Eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Podsumowanie

W niniejszym raporcie prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do badania biologii jelita tylnego raków. Pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję odwłoka raka oraz jak badać powiązaną z nim anatomię, fizjologię i modulację aktywności. Aktywność perystaltyczną oraz siłę skurczów mierzy się przy użyciu przetwornika siły.

Streszczenie

Celem niniejszego raportu jest opis technik sekcji służących do przygotowania jelita tylnego raków oraz zademonstrowanie sposobu wykonywania pomiarów fizjologicznych za pomocą przetwornika siły w celu monitorowania siły skurczu. Ponadto pokazujemy, jak wizualnie monitorować aktywność perystaltyczną, która może służyć jako bioassay dla różnych peptydów, amin biogennych i neurotransmiterów. Przygotowanie to nadaje się do laboratoriów studenckich z fizjologii oraz do prezentowania studentom koncepcji farmakologicznych. Preparat ten jest stosowany od ponad 100 lat i nadal stanowi cenny model do badania generowania i regulacji rytmów perystaltycznych oraz opisywania mechanizmów leżących u podstaw ich modulacji. Badania farmakologiczne i typowanie podtypów receptorów, rozpoczęte ponad 50 lat temu na jelicie tylnym, wciąż wnoszą wkład w dzisiejsze badania. Ten wytrzymały preparat jest odpowiedni do szkolenia studentów w zakresie fizjologii i farmakologii.

Protokół

1. Wstęp

Najnowszy kompleksowy przegląd jelita tylnego raków został opracowany w dysertacji dr Barbary E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), która skupiła się przede wszystkim na modulacji serotonergicznej i unerwieniu (Musolf et al., 2009). Jelita tylne skorupiaków zostały po raz pierwszy zbadane ponad 100 lat temu przez Alexandrowicza, pioniera anatomii porównawczej (Alexandrowicz, 1909), który opisał różne aspekty ich unerwienia. Badania kontynuowano na przestrzeni lat, identyfikując rodzaje i architekturę warstw mięśniowych, analizując ogólną funkcję jelita tylnego w osmoregulacji całego organizmu oraz badając kontrolę modulacyjną kurczliwości jelita tylnego przez różne związki (zob. przegląd Musolf, 2007). Warto zauważyć, że odcinek analny jelita tylnego służy nie tylko do wydalania kału, ale także do pobierania wody ze środowiska w celu osmoregulacji. Region ten jelita może ulegać perystaltyce przedniej lub wstecznej, w zależności od potrzeb zwierzęcia.

Alexandrowicz (1909) zidentyfikował dwa sploty nerwowe unerwiające jelito końcowe skorupiaków – splot wewnętrzny oraz splot zewnętrzny, które w późniejszym czasie okazały się cennym źródłem do identyfikacji i charakterystyki neuroprzekaźników. W latach 50. dr Ernst Florey rozpoczął serię badań farmakologicznych nad jelitem końcowym raka, wykazując, że skurcze są modulowane przez acetylocholinę i jej pochodne, a także przez epinefrynę i norepinefrynę (Florey, 1954). Florey, odkrywca substancji hamującej znanej jako „czynnik-I”, badał działanie tej substancji na różnych preparatach, w tym na układzie pokarmowym raka (Florey, 1961). Później wykazano, że czynnikiem-I jest GABA. W ten sposób jelito końcowe raka odegrało istotną rolę w wczesnych badaniach nad inhibicją synaptyczną.

Po odkryciu GABA wykazano, że inne domniemane neuroprzekaźniki są również związane z splotami jelita tylnego i wywołują odpowiedzi fizjologiczne. Do takich przekaźników należą dopamina (Elekes et al. 1988; Elofsson et al. 1968), proktolina (RYLPG-OH; Mercier et al. 1997), dwa peptydy orkokininy (NFDEIDRSGFGFN i AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al. 1994; Dircksen et al. 2000), orkomyotropina (FDAFTTGFamide; Dircksen et al. 2000) oraz peptyd myosupresyny (Mercier et al. 1997; najprawdopodobniej pQDLDHVFLRFamide, por. Stemmler et al. 2007). Każda z tych substancji moduluje spontaniczne skurcze jelita tylnego, a wszystkie poza GABA wydają się być pobudzające. Jelito tylne reaguje również na glutaminian i kwiskwalan (Jones, 1962; Wrong et al. 2003), jednak nie zgłoszono jednoznacznych dowodów na istnienie unerwienia glutaminergicznego. Posłańcy wewnątrzkomórkowi pośredniczący w działaniu poszczególnych przekaźników pozostają w dużej mierze niezbadani, ale istnieją dowody na udział cAMP w zdolności dopaminy do nasilania skurczów (Knotz & Mercier, 1995).

Choć jelito końcowe skorupiaków kurczy się spontanicznie po denerwacji, skurcze te są zazwyczaj słabe i nieskoordynowane (Wales, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Ruchy perystaltyczne wymagają skoordynowanego sygnału motorycznego z ośrodkowego układu nerwowego, który najwyraźniej pochodzi z ostatniego zwoju brzusznego (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). U raków sygnał motoryczny jest przekazywany do jelita końcowego poprzez 7^th korzeń brzuszny, który zawiera 75 aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w ostatnim zwoju brzusznym (Kondoh & Hisada, 1986). Przynajmniej niektóre peptydy wydają się być dostarczane do splotu jelita końcowego z neuronów pochodzących z ostatniego zwoju brzusznego (Dircksen et al. 2000; Mercier et al. 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), natomiast dopamina jest dostarczana przez neurony w zwojach położonych bardziej przednio (Mercier et al. 1991a). Ponieważ sygnał motoryczny przekazywany przez 7^th korzeń brzuszny jest niezbędny do wystąpienia dużych, skoordynowanych skurczów, prawdopodobne jest, że niektóre lub wszystkie wymienione powyżej domniemane przekaźniki w pewien sposób przyczyniają się do perystaltyki. Ich relatywny udział nie jest jednak znany. Niektóre wnioski można wyciągnąć, badając ich wpływ oddzielnie na mięśnie okrężne i podłużne (Mercier & Lee, 2002).

Oprócz kontrolowania przemieszczania się niestrawionych pokarmów, splot nerwowy związany z jelitem tylnym skorupiaków wydaje się pełnić ważną funkcję endokrynną związaną z linieniem. Jelito tylne kraba, Carcinus maenas, zawiera komórki endokrynne, które podczas ekdyzy uwalniają hormon hiperglikemiczny skorupiaków oraz powiązany z nim peptyd prekursorowy (Webster et al. 2000), co sugeruje ich rolę w pobieraniu wody i pęcznieniu związanym z procesem linienia. Zatem jelito tylne skorupiaków uczestniczy w kilku istotnych procesach fizjologicznych.

Niniejszy raport jest przede wszystkim narzędziem dydaktycznym dla uczniów starszych klas szkół średnich oraz studentów studiów licencjackich na kursach fizjologii, które obejmują część eksperymentalną. Studenci mogą przeanalizować znaczenie oraz potencjalny mechanizm skurczu i funkcjonowania jelita tylnego. Wykorzystane zostaną środki farmakologiczne, neuroprzekaźniki oraz neurohormony, a następnie zostaną sporządzone krzywe dawka-odpowiedź, co pozwoli studentom zapoznać się z metodami pozyskiwania i interpretacji danych fizjologicznych i farmakologicznych. Można również uzyskać ogólne zrozumienie funkcji receptorów w odniesieniu do agonistów i antagonistów. Studenci nauczą się także prezentować dane w formie graficznej w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.

Wypreparowanie jelita tylnego homara oraz rejestracja jego skurczów są bardzo proste. W preparacie wypreparowanym jelito jest łatwo dostępne dla substancji egzogennych. Zmiany w aktywności perystaltycznej można monitorować wizualnie lub za pomocą przetwornika siły, który pozwala również na pomiar siły skurczów. Ze względu na prostotę i niezawodność jako preparat do bioanaliz, jelito tylne homara jest nadal bardzo użyteczne w badaniu wielu zagadnień dotyczących mechanizmów perystaltyki, modulacji efektów motorycznych i skurczów mięśni oraz funkcji receptorów. Jelito tylne znajduje również zastosowanie w testowaniu insektycydów, krustacycydów oraz zanieczyszczeń pod kątem specyficznych mechanizmów ich działania.

2. Metody

2.1) Materiały

• rak
• sól fizjologiczna dla raków
• zestaw narzędzi do sekcji (nożyczki grube i precyzyjne, pęsety grube i precyzyjne)
• szalka Petri z dnem z Sylgardu
• stalowe szpilki sekcyjne
• zlewki (do przechowywania roztworów chemicznych)
• parafilm (do przykrywania i mieszania roztworów)

2.2) Disekcja

1. Rakowate (Procambarus clarkii) o długości ciała 6-10 cm należy umieścić na lodzie na 5 do 10 minut w celu znieczulenia zwierzęcia przed rozpoczęciem sekcji.
2. Znieczulonego raka należy trzymać jedną ręką za obszar za szczypcami. Szybkim ruchem należy przeciąć od oczodołu do środka głowy po obu stronach, a następnie odciąć głowę raka (Uwaga: krew z preparatu staje się lepka po wyschnięciu, dlatego należy umyć narzędzia po zakończeniu pracy).
   
   Rysunek 1: Dekapitacja raka
3. Należy odciąć chelipody i odnóża kroczne.
4. Należy odciąć lewą i prawą płetwę ogonową, pozostawiając jedynie środkową płetwę ogonową (uropod).
5. Na stronie grzbietowej raka należy wykonać cięcia brzuszne po lewej i prawej stronie kutykuli grzbietowej.
   
   Rysunek 2: Usunięcie kutykuli grzbietowej
6. Należy wykonać cięcie poprzeczne na stronie grzbietowej kutykuli, dbając o to, aby cięcie było płytkie, aby uniknąć uszkodzenia przewodu pokarmowego (G.I.). Następnie należy usunąć dolną sekcję grzbietowej kutykuli odwłoka.
7. Zasekcjonowanego raka należy umieścić w naczyniu wyłożonym Sylgardem.
8. Raka należy przymocować szpilkami do naczynia w części końcowej płetwy ogonowej. W razie potrzeby można użyć większej liczby szpilek po obu stronach G.I., aby unieruchomić ciało.
9. Naczynie należy wypełnić solą fizjologiczną dla raków, zakrywając G.I. Należy stale obmywać G.I. solą fizjologiczną za pomocą pipety. Sól fizjologiczna to zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936), składający się z 205 mM NaCl; 5.3 mM KCl; 13.5 mM CaCl₂ 2H₂O; 2.45 mM MgCl₂ 6H₂O; 5 mM HEPES, z pH dostosowanym do 7.4. Zasekcjonowany rak powinien wyglądać tak, jak pokazano na Rysunku 3.
   
   Rysunek 3: Zasekcjonowany rak z nienaruszonym G.I.

2.3) Eksperymenty

2.3.1) Skurcze w organizmie zwierzęcia

1. Należy przygotować roztwory związku poddawanego badaniu, tak aby miały tę samą temperaturę co sól fizjologiczna używana do kąpieli. Jako substancje startowe do testów można wykorzystać poszczególne roztwory serotoniny (100 nM, 1 $\mu$M), glutaminianu (1 $\mu$M) oraz dopaminy (1 $\mu$M) przygotowane w soli fizjologicznej dla raków.
2. Pozostawcie wypreparowanego raka w roztworze dla raków przez około dziesięć minut, aby organizm mógł dojść do siebie po szoku wywołanym sekcją i ekspozycją na sól fizjologiczną. Powinny zacząć pojawiać się powolne skurcze perystaltyczne jelita końcowego.
3. Po rozpoczęciu skurczów należy odnotować liczbę skurczów występujących w ciągu trzydziestu sekund (należy zaznaczyć rodzaj występujących skurczów, np. perystaltyczne lub spastyczne, oraz kierunek ewentualnych fal perystaltycznych).
   Tabela 1: Skurcze w soli fizjologicznej dla raków
   

   Liczba skurczów	Rodzaje skurczów

4. Za pomocą pipety należy usunąć sól fizjologiczną z jam ciała w odsłoniętym odwłoku raka, a następnie nanieść sól fizjologiczną zawierającą badaną substancję bezpośrednio na jelito końcowe.
5. Bezpośrednio po dodaniu roztworu należy odnotować liczbę skurczów występujących po trzydziestu sekundach oraz określić ich rodzaj (tj. perystaltyczne lub spastyczne).
   Tabela 2: Skurcze w zależności od ekspozycji na związki
   

   Badany związek	Stężenie	Liczba skurczów	Rodzaje skurczów

6. Bezpośrednio po zarejestrowaniu odpowiedzi na substancję testową kilkukrotnie przepłucz przewód pokarmowy standardowym roztworem soli fizjologicznej dla raków. Pozostaw preparat na 5 minut, przepłukując go roztworem soli fizjologicznej dla raków mniej więcej co 30 sekund.
7. Za pomocą pipety nanieś bezpośrednio na jelito tylne niewielką ilość soli fizjologicznej zawierającej kolejny związek do zbadania lub zmiżone stężenie ostatnio testowanej substancji. Zaleca się rozpocząć od niższego stężenia i stopniowo zwiększać jego wartość.
8. Bezpośrednio po dodaniu każdej nowej substancji lub każdego nowego stężenia należy odnotować liczbę skurczów występujących po trzydziestu sekundach oraz określić typ skurczów.

2.3.2) Rejestracja sił skurczu w preparatach wyizolowanych

Rysunek 4: Układ

1. Podłącz przetwornik do modułu mostka (bridge pod).
2. Podłącz moduł mostka do urządzenia PowerLab 26T.
3. Podłącz PowerLab 26T do portu USB w komputerze.
4. Otwórz program LabChart7, klikając ikonę labchart7 na pulpicie.
   • Pojawi się okno LabChart Welcome Center. Zamknij je.
   • Kliknij Setup.
   • Kliknij channel settings. Zmień liczbę kanałów na 1 (lewy dolny róg okna) i zatwierdź przyciskiem OK.
   • W lewym górnym rogu wykresu ustaw liczbę cykli na sekundę na około 2k. Ustaw napięcie (oś y) na około 500 lub 200 mV.
   • Kliknij Channel 1 po prawej stronie wykresu. Kliknij Input Amplifier. Upewnij się, że zaznaczone są następujące ustawienia: single-ended, ac coupled, invert (odwraca sygnał w razie potrzeby) oraz anti-alias.
   • Aby rozpocząć rejestrację, naciśnij start.
5. Pobierz preparat i przetnij przewód pokarmowy na styku klatki piersiowej i brzucha. Następnie ostrożnie przetnij część telsonową ogona. Wyjmij przewód pokarmowy z rozsektowanego rak i umieść go w szalce z Sylgardem. Wzdłuż grzbietowej strony przewodu pokarmowego biegnie naczynie krwionośne; ostrożnie oddziel je od przewodu pokarmowego. Zalej preparat świeżym roztworem soli fizjologicznej dla raków.
6. Umieść przetwornik siły w uchwycie w pobliżu rozsektowanego raka.
7. Zahacz przetwornik siły o przewód pokarmowy raka, jak pokazano na rysunku 5.
   
   Rysunek 5: Izolowany końcowy odcinek jelita raka w roztworze soli fizjologicznej przymocowany do haka przetwornika siły
8. Odczekaj, aż przewód pokarmowy zacznie się kurczyć, a następnie naciśnij start w programie LabChart7.
9. Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz o treści "Saline only" (tylko sól fizjologiczna). Wypełnij tabelę 4.
   Tabela 4: Skurcze z zastosowaniem badanego związku
   

   Liczba skurczów	Amplituda skurczów (mV)

10. Dodaj badane związki i niezwłocznie naciśnij "start" w programie LabChart7.
11. Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj bezpośrednio w pliku z wykresem komentarz określający, jaka substancja została dodana oraz w jakim stężeniu. Wypełnij poniższą tabelę.
    Tabela 5: Skurcze z zastosowaniem związku _________
    

    Liczba skurczów	Amplituda skurczów (mV)

12. Opłucz preparat roztworem soli fizjologicznej dla raków za pomocą pipety.
13. W podobny sposób dodaj inne substancje lub różne stężenia. Niezwłocznie naciśnij "start" w programie LabChart7.
14. Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz oraz etykietę bezpośrednio w pliku z wykresem, wskazując użyty związek i jego stężenie.

3. Analiza danych

1. Na podstawie etapu 2.3.1 eksperymentu przedstaw na wykresie liczbę skurczów dla każdego z roztworów (soli fizjologicznej, serotoniny, glutaminianu) w funkcji czasu. Wyjaśnij zaobserwowane trendy.
2. Na podstawie etapu 2.3.2 eksperymentu przedstaw na wykresie liczbę skurczów dla każdego z roztworów (soli fizjologicznej, serotoniny, glutaminianu) w funkcji amplitudy skurczów wyrażonej w mV. Wyjaśnij zaobserwowane trendy.

3.1 ) Pomiar częstotliwości i siły skurczów

Aby wyznaczyć częstość skurczów, można zmierzyć czas od początku jednego odchylenia do początku kolejnego lub zliczyć całkowitą liczbę odchyleń w ciągu jednej lub dwóch minut. Wartości te można następnie wyrazić w liczbie skurczów na minutę lub na sekundę, w zależności od częstotliwości ich występowania.

Aby indeksować siłę skurczów, w celu porównania różnych warunków można zastosować miarę względną. W zapisanym pliku należy użyć znacznika „M” i przesunąć go do linii bazowej. Następnie za pomocą kursora należy przejść do szczytu wychylenia i odnotować wartość wyświetlaną w prawym górnym rogu ekranu jako wartość delta (różnica między punktem M a szczytem). Należy pamiętać, że aby zmierzyć zmianę, kursor musi pozostać w bezruchu. Następnie należy przenieść znacznik M do kolejnej interesującej formy fali i powtórzyć pomiar.

Dyskusja

Szczegóły przedstawione w powiązanym filmie i tekście opisują kluczowe kroki niezbędne do rejestracji aktywności jelita tylnego rakówa in situ oraz in vitro. Jednym z celów naszego raportu jest zwiększenie świadomości na temat potencjału tego preparatu w studenckich laboratoriach badawczych, w których nauczane są podstawowe koncepcje z zakresu fizjologii i farmakologii.

Przygotowania te mogą być wykorzystane do zbadania szeregu pytań eksperymentalnych, które pozwolą na lepsze zrozumienie funkcji fizjologicznych jelita tylnego. Mechanizmy leżące u podstaw regulacji fal perystaltycznych oraz ich odwrócenia nie są jeszcze znane. Mechanizmy wyższej kontroli całego przewodu pokarmowego również nie są w pełni zrozumiane. Kwestia tego, w jaki sposób ośrodki wyższe integrują swoją aktywność z sygnałami autonomicznymi, które bezpośrednio sterują układem pokarmowym, pozostaje otwartym obszarem badań (Shuranova et al., 2006). Ponadto nie zostały w pełni wyjaśnione możliwości osmoregulacyjne jelita tylnego skorupiaków oraz funkcje osmoregulacji podczas linienia i stresu środowiskowego. W przypadku tej preparatyki wciąż wiele pytań oczekuje na odpowiedzi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rak (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standardowy roztwór soli dla raków: zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl22H2O; 2,45 MgCl26H2O; 5 HEPES i dostosowane do pH 7,4. Serotoninę, glutaminian i dopaminę przygotowuje się w roztworze soli dla raków. Wszystkie odczynniki chemiczne pochodzą z firmy Sigma chemical company (St. Louis, MO). Narzędzia do sekcji: precyzyjne pęsety nr 5, precyzyjne nożyczki, uchwyt do ostrza noża, szpilki entomologiczne nr 26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Szalka Petriego z dnem z Sylgardu Zlewki (do roztworów chemicznych) Sygnały elektryczne są rejestrowane w czasie rzeczywistym za pomocą interfejsu PowerLab 26T podłączonego do komputera (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Używamy standardowego oprogramowania firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Bridge pod dla przetwornika siły (różne modele Bridge pod są wymagane dla różnych typów przetworników siły). Przetwornik siły MLT0402 (2 g) jest urządzeniem klasy badawczej, pokazanym w filmie. MLT 0210/D (10 mg–25 g) oraz MLT 500/A (0–500 g) to przetworniki klasy edukacyjnej (ADInstruments).