna -(ujemnego) wskazanego poniżej. Należy również poprowadzić przewód z klatki Faradaya do uziemienia przetwornika AD Powerlab. Przedwzmaczacz należy podłączyć do wejścia „input-probe” w module akwizycji/wzmacniacza (Powerlab).
    Schemat obwodu elektrycznego z symbolami: dodatni, ujemny, uziemienie.
    Rycina 13. Konfiguracja stopnia głowicowego. Przewód podłączony do zielonego wejścia stopnia głowicowego jest uziemiony do wzmacniacza lub klatki Faradaya. Przewód podłączony do czerwonego wejścia jest połączony z przewodem elektrody. Czarne wejście służy do połączenia z roztworem kąpielowym.
    Wzmacniacz różnicowy AC/DC, model 300, konfiguracja do akwizycji sygnałów neuroelektrofizjologicznych.
    Rycina 14. Przełącznik testowy („test toggle”) znajduje się w dolnym rzędzie i służy do sprawdzania rezystancji elektrody. Pokrętło „coarse” (gruba regulacja) znajduje się pod sekcją offsetu DC i powinno zostać przekręcone w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wzmocnienie (gain) ustawiono na 50, co wzmacnia sygnały pięćdziesięciokrotnie. Przewód uziemiający z przedwzmacniacza (head stage) należy włożyć do gniazda oznaczonego jako „GND”.
  3. Należy uruchomić oprogramowanie LabChart na komputerze stacjonarnym lub laptopie. Skonfiguruj wykres tak, aby wyświetlał tylko jeden kanał, klikając „Setup”, a następnie „Channel settings”. W sekcji „Channel settings” zmień liczbę kanałów na jeden. Kliknij „OK”. W lewym górnym rogu wykresu wartość cykli na sekundę powinna wynosić 2K. Ustaw napięcie (oś y) w zakresie od około 20 mV do 50 mV. Kliknij „Channel 1” w prawej części ekranu. Kliknij „Input Amplifier”. Upewnij się, że pole „Differential” jest zaznaczone.

    Wyjście wzmacniacza powinno znajdować się w kanale pierwszym. W ustawieniach wzmacniacza należy zastosować następujące parametry:
    • Filtr górnoprzepustowy – DC
    • Filtr notch – WYŁ.
    • Filtr dolnoprzepustowy – 20 kHz
    • Kompensacja pojemności – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
    • pokrętło precyzyjnego i wstępnego ustawienia offsetu DC – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
    • Przesunięcie DC (+OFF-)- WYŁ.
    • Pokrętło wzmocnienia – 50
    • Wejście (DIFF MONO GND)- DIFF
    • TRYB(STIM-GATE-REC)- REC
    • ΩTEST- WYŁ.
  4. Aby wyznaczyć oporność elektrody, należy podzielić napięcie przez natężenie prądu, które wynosi 2,0 nA (tj. R=V/I, zgodnie z prawem Ohma). Otrzymana wartość stanowi oporność elektrody szklanej. Oporność powinna mieścić się w przedziale od 20 do 60 megaomów. Niższa (<20) i wysokiej oporności (>10) nie są akceptowalne. Po wyznaczeniu oporu można rozpocząć rejestrację wewnątrzkomórkową. Umieść końcówkę elektrody szklanej w kąpieli solnej. Upewnij się, że w kąpieli solnej znajduje się również przewód uziemiający.
    Aby rozpocząć nagrywanie, należy nacisnąć przycisk start w dolnej części ekranu. Upewnij się, że wzmocnienie jest ustawione na 5 V/div. Przed włożeniem elektrody użyj pokrętła course w wzmacniaczu, aby przesunąć linię w programie LabChart do zera. Przełącznik powinien zostać wielokrotnie włączony i wyłączony w celu sprawdzenia rezystancji elektrody. Następnie należy zmierzyć amplitudę uzyskanych wartości. Umieść jeden znacznik na stabilnej linii bazowej, a drugi na szczycie, aby wyznaczyć rezystancję elektrody.
  5. Za pomocą sondy elektrodowej i mikroskopu wprowadź elektrodę do mięśni podłużnych (DEM, DEL1 lub DEL2) preparatu (patrz ryc. 16). Elektrodę należy wprowadzić zaledwie w głąb mięśnia. Nie należy przebijać mięśnia na wylot. Dostosuj ustawienia mikroskopu i sondy, aby zlokalizować mięśnie podłużne i wprowadzić w nie elektrody. Należy wyregulować oświetlacz o wysokim natężeniu tak, aby mięsień był wyraźnie widoczny podczas wprowadzania elektrody. Podczas nakłuwania włókien mięśniowych w tym preparacie często można natrafić na przestrzenie i szczeliny wewnątrz mięśnia. Jest to powód, dla którego potencjał błonowy może pojawiać się, znikać, a następnie pojawiać się ponownie.
    Doświadczenie z sekcji klatki piersiowej owada z użyciem szpilek, skoncentrowane na badaniu anatomii wewnętrznej.
    Rycina 15. Wprowadzenie elektrody do mięśnia.
  6. Aby zmierzyć potencjał błonowy, przed wprowadzeniem elektrody należy użyć pokrętła grubokrokującego wzmacniacza, aby przesunąć linię w programie LabChart do zera. Nakłuć włókno mięśniowe. Następnie zmierzyć amplitudę uzyskanych wartości. Umieścić znacznik na stabilnej linii bazowej i zapisać wartość.
    Różnica między znacznikiem a aktywnym kursorem jest wyświetlana po prawej stronie ekranu. Wartość ta określa napięcie. Zarejestrowane napięcie może wymagać podzielenia przez stopień wzmocnienia ustawiony na wzmacniaczu (np. wzmocnienie 10x lub 100x). Jeśli wartości są raportowane przez oprogramowanie woltach, napięcie należy przeliczyć z woltów na miliwolty (1 V = 10 mV).
  7. Należy ostrożnie użyć mikroskopu i manipulatorów, aby wycofać elektrodę z mięśnia. Następnie należy nakłuć kolejne włókno mięśniowe i odnotować spoczynkowy potencjał błonowy. Powinno się wykonać kilka pomiarów, aby uzyskać wprawę w przeprowadzaniu pomiarów oraz wprowadzaniu elektrody wewnątrzkomórkowej do wybranego włókna mięśniowego.
    Elektroda prawdopodobnie nie pozostanie w jednym włóknie mięśniowym podczas zmiany wszystkich różnych zmodyfikowanych stężeń [K+]+roztworów. Najlepiej jest wycofać elektrodę, zmienić roztwór, a następnie ponownie wprowadzić elektrodę, aby uniknąć uszkodzenia mięśnia. Zaleca się wykonanie 3 pomiarów dla każdego roztworu z osobnych włókien mięśniowych i obliczenie średniej, aby uniknąć błędnych odczytów.
  8. Za pomocą strzykawki należy usunąć i wylać roztwór soli fizjologicznej z czałki Petriego. Czalkę należy wypełnić roztworem soli chlorku potasu o kolejnym wyższym stężeniu, tak aby całkowicie przykryć preparat. Tę samą procedurę należy powtórzyć dla każdego roztworu potasu, a zmiany napięcia/potencjału należy odnotować i zapisać. Seria [K+]na zewnątrz Stosowane przez nas roztwory soli fizjologicznej dla raków to: 5,4, 20, 40, 60, 80, 10 mM.

2.3) Anatomia

Po zakończeniu badań fizjologicznych możemy zbadać powiązaną anatomię włókien mięśniowych oraz wzorzec unerwienia. Przenieś preparat do naczynia do barwienia i dodaj błękit metylenowy (1 gram błękitu metylenowego zmieszanego ze 100 mL soli fizjologicznej dla raków). Pozostaw preparat w soli fizjologicznej na 5 minut, a następnie wyjmij go i dodaj świeżą sól fizjologiczną dla raków bez barwnika. Anatomia tych mięśni była szczegółowo opisywana na przestrzeni lat (Huxley, 180; Pilgrim i Wiersma, 1963). Dopiero niedawno niektóre z tych mięśni zostały opisane anatomicznie, fizjologicznie i biochemicznie (Cooper et al., 198; Griffis et al., 20; Sohn et al., 20).

Ogólny układ anatomiczny mięśni przedstawiono na rysunku 16 (do tego celu wykorzystano prawą stronę rysunku). Należy zlokalizować główny nerw, który unerwia przede wszystkim mięśnie w obrębie jednego segmentu. Narysuj schemat unerwienia mięśni SEM, DEL2, DEL1 oraz DEM w segmencie. Brzuch musi zostać w pełni rozciągnięty poprzez mocne przypięcie preparatu do naczynia. Następnie należy usunąć roztwór soli fizjologicznej i dodać roztwór utrwalający. Roztworem utrwalającym jest płyn Bouina (przygotowany z nasyconego kwasu pikrykowego, formaldehydu i kwasu octowego; Sigma-Aldrich Co.).

OSTRZEŻENIE. Należy unikać kontaktu tego roztworu ze skórą i oczami. Aby uniknąć wdychania oparów roztworu, należy pracować pod wyciągiem (dygestorium). W przypadku uczucia pieczenia oczu należy je niezwłocznie przemyć na stacji do płukania oczu.

Pozostaw preparat w roztworze Bouina przez około 10 minut, a następnie za pomocą pipety wymień roztwór na sól fizjologiczną. Wytnij cienki fragment mięśnia DEL1 lub DEL2 i umieść go na szkiełku przedmiotowym. Oznacz szkiełko. Powtórz procedurę dla mięśnia SEM. Obserwuj wzór prążkowania sarkomerów w obu preparatach tkankowych. Można użyć mikroskopu złożonego, odpowiednio dobierając obiektywy, aby zobaczyć wzory prążkowania. Jeśli to możliwe, wykonaj zdjęcie cyfrowe przez okular mikroskopu (uwaga: niektóre aparaty w telefonach komórkowych dobrze sprawdzają się w tej procedurze).

Schemat anatomiczny bezkręgowca; organizacja segmentarna, struktura mięśniowa i szczegółowe opisy.
Rysunek 16. Schematyczny rysunek grzbietnej części odwłoka raka widzianej od strony brzusznej, przedstawiający muskulaturę prostowników każdego segmentu. Grzbietowy mięsień błony odwłoka (DMA) oraz powierzchowna głowa pomocnicza mięśnia prostownika (SEAcc) występują w segmentach od 1 do 5 odwłoka, przy czym w każdym segmencie mają inną orientację. Z wyjątkiem segmentu 1, mięśnie te są przyczepione swoim końcem przednim do zwapniałego tergytu, a końcem tylnym do błony stawowej. W segmencie 1 homologiczne mięśnie mają swoje przednie miejsca przyczepu w błonie stawowej znajdującej się pomiędzy klatką piersiową a odwłokiem. Ilustracja została opracowana na podstawie montaży fotograficznych preparatów barwionych błękitem metylenowym. Po lewej stronie rysunku usunięto wszystkie głębokie mięśnie prostowniki, aby ukazać powierzchowne grzbietowe mięśnie prostowniki. Skala = 2,35 mm. (Źródło: Sohn) i inni 2000).

3. Wyniki

Poniższe pytania i przetwarzanie danych ilustrują główne zasady i cele niniejszej procedury laboratoryjnej.

  1. Nanieś na wykres pomiary uzyskane dla potencjałów spoczynkowych błony dla każdego [K+ ]+]na zewnątrz użyto. Należy sprawdzić, czy linie obserwowana i hipotetyczna są zgodne pod względem nachylenia. Do wykreślenia wartości należy użyć wykresu półlogarytmicznego, w którym oś X reprezentuje zmienione stężenie [K+]na zewnątrz jako logarytm, a oś y jako potencjały błonowe (jak pokazano poniżej; Rysunek 17). (W razie potrzeby pobierz bezpłatny papier milimetrowy) http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/)
    Papier milimetrowy z logarytmiczną skalą poziomą; stosowany do nanoszenia i analizy danych.
    Rysunek 17. Papier milimetrowy
    Użyj średniego potencjału spoczynkowego błony otrzymanego przy stężeniu 5,4 mM [K]+wykreślone w celu zainicjowania linii hipotetycznych i obserwowanych do porównania.
    Jeśli linie nie są zgodne, należy omówić możliwe przyczyny tego stanu rzeczy.
  2. Jeśli zmieniono zewnętrzne stężenie Na++ jonów, czy spodziewałbyś się takiego samego rodzaju zmian, jakie zaobserwowano przy zmianie K+ stężenie?
  3. W jakim stopniu błękit metylenowy barwił mięśnie w porównaniu do nerwów? Z czego mogą wynikać te różnice? Czy błękit metylenowy jest obecnie stosowany do identyfikacji tkanek lub jako kontrast w żywych komórkach ludzkich? Jaka zależność zachodzi między Zygmundem Freudem a barwnikami stosowanymi u raków?
  4. Zwróć uwagę na wszelkie różnice w układzie sarkomerów między mięśniami DEL i SEM. Jeśli występują, co może być ich przyczyną? Czy wszystkie mięśnie mają taką samą odległość między sarkomerami w stanie spoczynku? Narysuj obserwowany pod mikroskopem układ prążkowania mięśniowej i opisz na rysunku jak najwięcej elementów (w odniesieniu do znanej anatomii sarkomerów mięśniowych).

4. Pomiar odpowiedzi synaptycznych

1) WSTĘP

Preparat mięśnia prostownika brzucha, wykorzystywany do demonstracji spoczynkowego potencjału błonowego, jest również idealny do wykazania indukcji odpowiedzi synaptycznych w złączach neuromięśniowych (NMJs) różnych mięśni. Niektóre mięśnie skorupiaków są selektywnie unerwione przez neurony ruchowe fazowe lub toniczne, choć niektóre pojedyncze włókna mogą być unerwione przez oba rodzaje pobudzających neuronów ruchowych, jak ma to miejsce w przypadku mięśnia prostownika w odnóżach krocznych raków (Atwood, 208; patrz JOVE produkcja id#2319-Wu i Cooper, 2010) oraz większości innych mięśni kończyn (Wiersma, 1961a). Poprzez selektywną stymulację neuronów ruchowych fazowych i tonicznych można zmierzyć fizjologiczne różnice w potencjałach postsynaptycznych pobudzających (EPSPs). Neurony ruchowe fazowe wywołują szybkie drżenie włókien mięśniowych i generują EPSPs rzędu 10-40 mV. Odpowiedź fazowa może ulegać szybkiemu wyhamowaniu przy seriach stymulacji o częstotliwości 5-10 Hz. Neurony ruchowe toniczne wywołują mniejsze EPSPs, które mogą ulegać facylitacji przy wyższej częstotliwości stymulacji (10-50 Hz). Pod względem strukturalnym przedsynaptyczne terminale fazowe i toniczne w NMJs różnią się od siebie (Atwood i Cooper, 196; Bradacs et al., 197; Cooper et al., 198).

Zaskakującym jest fakt, że fenotyp fazowych odpowiedzi fizjologicznych może ulec przekształceniu w stan przypominający toniczny poprzez elektryczne warunkowanie neuronów fazowych przez kilka godzin dziennie w ciągu 7 dni (Cooper et al., 198; Mercier and Atwood, 1989). Ponadto wrażliwość przekształconych NMJ na neuromodulację jest doskonałym narzędziem do badania regulacji ekspresji receptorów (Griffis et al., 20).

W tym stosunkowo odpornym preparacie (mięśnie brzuszne raka), zarówno odpowiedzi toniczne, jak i fazowe są łatwo rejestrowane i badane pod kątem ułatwienia i/lub depresji odpowiedzi synaptycznych przy zastosowaniu różnych paradygmatów stymulacji. Dzięki tym preparatom studenci będą mogli rozpoznać ogólne cechy fazowych i tonicznych odpowiedzi synaptycznych poprzez stymulowanie wiązki nerwowej.

Kolejny zaprezentowany preparat NMJ służy do monitorowania wewnętrznej aktywności ruchowej oraz aktywności ruchowej indukowanej bodźcem sensorycznym z OUN. Jest to powierzchowny mięsień zginacz znajdujący się na brzusznej stronie odwłoka raka. Preparat ten będzie również wykorzystywany do monitorowania obwodu sensorycznego-OUN-ruchowego-mięśniowego oraz efektów działania neuromodulatorów (Strawn et al., 200).

W każdym segmencie odwłosa (z wyjątkiem ostatniego) znajdują się trzy funkcjonalne grupy mięśni: (1) mięśnie kontrolujące ruch pleopodów (nóg pływakowych), (2) trzy mięśnie prostowniki oraz (3) trzy mięśnie zginacze. Zginacze i prostowniki stanowią przeciwstawne grupy mięśni, które powodują zgięcie lub wyprost odwłosa poprzez rotację w stawach międzysegmentalnych. Mięśnie fazowe zajmują większość objętości odwłosa, natomiast mięśnie toniczne tworzą cienkie pasma włókien rozciągające się po stronie grzbietowej (prostowniki) i brzusznej (zginacze) każdego segmentu odwłosa.

U raków toniczne mięśnie zginacze brzuszne są unerwione w każdej połowie segmentu przez pięć motoneuronów oraz przez obwodowy neuron hamujący. Pobudzeniowe motoneurony wykorzystują glutaminian jako neuroprzekaźnik. Glutaminian depolaryzuje włókna mięśniowe, powodując wzrost przepuszczalności przede wszystkim dla jonów sodu. Neurony hamujące uwalniają kwas gamma-aminomaślanowy (GABA), który zazwyczaj hiperpolaryzuje włókna mięśniowe poprzez zwiększenie przepuszczalności dla jonów chlorkowych. W niektórych mięśniach skorupiaków (głównie w kończynach) obwodowe neurony hamujące tworzą kontakty synaptyczne zarówno z zakończeniami neuronów ruchowych, jak i z włóknami mięśniowymi, redukując ilość neuroprzekaźnika uwalnianego przez neuron ruchowy (hamowanie presynaptyczne) (Dudel and Kuffler, 1961). Zjawisko to nie występuje w tonicznych mięśniach zginaczach raków.

Brzuszny sznur nerwowy raka jest strukturą symetryczną dwustronnie, biegnącą przez całą długość ciała zwierzęcia. W każdym segmencie ciała znajduje się jeden zwoj. W odwłoku (6 segmentów) każdy zwoj zawiera kilkaset neuronów, a każdy z dwóch łączników składa się z kilku tysięcy aksonów. Ciała komórek nerwowych tworzą warstwę o grubości kilku ciał komórkowych na brzusznej powierzchni każdego zwoju. Bezpośrednio nad warstwą ciał komórkowych znajduje się drobna sieć wypustek neuronalnych, czyli neuropil. To tutaj zachodzą wszystkie interakcje synaptyczne; ciała komórkowe są pozbawione synaps.

Każdy zwoj brzuszny (z wyjątkiem ostatniego) posiada trzy korzenie po każdej stronie. Pierwszy korzeń zawiera aksony neuronów unerwiających mięśnie pleopodów oraz aksony sensoryczne; drugi korzeń zawiera aksony unerwiające fazową i toniczną muskulaturę prostowników oraz aksony sensoryczne; natomiast trzeci korzeń, który odchodzi od sznura nerwowego kilka milimetrów za zwojem w kierunku ogona, zawiera aksony unerwiające fazową i toniczną muskulaturę zginaczy. Trzeci korzeń dzieli się na dwie gałęzie. Gałąź głęboka (IIIa) unerwia wyłącznie fazowe mięśnie zginaczy. Gałąź powierzchowna trzeciego korzenia (IIIb) w każdej połowie segmentu zawiera sześć aksonów, które unerwiają toniczne mięśnie zginaczy.

Neurony unerwiające mięsień toniczny zginacz są spontanicznie aktywne, w przeciwieństwie do fazowych neuronów efferentnych, a w dobrze przygotowanym preparacie będą one nadal generować impulsy przez wiele godzin po usunięciu jamy brzusznej zwierzęcia. Przegląd historyczny odkryć dokonanych w tych preparatach brzusznych znajduje się w pracy Atwood (208). Ciała komórkowe czterech neuronów ruchowych oraz obwodowego neuronu hamującego unerwiającego mięsień toniczny zginacz w dowolnej połowie segmentu znajdują się w zwoju tego segmentu. Ciało komórkowe pozostałego neuronu ruchowego znajduje się w kolejnym zwoju położonym bardziej kądałowo. Neurony te można wiarygodnie odróżnić od siebie na podstawie amplitudy potencjałów działaniu rejestrowanych zewnątrzkomórkowo. Jeśli mięsień toniczny zginacz z jednej połowy segmentu zostanie usunięty wraz z dwoma zwojami zawierającymi neurony unerwiające ten mięsień, pięć neuronów zazwyczaj wykazuje pewien stopień aktywności spontanicznej. Neurony te są numerowane w kolejności rosnącej na podstawie względnej amplitudy zewnątrzkomórkowego potencjału działania. f1 do f4 to motoneurony, a f5, największy spontanicznie aktywny neuron, to obwodowy inhibitor zginacza. f6, największy neuron ruchowy, jest pobudzającym neuronem ruchowym, który rzadko wykazuje aktywność spontaniczną.

Spontaniczny charakter tonicznej aktywności neuronów ruchowych może być modulowany poprzez egzogenną aplikację związków lub poprzez dostarczenie bodźca sensorycznego do kutykuli w tym samym segmencie, w którym monitorowana jest aktywność nerwu ruchowego.

2) Disekcja

Aby otrzymać preparat prostownika brzusznego, należy zastosować tę samą procedurę, która została opisana powyżej w kontekście badania spoczynkowych potencjałów błonowych w zależności od stężenia potasu pozakomórkowego. Różnica polega na odpowiednim zabezpieczeniu pęczka nerwów segmentowych biegnącego wzdłuż boku karapaksa. Nerw ten zostanie wciągnięty do elektrody ssącej, która posłuży jako elektroda stymulująca. Stymulację należy prowadzić z częstotliwością 1 Hz w celu monitorowania odpowiedzi fazowych. W celu monitorowania odpowiedzi tonicznych należy stymulować krótkimi seriami impulsów o częstotliwości 10 Hz, podając od 10 do 20 bodźców.

Procedury eksperymentalne dotyczące badań nad mięśniami zginaczami tonicznymi raka różnią się od pozostałych i wymagają zachowania nienaruszonego brzusznego sznura nerwowego. Przygotowuje się preparat składający się z kilku segmentów brzusznych. Otrzymuje się go w następujący sposób:

  1. Należy pozyskać raka o długości ciała około 6–10 cm (lub o rozmiarze umożliwiającym pracę). Raka należy chwycić za tył głowy, mniej więcej 2 lub 3 centymetry za oczami. Podczas manipulacji należy upewnić się, że szczypce lub aparat gębowy raka nie mają możliwości dosięgnięcia eksperymentatora. Po usunięciu głowy oraz odnóży należy je zutylizować.
  2. Używając nożyczek, szybko usuń głowę. Wykonaj czyste i szybkie cięcie za oczami raka.
    Disekcja okazu raka, demonstrująca metodę badania anatomicznego.
    Rysunek 18. Rysunek przedstawia miejsce nacięcia w celu usunięcia głowotułowia rakowania.
    Na tym etapie można usunąć odnóża i szczypce raków, aby uniknąć obrażeń. Można również usunąć stylety u samców oraz pławiki u obu płci (rycina 19 i 20). Następnie oddziel odwłok od tułowia. Wykonaj nacięcie wzdłuż błony stawowej łączącej odwłok z tułowiem (rycina 20).
  3. Zachowaj odnawcze końcowe (brzuch) raka, a klatkę piersiową usuń.
    Proces sekcji skorupiaka, dłonie sekcjonują okaz przypominający homara w celu badania anatomicznego.
    Rycina 19. Rysunek przedstawia rozmieszczenie stiletów, które można usunąć z raka.
    Sekcja, badanie anatomiczne, skorupiak, cięcie grzbietowe, eksperyment biologiczny, badania edukacyjne.
    Rycina 20. Rycina przedstawia miejsce nacięcia w celu oddzielenia klatki piersiowej od jamy brzusznej.
    Proces sekcji owada zorientowany na badanie anatomii z wykorzystaniem narzędzi do sekcji manualnej.
    Rysunek 21. Oddzielenie klatki piersiowej od odwłoka. Cięcie należy wykonać okrężnie wzdłuż linii styku segmentów.
    Anatomia wyrostka raka modliszkowego przedstawiająca strukturę mięśniową, badanie z zakresu biologii morskiej i zoologii.
    Rysunek 2. Górny obraz przedstawia odwłok z wyrostkami. Dolny obraz przedstawia usunięcie wyrostków odwłoka.
  4. Umieść wyizolowany preparat ogona w roztworze soli fizjologicznej w dużej płytce Petriego. Przytwierdź ogon oraz górną część preparatu do płytki za pomocą szpilek. Upewnij się, że preparat jest stabilnie zamocowany. Za pomocą skalpela wycięcie kwadratowy fragment strony brzusznej preparatu pomiędzy żebrami.
    Przygotowanie do sekcji owada; przypięty okaz w szalce Petriego z narzędziem sekcyjnym do badań anatomicznych.
    Rysunek 23. Pokazuje miejsce, w którym należy wykonać cięcie, aby usunąć brzuszną część preparatu.
  5. Należy wykonać niewielkie nacięcie (można to zrobić również nożyczkami). Należy wyciąć i unieść płatek tkanki. Następnie płatek można usunąć za pomocą nożyczek, odsłaniając głębokie mięśnie zginacze. Podczas tego procesu należy używać mikroskopu, aby zapewnić precyzję podczas usuwania brzusznej części preparatu.
    Proces sekcji owada, zbliżenie eksperymentu w szalce Petriego z użyciem pęsety, badania entomologiczne.
    Rycina 24. Przygotowanie poprzez cięcie nożyczkami w celu odsłonięcia mięśni.
    Proces sekcji przedstawiający separację tkanek za pomocą narzędzi, zbliżenie, eksperymentalne badanie biomedyczne.
    Rycina 25. Górne zdjęcie przedstawia chwycenie płata pęsetą. Dolne zdjęcie przedstawia usuwanie płata z preparatu przy użyciu mikroskopu.
    Obraz mikroskopowy struktury skrzeli ryb; wykorzystywany w badaniach nad układem oddechowym i absorpcją tlenu.
    Rycina 26. Odsłonięcie powierzchownych mięśni zginaczy.

3) Rejestracja wewnątrzkomórkowa:

Układ elektrofizjologiczny z klatką Faradaya, mikroskopem i wzmacniaczem do eksperymentu z rejestracją aktywności neuronalnej.
Rysunek 27. Ogólny schemat konfiguracji sprzętu rejestrującego.

  1. Szalkę Petri z preparatem należy umieścić pod mikroskopem i zabezpieczyć woskiem w dolnej części szalki, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki.
    Równowaga statyczna, konfiguracja spektrometru, pomiar wzbudzenia optycznego, eksperyment spektroskopowy.
    Rycina 28. Przedstawiono rozmieszczenie preparatu pod mikroskopem. Należy użyć wosku do zabezpieczenia szalki Petriego i preparatu.
  2. Należy przygotować dwa przewody z krótkimi odcinkami drutu srebrnego przymocowanymi do jednego z końców. Drut srebrny należy zanurzyć w niewielkiej ilości wybielacza na około 20 minut w celu uzyskania powłoki Ag-Cl. Przed użyciem drut należy opłukać wodą. Należy przygotować szklaną pipetę wewnątrzkomórkową i ostrożnie napełnić ją roztworem KCl (3 M). Pipetę należy odwrócić (otworem w stronę podłoża) i napełnić roztworem. Zapewni to odpłynięcie nadmiaru KCl z tylnej części elektrody. Należy dopilnować, aby roztwór KCl nie spływał po szklanej pipecie, która zostanie umieszczona w kąpieli solnej. Po zakończeniu napełniania roztworem chlorku potasu należy ustawić pipetę pionowo. Następnie do pipety można wprowadzić drut srebrny. Drugi koniec drutu należy podłączyć do bieguna +(dodatniego) wzmacniacza wejściowego (head stage). Pipetę należy następnie zamocować na sondzie elektrody. Należy uważać, aby nie złamać pipety elektrody. Trzeci przewód, przymocowany do klatki Faradaya, należy wpiąć do zielonego bieguna wzmacniacza wejściowego. Na koniec drut srebrny pozostałego przewodu należy umieścić w kąpieli, a drugi jego koniec podłączyć do bieguna -(ujemnego) przedstawionego poniżej. Należy również poprowadzić przewód z klatki Faradaya do uziemienia przetwornika AD Powerlab. Wzmacniacz wejściowy zostaje podłączony do wejścia „input-probe” w systemie akwizycji/wzmacniaczu (Powerlab).
    Schemat równowagi statycznej; metoda ΣFx=0, ΣFy=0; ilustruje równoważenie sił w układzie.
    Rysunek 29. Konfiguracja głowicy. Przewód podłączony do zielonej części głowicy jest uziemiony do wzmacniacza lub klatki Faradaya. Przewód podłączony do części czerwonej jest połączony z przewodem elektrody. Część czarna służy do połączenia z roztworem kąpielowym.
    Konfiguracja wzmacniacza różnicowego AC/DC do przetwarzania sygnałów; kluczowe ustawienia dla regulacji wzmocnienia i filtrów.
    Rysunek 30. Przełącznik testowy („test toggle”) znajduje się w dolnym rzędzie i służy do sprawdzania rezystancji elektrod. Pokrętło „coarse” (gruba regulacja) znajduje się pod sekcją offsetu DC i należy je przekręcić w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wzmocnienie (gain) ustawiono na 50, co oznacza pięćdziesięciokrotne wzmocnienie sygnałów. Przewód uziemiający z przedwzmacniacza (head stage) należy umieścić w gnieździe „GND”.
  3. Należy uruchomić oprogramowanie LabChart na komputerze stacjonarnym lub laptopie. Skonfiguruj wykres tak, aby wyświetlał tylko jeden kanał, klikając „Setup”, a następnie „Channel settings”. W sekcji „Channel settings” zmień liczbę kanałów na jeden. Kliknij „OK”. W lewym górnym rogu wykresu liczba cykli na sekundę powinna wynosić 2K. Ustaw napięcie (oś Y) w zakresie od około 20 mV do 50 mV. Kliknij „Channel 1” w prawej części ekranu. Kliknij „Input Amplifier”. Upewnij się, że pole „Differential” jest zaznaczone.

    Wyjście wzmacniacza powinno znajdować się w kanale pierwszym. W ustawieniach wzmacniacza należy zastosować następujące parametry:
    • Wysokoprzepustowy- DC
    • Filtr notch – WYŁ.
    • Filtr dolnoprzepustowy – 20 kHz
    • Kompensacja pojemności – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
    • Pokrętło precyzyjnej i grubej regulacji przesunięcia DC – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
    • Przesunięcie DC (+OFF-)- WYŁĄCZONE
    • Pokręto wzmocnienia (gain) – 50
    • Wejście (DIFF MONO GND)- DIFF
    • TRYB(STIM-GATE-REC)- REC
    • ΩTEST- WYŁĄCZONY
  4. Aby zmierzyć oporność elektrody, należy podzielić napięcie przez natężenie prądu, które wynosi 2,0 nA. Otrzymana wartość stanowi oporność elektrody szklanej. Oporność powinna wynosić od 20 do 60 megaomów. Po wyznaczeniu oporności można rozpocząć rejestrację wewnątrzkomórkową. Umieść końcówkę elektrody szklanej w kąpieli z roztworem soli fizjologicznej. Upewnij się, że w kąpieli znajduje się również przewód uziemiający.
    Aby rozpocząć nagrywanie, należy nacisnąć przycisk „start” w dolnej części ekranu. Upewnij się, że wzmocnienie jest ustawione na 5 V/div. Przed włożeniem elektrody użyj pokrętła regulacji grubej (course knob) w wzmacniaczu, aby przesunąć linię w programie LabChart do zera. Przełącznik powinien zostać kilkakrotnie włączony i wyłączony w celu sprawdzenia rezystancji elektrody. Następnie należy zmierzyć amplitudę uzyskanych wartości. Umieść pierwszy znacznik na stabilnej linii bazowej, a drugi na szczycie, aby wyznaczyć rezystancję elektrody.
  5. Używając sondy elektrodowej i mikroskopu, wprowadź elektrodę do mięśnia. Nie przebijaj mięśnia na wylot. Dostosuj ustawienia mikroskopu i sondy, aby zlokalizować cienką warstwę włókien mięśniowych i wprowadzić elektrody do wnętrza włókien. Podczas penetracji mięśnia w celu doświetlenia można użyć iluminatora o wysokim natężeniu światła.
    Pipeta w szalce Petriego; przygotowanie eksperymentu do analizy chemicznej lub obserwacji reakcji.
    Rycina 31. Wprowadzenie elektrody do mięśnia.
  6. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia korzeni nerwowych mięśni powierzchownych.
    Zaleca się, aby podczas przeprowadzania procedur eksperymentalnych roztwór soli fizjologicznej, w której zanurzone są preparaty, pozostawał chłodny (10–15 stopni Celsjusza) i dobrze natleniony. W przypadku braku urządzeń chłodzących należy regularnie wymieniać roztwór soli fizjologicznej na świeży i schłodzony. Przez roztwór soli fizjologicznej należy przepuszczać gazowy tlen lub przynajmniej powietrze.
  7. Zarejestruj aktywność spontaniczną EPSP. Zwróć uwagę na różnice w wielkości EPSP oraz na obecność IPSP.
  8. Bardzo ostrożnie, za pomocą małego pędzelka, pobudź ręcznie krawędź kutykuli w tym samym segmencie, w którym monitorowana jest aktywność spontaniczna. Odnotuj zmianę częstotliwości odpowiedzi oraz sprawdź, czy pojawiają się EPSP o innej wielkości, których nie obserwowano przed stymulacją kutykuli.
    Schemat anatomii serca; system przewodzący serca, podpisane korzenie; proces badania anatomicznego.
    Rysunek 32. Przygotowanie za pomocą szczotki stymulującej i korzeni nerwowych (zmodyfikowane według Strawna) i wsp., 2000)
  9. Stymulację można powtórzyć po ostrożnej wymianie kąpieli solnej na taką, która zawiera neuromodulator, np. serotoninę (1 μM), lub sól fizjologiczną napowietrzoną CO2.2Należy zwrócić uwagę na wpływ na profil aktywności dla danego bodźca. Należy również odnotować, czy wymiana soli fizjologicznej na świeżą przywraca aktywność do stanu początkowego.
  10. Następnie aktywność neuronalną w obrębie obwodu sensorycznego-OUN-neuronów ruchowych można monitorować na różne sposoby. Do monitorowania aktywności neuronów ruchowych można zastosować elektrodę ssącą zamiast elektrody wewnątrzkomórkowej (Rysunek 33). Na końcówce szklanej elektrody ssącej umieszcza się plastikową rurkę z otworem o odpowiedniej wielkości, umożliwiającym wciągnięcie nerwu do wnętrza końcówki. Otwór nie może być zbyt duży, ponieważ nerw mógłby wypaść, ani zbyt mały, gdyż nerw mógłby zostać uszkodzony przez nacisk elektrody. Plastikową rurkę ogrzewa się nad płomieniem i przycina do wymaganego rozmiaru.
    Układ elektrofizjologiczny z klatką Faradaya, wzmacniaczem, mikroskopem i mikromanipulatorem do badania neuronów.
    Rysunek 3. Przygotowanie układu do rejestracji z wykorzystaniem elektrod ssących.
    Ustaw mikromanipulator w pozycji, która zapewni elektrodzie ssącej łatwy dostęp do kąpieli solnej. Zassyj roztwór soli fizjologicznej, aż znajdzie się on w kontakcie z drutem srebrnym wewnątrz elektrody ssącej. Ułóż drugi drut po stronie przeciętej elektrody ssącej blisko jej końcówki, tak aby oba druty miały kontakt z kąpielą solną.
    W przypadku monitorowania elektrycznego należy podłączyć różnicowy wzmacniacz AC/DC (wzmacniacz) do PowerLab 26T. W tym celu należy połączyć odpowiednim przewodem wejście nr 1 (Input 1) w PowerLab 26T z wyjściem wzmacniacza.
    • Sterowniki urządzenia wzmacniacza powinny zostać ustawione według następujących parametrów:
      • Filtr górnoprzepustowy – DC
      • Filtr notch – WYŁ.
      • Filtr dolnoprzepustowy – 20 kHz
      • Kompensacja pojemności – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
      • Pokrętło precyzyjnej i grubej regulacji offsetu DC – przeciwnie do ruchu wskazówek zegara
      • Przesunięcie DC (+OFF-)- WYŁĄCZONE
      • Pokręto wzmocnienia – 50
      • Wejście (DIFF MONO GND)- DIFF
      • TRYB(STYM-BRAMKA-REG)- REG
      • ΩTEST- WYŁĄCZONY
    Podłącz głowicę do wejścia „input-probe” wzmacniacza.
    Podłącz przewody elektryczne z elektrody ssącej do wzmacniacza przedwzmacniającego (head stage). Przewody należy podłączyć w następujący sposób: czerwony (dodatni) w lewym górnym rogu, zielony (masa) w środku, czarny (ujemny) na dole. Jest to przedstawione na Ryc. 34. Przewód masy można po prostu umieścić w kąpieli solnej.
    Schemat budowy komórki; przedstawiono jądro oraz symbole ładunku dodatniego i ujemnego.
    Rysunek 34. Konfiguracja głowicy
  11. Teraz podłącz kabel USB z urządzenia PowerLab 26T do laptopa. Przed uruchomieniem programu LabChart7 na komputerze upewnij się, że zarówno wzmacniacz, jak i PowerLab 26T są podłączone do zasilania i włączone.
  12. Otwórz program LabChart7.
    • Pojawi się okno Welcome Center programu LabChart. Zamknij je.
    • Kliknij Konfiguracja
    • Kliknij ustawienia kanałów. Zmień liczbę kanałów na 1 (lewy dolny róg okna), a następnie zatwierdź przyciskiem OK.
    • W lewym górnym rogu wykresu ustaw liczbę cykli na sekundę na około 2k. Ustaw napięcie (oś y) na około 50 mV lub 20 mV.
    • Kliknij Kanał 1 po prawej stronie wykresu. Kliknij Wzmacniacz wejściowy. Upewnij się, że zaznaczone są następujące ustawienia: jednokoncowe (single-ended), sprzężenie AC (ac coupled), inwersja (invert – odwraca sygnał w razie potrzeby) oraz filtr antyaliasingowy (anti-alias).
    • Aby rozpocząć nagrywanie, naciśnij start.
    Możemy rejestrować sygnały z odgałęzienia 3rd nerw unerwiający mięsień zginacz powierzchowny (gałąź IIIb), aby monitorować wielkość potencjałów czynnościowych za pomocą rejestracji pozakomórkowej. Pozakomórkowe impulsy nerwowe określa się mianem „spikes”. Należy pamiętać, że w tym korzeniu znajduje się pięć pobudzających neuronów ruchowych oraz jeden hamujący neuron ruchowy (Kennedy i Takeda, 1965; Velez i Wyman, 1978). Można zastosować stymulację kutykuli pędzlem lub podanie neuromodulatorów (Rycina 35). Pędzla można używać ręcznie lub, w celu zapewnienia spójnej stymulacji, zamontować go na mikromanipulatorze, aby kontrolować siłę nacisku i zakres ruchu.
    Wykres aktywności neuronalnej, sól fizjologiczna vs 5-HT, efekt szczotkowania, porównanie badawcze.
    Rysunek 35. Aktywność 3B&R korzeń przed i podczas stymulacji kutykularnej w soli fizjologicznej (góra) oraz w 10 nM 5-HT (dół). Czas trwania stymulacji kutykularnej zaznaczono paskiem. Zwróć uwagę na zwiększoną aktywność przed i po stymulacji, gdy preparat jest kąpany w 5-HT (zmodyfikowano na podstawie Strawna) i wsp., 2000).
    Możemy rejestrować sygnał z 1st lub 2nd korzenie, wykonując rejestrację nerwu metodą en passant; możemy również przeciąć korzeń w miejscu oddalenia od VNC i rejestrować czyste sygnały wejściowe sensoryczne pochodzące z peryferii, które przesyłałyby sygnały do VNC. W ten sposób aktywność sensoryczną rejestrowano by z przeciętego korzenia prowadzącego do peryferii.
    2nd korzeń zawiera bardzo duże pierwotne aksony doprowadzające z narządów receptorowych mięśni (MRO) oraz mniejsze aksony odprowadzające do neuronów ruchowych prostowników (Fields and Kennedy, 1965). W obrębie 1 znajduje się wiele aksonów sensorycznychst oraz 2nd korzenie
    Neurony mechanosensoryczne posiadają bezpośrednie połączenia, poprzez synapsy elektryczne, z bocznymi aksonami olbrzymimi (LG) (Krasne 1969; Zucker 1972). Znane jest również to, że neurony mechanosensoryczne pobudzają interneurony za pośrednictwem synaps chemicznych.
    Aby zbadać, w jaki sposób bodźce sensoryczne mogą wpływać na aktywność neuronów ruchowych poprzez obwód sensoryczny-OUN-neuron ruchowy, można rejestrować odpowiedzi synaptyczne w mięśniu. Analizie mogą zostać poddane różne aspekty wykorzystanego obwodu. Można na przykład rejestrować sygnały wyłącznie z korzenia nerwu sensorycznego lub z korzenia ruchowego, z zachowaniem lub bez zachowania nienaruszonego dopływu bodźców sensorycznych do VNC. W celu analizy zapisów częstotliwości impulsów można przeprowadzić zliczenia w określonym przedziale czasowym w różnych warunkach. Pomiary można wykonać przed stymulacją szczoteczką oraz w trakcie stymulacji szczoteczką przez określony czas (Rycina 35). Warunki te można powtórzyć 5 razy, a następnie obliczyć średnią procentową zmianę częstotliwości jako miarę służącą do wyciągnięcia porównań.
    Można również zastosować związki egzogenne, takie jak serotonina (Strawn i wsp., 200) lub acetylocholina (Ach), nikotyna lub glutaminian. Opisano różne działania behawioralne nikotyny u bezkręgowców. Sugerowałoby to obecność receptorów nikotynowych (Tsunoyama i Gojobori, 198). Glutaminian jest głównym pobudzającym neurotransmiterem u większości bezkręgowców w obrębie połączeń neuromięśniowych (NMJ), natomiast Ach jest głównym pobudzającym neurotransmiterem w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (CNS) (Monoghan i in., 1989; Watkins, i wsp., 1990).
    Można wypróbować heptanol lub CO2 napowietrzoną solą fizjologiczną, ponieważ spowoduje ona rozłączenie połączeń szczelinowych (septate junctions) u raka w obrębie obwodu, co wykazała dr Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) w swojej rozprawie doktorskiej. Działanie to może wyjaśniać zmianę zachowania całego organizmu po wystawieniu na wysokie stężenie CO22 w środowisku (Bierbower i Cooper, 2010). Podczas stymulacji kutykuli pędzlem w celu wywołania bodźca sensorycznego i rejestracji odpowiedzi w neuronach ruchowych należy odnotować, czy występuje różnica w aktywności przed i w trakcie podania heptanolu lub CO2 ekspozycji. Może to sugerować, a może nie, że połączenia szczelinowe odgrywają rolę w obwodzie neuronów sensorycznych-OUN-motorycznych.

Dyskusja

Potencjał błonowy

Już w 1902 roku Bernstein zajmował się kwestiami potencjału spoczynkowego w aksonie kałamarnicy. Fascynujące jest rozważenie, jak te wczesne koncepcje i obserwacje Bernsteina (1902) oraz Nernsta (1888) wpłynęły później na badania w dziedzinie fizjologii błon. (Patrz przegląd Malmivuo i Plonsey, 1995; dostępny również pod adresem www http://www.bem.fi/book/). Do dziś dokonuje się przełomowych odkryć dotyczących funkcji kanałów jonowych i właściwości błon biologicznych, które mają ogromne znaczenie dla zrozumienia fizjologii komórkowej powiązanej z funkcjonowaniem tkanek, narządów i układów.

Porównanie eksperymentalnych i teoretycznych efektów wpływu zewnętrznego [K+] na spoczynkowy potencjał błonowy wskazuje na wpływ jonów na potencjał błonowy. W celu odpowiedzi na fundamentalne pytania fizjologiczne należy przeprowadzić dodatkowe eksperymenty z wykorzystaniem tego samego preparatu. Niektóre z nich zostały wskazane już w 1968 roku przez Atwooda i Parnasa i wciąż nie zostały w pełni rozwiązane. Dzięki technikom opanowanym w ramach tego ćwiczenia można przejść do udzielenia odpowiedzi na wiele pytań pozostających w innych preparatach eksperymentalnych, a także w zastosowaniach fizjologicznych związanych z medycyną i zdrowiem. Wykazaliśmy użyteczność modelowego preparatu bezkręgowca w rozwiązywaniu fundamentalnych kwestii istotnych dla wszystkich zwierząt.

Wykorzystując wiedzę na temat gradientów elektrochemicznych jonów zdobytą w powyższym ćwiczeniu, mogą Państwo teraz przejść do zagadnienia pobudliwości błon, badając przekaźnictwo synaptyczne w preparatach nerwowo-mięśniowych raka.

Pomiar odpowiedzi synaptycznych

Szczegóły przedstawione w pierwszej części tego laboratorium oraz powiązana z nią aplikacja wideo dostarczyły kluczowych kroków niezbędnych do rejestracji potencjałów błonowych i badania struktury mięśni. W drugiej części laboratorium demonstracja sekcji oraz rejestracja przewodnictwa synaptycznego w obrębie złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) fazowych i tonicznych jednostek motorycznych pozwoliła na zapoznanie się z fundamentalnymi pojęciami z zakresu fizjologii. Ekspozycja na obwód neuronalny w organizmie nienaruszonym, który może częściowo służyć do wyjaśnienia powiązanych z nim zachowań, stwarza możliwość nie tylko badania przez studentów różnych otwartych pytań w ramach ćwiczeń laboratoryjnych, ale także prowadzenia przyszłych badań nad obwodami neuronalnymi w dobrze opracowanym preparacie bezkręgowca (Kennedy et al., 1969; Antonsen and Edwards, 2003)

Przygotowania te mogą być również wykorzystane do badania facylitacji synaptycznej, depresji oraz plastyczności długoterminowej (niebadanych w niniejszym badaniu laboratoryjnym). Nawet w obrębie niektórych gatunków raków plastyczność neuronalna zależy od warunków stymulacji eksperymentalnej (Mercier i Atwood, 1989; Cooper et al., 1998), a także od ich naturalnego środowiska. Zakres, w jakim zdolność do zmiany skuteczności synaptycznej i dynamiki mięśni służy zwierzęciu, pozostaje do zbadania. Ponieważ raki zmieniają swoje zachowanie w zależności od zmienności sezonowej i cyklu linienia, w ich układach neuromięśniowych występują stosunkowo długoterminowe różnice w aktywności. Wykazano, że fazowe zakończenia nerwu ruchowego mięśni zamykających szczypce wykazują klasyczną morfologię fazową w zimie, natomiast w miesiącach letnich pęcznieją i stają się bardziej żylaste wzdłuż długości zakończenia (Lnenicka 1993; Lnenicka i Zhao, 1991).

Wczesne badania przeprowadzone na bocznych olbrzymich (LG) interneuronach raków w brzuszny sznurze nerwowym wykazały obecność złączy szczelinowych (Johnson, 1924; Watanabe i Grundfest, 1961). Powszechnie wiadomo, że CO2 wpływa na komunikację elektryczną poprzez rozsprzęganie złączy szczelinowych (Arellano et al, 1990). Niedawno wykazano, że sznur nerwowy oraz komunikacja w obrębie obwodu sensorycznego-OUN-motorycznego-mięśniowego, opisanego w niniejszym raporcie, są również wrażliwe na ekspozycję na CO2, co wskazuje na obecność złączy szczelinowych (Bierbower, 2010; Bierbower i Cooper, 2010)

Spontaniczna aktywność 3rd korzenia ruchowego jest przedmiotem badań od lat 60. XX wieku, kiedy Eckert (1961) badał, czy toniczne wyładowania statycznego organu receptora mięśniowego (MRO) w obrębie tego samego lub sąsiedniego segmentu mogą odpowiadać za spontaniczny impuls ruchowy. W tych wcześniejszych badaniach stało się jasne, że aktywność ta jest generowana w obrębie brzusznego sznura nerwowego (VNC), prawdopodobnie z ośrodków wyższych (Eckert, 1961; Kennedy i Takeda, 1965a,b; Strawn et al., 2000). Ponieważ obecność CO2 hamowała aktywność spontaniczną, można założyć, że w drodze przekazywania impulsu do neuronów ruchowych mogą występować połączenia szczelinowe lub glutaminergiczne pobudzenie. Złącza nerwowo-mięśniowe (NMJ) są blokowane lub wykazują zmniejszoną wrażliwość na glutaminian w obecności CO2, co może zachodzić również w obrębie OUN (Bierbower, 2010; Bierbower i Cooper, 2010; patrz również Badre et al., 2005).

Działanie różnych neuromodulatorów jest również łatwo badane w różnych typach połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) (Cooper i Cooper, 2009; Griffis et al., 2000; Southard et al., 2000; Strawn et al., 2000). Ponadto neuromodulatory wywierają różnorodny wpływ na obwody OUN. Sugerowano, że neurony serotoninergiczne (5-HT) i oktopaminergiczne mogą funkcjonować jako „regulatory wzmocnienia” (gain-setters), zmieniając sygnały wyjściowe obwodów neuronalnych (Ma et al., 1992; Schneider et al., 1996; Hörner et al., 1997; Edwards et al., 2002). Przed pełnym zrozumieniem efektów działania neuromodulatorów na poszczególne komórki docelowe wymagane jest przeprowadzenie wielu dalszych badań. Biorąc pod uwagę, że różne neuromodulatory mogą działać synergistycznie, analiza ich mieszanego działania stanowi obszar przyszłych badań (Djokaj et al., 2001). Ponadto niewiele badań, szczególnie u kręgowców, dotyczy wpływu neuromodulatorów na całe ścieżki, które mogą regulować określone zachowanie. W tej preparacji jednostki sensorycznej-OUN-motorycznej można badać wpływ zarówno bodźców sensorycznych, jak i neuromodulatorów na aktywność neuronów ruchowych (Kennedy et al., 1969).

Ponieważ postawiono hipotezę, że 5-HT odgrywa rolę w regulacji stanu behawioralnego raków, homarów i krabów (Livingstone et al., 1980; Sneddon et al., 2000), podjęto szereg prób określenia jego stężenia w VNC, hemolimfie oraz w izolowanych zwojach homarów (Livingstone et al., 1980; Harris-Warrick i Kravitz 1984; Fadool et al., 1988). Jednak odnotowane pomiary wykazywały znaczne różnice, co uniemożliwiło ustalenie konkretnych zależności dawka-odpowiedź, które mogłyby wyjaśnić reakcje behawioralne.

Uważano, że rak z uniesionymi szczypcami i podwiniętym pod odwłok ogonem przyjmuje postawę dominującą (Livingstone et al., 1980). Stan zgięcia odwłoka u raków nie wydaje się być postawą, którą dominujące raki w parze wykazują podczas interakcji społecznych lub podczas utrzymywania dominującego statusu hierarchicznego (Listerman et al., 2000). Raki uległe również podwijają odwłoki pod siebie podczas wycofywania się przed przeciwnikiem. Takie podwijanie ogona jest postrzegane również jako postawa obronna (Listerman et al., 2000). Zachowania te były powszechnie obserwowane w terenie oraz w warunkach laboratoryjnych (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski and Dunham, 1987; Li et al., 2000; Listerman et al., 2000). Co ciekawe, postawy behawioralne odnotowane u homarów (Livingstone et al., 1980) są odwrócone w przypadku wstrzyknięć 5-HT i oktaopaminy u australijskiego raka, Cherax destructor (McRae, 1996). Być może w preparacie powierzchownego mięśnia zginacza u raka australijskiego zaobserwowano by zupełnie inne reakcje. Ponadto, ponieważ dominacja wśród raków jest zazwyczaj związana z wielkością, można oczekiwać bardzo plastycznego systemu reakcji na szybko zmieniające się warunki społeczne (Strawn et al., 2000). Plastyczność odpowiedzi na neuromodulatory u bezkręgowców pozostaje otwartym obszarem badań.

Wyttenbach, Johnson i Hoy (1999) opracowali materiały cyfrowe oraz podręcznik laboratoryjny do różnorodnych eksperymentów na rakach, obejmujący ten sam mięsień, który przedstawiono w niniejszym raporcie, a także inne preparaty z raków. Jest to doskonały zasób do ćwiczeń dla studentów.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Wspierane przez University of Kentucky, Wydział Biologii, Biuro Studiów Licencjackich oraz Kolegium Nauk i Sztuk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  1. Rak (*Procambarus clarkii*). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standardowy roztwór soli dla raków: zmodyfikowany według Van Harrevelda’roztwór s (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl22H2O; 2,45 MgCl226 h2O; 5 HEPES i dostosowany do pH 7,4. Serotonina, glutaminian i dopamina są przygotowywane w soli fizjologicznej dla raka. Bouin’Roztwór utrwalający był stosowany bezpośrednio, a błękit metylenowy został przygotowany w soli fizjologicznej dla raków. Wszystkie odczynniki chemiczne zostały zakupione w firmie Sigma (St. Louis, MO).
  3. Narzędzia do sekcji: pęseta precyzyjna nr 5, nożyczki precyzyjne, uchwyt do ostrzy noży, szpile do owadów nr 26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. szklana szalka z dnem z Sylgardu
  5. Zlewki (do przechowywania roztworów chemicznych)
  6. Sygnały elektryczne są rejestrowane w czasie rzeczywistym w urządzeniu PowerLab 26T interfejs do komputera (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Stosujemy standardowe oprogramowanie firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope.
  7. Można zastosować wzmacniacz AC/DC Model 3000 do rejestracji wewnątrzkomórkowej oraz zewnątrzkomórkowej.
  8. Mikroskop sekcyjny z funkcją zoomu do rejestracji wewnątrzkomórkowych. Do rejestracji ogniskowej na wizualizowanych zakończeniach stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20x). Wymagane jest źródło światła Hg.
  9. Do rejestracji wewnątrzkomórkowej wykorzystujemy szklane rurki kapilarne (numer katalogowy 30-31-0 od FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć oporność od 20 do 30 mOhm. Elektrody wewnątrzkomórkowe wypełniono 3 M KCl.
  10. Do rejestracji sygnałów pozakomórkowych stosuje się elektrodę ssącą.
  11. Klatka Faradaya.
  12. Iluminator o wysokiej intensywności (źródło światła).
  13. Mikromanipulator

Bibliografia

  1. Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Differential dye coupling reveals lateral giant escape circuit in crayfish. J. Comp. Neurol. 466, 1-13 (2003).
  2. Arellano, R. O., Rivera, A., Ramón, F. Protein phosphorylation and hydrogen ions modulate calcium-induced closure of gap junction channels. Biophys. J. 57, 363-367 (1990).
  3. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  4. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 57-58 (1967).
  5. Atwood, H. L. Peripheral inhibition in crustacean muscle. Experimentia. 24, 753-763 (1968).
  6. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  7. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).
  8. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, D. C., Atwood, H. L. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  9. Atwood, H. L. Parallel 'phasic' and 'tonic' motor systems in the crayfish abdomen. J. Exp. Biol. 211, 2193-2195 (2008).
  10. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35 (6), 556-565 (1995).
  11. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 51-58 (1996).
  12. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  13. Atwood, H. L., Parnas, I. Recording from the crayfish abdominal extensor muscle preparation with microelectrodes. In: Experiments in physiology and biochemistry. Kerkut, G. A. , Academic. London. 307-330 (1968).
  14. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila larvae. Comparative Biochemistry and Physiology A. 140, 363-376 (2005).
  15. Bernstein, J. Untersuchungen zur Thermodynamik der bioelektrischen Ströme. Pflüger Arch. ges. Physiol. 9, 521-562 (1902).
  16. Bernstein, J. Elektrobiologie. , Viewag. Braunschweig. 215(1912).
  17. Bierbower, S. M. Environmental effects on behavior and physiology in crayfish. , Department of Biology, University of Kentucky. (2010).
  18. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The effects of acute carbon dioxide on behavior and physiology in Procambarus clarkii. J. Exp. Zool. , In press (2010).
  19. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. (Lond.). 144, 176-191 (1958).
  20. Bovbjerg, R. V. Dominance order in the crayfish Orconectes 6irilis (Hagen). Physiol. Zool. 26, 173-178 (1953).
  21. Bovbjerg, R. V. Some factors affecting aggressive behavior in crayfish. Physiol. Zool. 29, 127-136 (1956).
  22. Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle. J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).
  23. Bruski, C. A., Dunham, D. W. The importance of vision in agonistic communication of the crayfish Orconectes rusticus, I. an analysis of bout dynamics. Behaviour. 63, 83-107 (1987).
  24. Burke, W., Ginsborg, B. L. The electrical properties of the slow muscle fibre membrane. J. Physiol. 132, 586-598 (1956).
  25. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595(2009).
  26. Cooper, R. L., Warren, W. M., Ashby, H. E. Activity of phasic motor neurons partially transforms the neuronal and muscle phenotype to a tonic-like state. Muscle & Nerve. 21, 921-931 (1998).
  27. Djokaj, S., Cooper, R. L., Rathmayer, W. Effects of octopamine, serotonin, and cocktails of the two modulators on synaptic transmission at crustacean neuromuscular junctions. J. Comp. Physiol. A. 187 (2), 145-154 (2001).
  28. Dudel, J., Kuffler, S. W. Mechanism of facilitation at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond.). 155, 540-542 (1961).
  29. Eckert, R. O. Reflex relationships of the abdominal stretch receptors of the crayfish. J. Cell. Comp. Physiol. 57, 149-162 (1961).
  30. Edwards, D. H., Yeh, S. R., Musolf, B. E., Antonsen, B. L., Krasne, F. B. Metamodulation of the crayfish escape circuit. Brain Behav Evol. 60 (6), 360-369 (2002).
  31. Fadool, D. A., Cobb, S. J., Kass-Simon, G., Brown, P. R. Liquid chromatographic procedures for the analysis of compounds in the serotonergic and octopamine pathways of lobster hemolymph. J. Chromatogr. 452, 491-501 (1988).
  32. Fatt, P., Katz, B. The electrical properties of crustacean muscle fibers. J. Physiol. 120, 171-204 (1953).
  33. Fields, H. L., Kennedy, D. Functional role of muscle receptor organs in crayfish. Nature. 206 (990), 1235-1237 (1965).
  34. Fisher, L., Florey, E. Modulation of synaptic transmission and excitation-contraction coupling in the opener muscle of the crayfish, Astacus leptodactylus, by 5-hydroxytryptamine and octopamine. J. Exp. Biol.. 102, 187-198 (1983).
  35. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Anzeiger Akad. 18, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 275(1881).
  36. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Sitzungsber. Akad. 85, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 9-46 (1881).
  37. Goldman, D. E. Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943).
  38. Griffis, B., Bonner, P., Cooper, R. L. Sensitivity of transformed (phasic to tonic) motor neurons to the neuromodulator 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology A. 127, 495-504 (2000).
  39. Grundfest, H., Reuben, J. P. Neuromuscular synaptic activity in lobster. Nervous Inhibition. Florey, E. , Pergamon Press. Oxford. 92-104 (1961).
  40. Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Cellular mechanisms for modulation of posture by octopamine and serotonin in the lobster. J. Neurosci. 4, 1976-1993 (1984).
  41. Hagiwara, S., Chichibu, S., Naka, K. I. The effects of various ions on resting and spike potentials of barnacle muscle fibers. J. Gen. Physiol. 48, 163-179 (1964).
  42. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes. , 2nd, Sinauer Assoc. Sunderland, Mass. (1992).
  43. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond.). 117, 500-544 (1952).
  44. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F., Katz, B. Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.). 116, 424-448 (1952).
  45. Hodgkin, A. L., Katz, B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid. J. Physiol. (Lond.). 108, 37-77 (1949).
  46. Hodgkin, A. L., Rushton, W. A. H. The electrical constants of a crustacean nerve fibre. Proc. Roy. Soc. 133, 444-479 (1946).
  47. Hörner, M., Weiger, W. A., Edwards, D. H., Kravitz, E. A. Excitation of identified serotonergic neurons by escape command neurons in lobsters. J. Exp. Biol. 200, 2017-2033 (1997).
  48. Huxley, T. H. The crayfish. , C. Kegan Paul and Co. London. (1880).
  49. Johnson, G. E. Giant nerve fibers in crustaceans with special reference to Cambaus and Palaemonetes. J. Comp. Neurol. 36, 323-373 (1924).
  50. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramon, F. Interaction of anaesthetics with electrical synapses. Nature (Lond.). 286, 498-500 (1980).
  51. Katz, B., Miledi, R. The role of calcium in neuromuscular facilitation. J. Physiol. (Lond.). 195, 481-492 (1968).
  52. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in the crayfish: the twitch system. J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).
  53. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of the abdominal flexor in the crayfish: the tonic system. J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).
  54. Kennedy, D., Selverston, A. I., Remler, M. P. Analysis of restricted neural networks. Science. 164, 1488-1496 (1969).
  55. Krasne, F. B. Excitation and habituation of the crayfish escape reflex: the depolarizing response in lateral giant fibres of the isolated abdomen. J. Exp. Biol. 50, 29-46 (1969).
  56. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate measures in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comp. Biochem. Physiol A. 127, 55-70 (2000).
  57. Listerman, L., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Measures of heart rate during social interactions in crayfish and effects of 5-HT. Comp. Biochem. Physiol A. 125, 251-264 (2000).
  58. Livingstone, M. S., Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Serotonin and octopamine produce opposite postures in lobsters. Science. 208, 76-79 (1980).
  59. Lnenicka, G. A. Seasonal differences in motor terminals. Comp. Biochem. Physiol A. 104, 423-429 (1993).
  60. Lnenicka, G. A., Zhao, Y. Seasonal differences in the physiology and morphology of crayfish motor terminals. J. Neurobiol. 22, 561-569 (1993).
  61. Ma, P. M., Beltz, B. S., Kravitz, E. A. Serotonin containing neurons in lobsters: their role as 'gainsetters' in postural control mechanisms. J. Neurophysiol. 68, 36-54 (1992).
  62. Malmivuo, J., Plonsey, R. Bioelectromagnetism-Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields. , Oxford University Press. New York. (1995).
  63. McRae, T. On the postural effects induced in female Cherax destructor (Clark) by serotonin and octopamine. Freshwater Crayfish. 11, 293-298 (1996).
  64. Mercier, A. J., Atwood, H. L. Long-term adaptation of a phasic extensor motoneurone in crayfish. J. Exp. Biol. 145, 9-22 (1989).
  65. Monaghan, D. T., Bridges, R. J., Cotman, C. W. The excitatory amino acid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the function of the central nervous system. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365-402 (1989).
  66. Moody, W. Gradual increase in the electrical excitability of crayfish slow muscle fibers produced by anoxia or uncouplers of oxidative phosphorylation. J. Comp. Physiol. 125, 327-334 (1978).
  67. Nernst, W. H. Zur Kinetik der Lösung befindlichen Körper: Theorie der Diffusion. Z. Phys. Chem. 3, 613-637 Forthcoming.
  68. Nernst, W. H. Die elektromotorische Wirksamkeit der Ionen. Z. Phys. Chem. 4, 129-181 Forthcoming.
  69. Pilgrim, R. L. C., Wiersma, C. A. G. Observations on the skeleton and somatic musculature of the abdomen and thorax of Procambarus clarkii (Girard), with notes on the thorax of Panulirus interruptus (Randall) and Astacus. J. Morphol. 113, 453-587 (1963).
  70. Robinson, M. M., Martin, J. M., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2325(2011).
  71. Schneider, H., Budhiraja, P., Walter, I., Beltz, B. S., Peckol, E., Kravitz, E. A. Developmental expression of the octopamine phenotype in lobsters. J. Comp. Neurol. 371, 3-14 (1996).
  72. Skou, J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 439-446 (1989).
  73. Skou, J. C. The identification of the sodium-pump as the membrane-bound Na+/K+-ATPase: a commentary on 'The Influence of Some Cations on an Adenosine Triphosphatase from Peripheral Nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 435-438 (1989).
  74. Skou, J. C. Enzymatic basis for active transport of Na+ and K+ across cell membrane. Physiol. Rev. 45, 596-617 (1965).
  75. Skou, J. C. Nobel Lecture. The identification of the sodium pump. Biosci Rep. 18, 155-169 (1998).
  76. Sneddon, L. U., Taylor, A. C., Huntingford, F. A., Watson, D. G. Agonistic behavior and biogenic amines in shore crabs Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 203, 537-545 (2000).
  77. Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen. J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2000).
  78. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  79. Stefani, E., Steinbach, A. B. Resting potential and electrical properties of frog slow muscle fibers. Effect of different external solutions. J. Physiol. 203, 383-401 (1969).
  80. Strawn, J. R., Neckameyer, W. S., Cooper, R. L. The effects of 5-HT on sensory neurons, CNS command, and neuromuscular junctions of the crayfish abdominal superficial flexor. Comp. Biochem. Physiol B. 127, 533-550 (2000).
  81. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Anion permeability of the inhibitory post-synaptic membrane of the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (London). 191, 575-590 (1967).
  82. Tsunoyama, T., Gojobori, S. Evolution of Nicotinic Acetylcholine receptor Subunits. Mol. Biol. Evol. 15 (5), 518-527 (1998).
  83. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  84. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  85. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22 (11), 667(1936).
  86. Vélez, S. J., Wayman, R. J. Synaptic connectivity in a crayfish neuromuscular system. I. Gradient of innervations and synaptic strength. J. Neurophysiol. 41, 75-84 (1978).
  87. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. J. Gen. Physiol. 45, 267-308 (1961).
  88. Watkins, J. C. L-Glutamate as a central neurotransmitter: Looking back. Biochemical Society Transactions. 28, 297-310 (2000).
  89. Wiersma, C. A. G. The neuromuscular system. The Physiology of Crustacea. Waterman, T. H. II, Academic Press. New York. (1961).
  90. Wiersma, C. A. G. Reflexes and the central nervous system. The physiology of Crustacea. II, Academic Press. New York. 241-279 (1961).
  91. Wine, J. J., Mittenthal, J. E., Kennedy, D. The structure of tonic flexor motoneurons in crayfish abdominal ganglia. J. Comp. Physiol. 93, 315-335 (1974).
  92. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle. J. Vis. Exp. (45), e2319(2010).
  93. Wyttenbach, R. A., Johnson, B. R., Hoy, R. R. Crawdad. A CD-ROM Lab manual for neurophysiology. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (1999).
  94. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. 3. Electrical junctions and dendrite spikes in fast flexor motoneurons. J. Neurophysiol. 35, 638-651 (1972).
  95. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. II. Physiological mechanisms underlying behavioral habituation. J. Neurophysiol. 35 (5), 621-637 (1972).
  96. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. I. Neural circuit exciting lateral giant fiber. J. Neurophysiol. 35 (5), 599-620 (1972).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Potencja b onowyprzeka nictwo synaptycznemodel rakowarejestracja wewn trzkom rkowapotas pozakom rkowyz cze nerwowo mi nioweobw d sensoryczno motorycznytypy w kien mi niowychtechniki elektrofizjologiczneefekty neuromodulacji
Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.