Eksperymenty fizjologiczne z rakami w jelicie grubym: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Podsumowanie

W tym raporcie pokazujemy techniki, które mogą być użyte do zbadania biologii jelita rakowego. Pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję odwłoka raków i badamy związaną z tym anatomię, fizjologię i modulację aktywności. Aktywność perystaltyczna i siła skurczów są mierzone za pomocą przetwornika siły.

Streszczenie

Celem raportu jest opisanie technik preparowania jelita rakowego i pokazanie, jak dokonywać zapisów fizjologicznych za pomocą przetwornika siły do monitorowania siły skurczu. Ponadto pokazujemy, jak wizualnie monitorować aktywność perystaltyczną, która może być wykorzystana jako test biologiczny dla różnych peptydów, amin biogennych i neuroprzekaźników. Preparat ten jest dostępny w laboratoriach studenckich w zakresie fizjologii oraz w celu zademonstrowania studentom pojęć farmakologicznych. Preparat ten jest stosowany od ponad 100 lat i nadal oferuje wiele jako model do badania generowania i regulacji rytmów perystaltycznych oraz do opisywania mechanizmów leżących u podstaw ich modulacji. Testy farmakologiczne i podtypowanie receptorów, które rozpoczęto ponad 50 lat temu na jelicie tylnym, nadal przyczyniają się do dzisiejszych badań. Ten solidny preparat doskonale nadaje się do szkolenia studentów w zakresie fizjologii i farmakologii.

Protokół

1. Wprowadzenie

Najnowszy obszerny przegląd jelita rakowego został opisany w rozprawie dr Barbary E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), która skupiła się głównie na modulacji i unerwieniu serotoninergicznym (Musolf et al., 2009). Jelita tylne skorupiaków zostały po raz pierwszy zbadane ponad 100 lat temu przez Alexandrowicza, pioniera anatomii porównawczej (Alexandrowicz, 1909), który opisał różne aspekty ich unerwienia. Badania były kontynuowane przez lata, identyfikując rodzaje warstw mięśniowych i architekturę, zajmując się ogólną funkcją jelita tylnego w osmoregulacji dla całego zwierzęcia oraz badając modulacyjną kontrolę kurczliwości jelita tylnego przez różne związki (patrz przegląd Musolf, 2007). Warto zauważyć, że odbytowa część jelita grubego działa nie tylko w celu wydalenia kału, ale także w celu pobierania wody ze środowiska w celu osmoregulacji. Ten obszar jelita może ulegać perystaltyce do przodu lub do tyłu w zależności od potrzeb zwierzęcia.

Alexandrowicz (1909) zidentyfikował dwa sploty nerwowe unerwiające jelito tylne skorupiaka, splot wewnętrzny i splot zewnętrzny, które później okazały się bogatym źródłem do identyfikacji i charakterystyki neuroprzekaźników. W latach pięćdziesiątych dr Ernst Florey rozpoczął serię badań farmakologicznych nad jelitem grubym raków i wykazał, że skurcze są modulowane przez acetylocholinę i jej pokrewne związki, a także przez epinefrynę i noradrenalinę (Florey, 1954). Florey, odkrywca substancji hamującej znanej jako "czynnik I", badał wpływ tej substancji na różne preparaty, w tym na układ pokarmowy u raków (Florey, 1961). Później okazało się, że Factor-I to GABA. Tak więc jelito tylne raków odegrało ważną rolę we wczesnych badaniach nad hamowaniem synaptycznym.

Po odkryciu GABA, wykazano również, że inne domniemane przekaźniki są związane ze splotami jelita tylnego i wywołują reakcje fizjologiczne. Do takich przekaźników należą dopamina (Elekes i wsp. 1988; Elofsson i wsp. 1968), proktolina (RYLPG-OH; Mercier i wsp., 1997) dwa peptydy orkokininy (NFDEIDRSGFGFNN i AFDEIDRSGFGFN; Bungart i wsp. 1994; Dircksen i wsp. 2000), orkomiotropina (FDAFTTGFamid; Dircksen i wsp. 2000) oraz peptyd miosuppresyny (Mercier i wsp. 1997; najprawdopodobniej pQDLDHVFLRFamid, por. Stemmler i wsp. 2007). Każda z tych substancji moduluje spontaniczne skurcze jelita grubego, a wszystkie z wyjątkiem GABA wydają się być pobudzające. Jelito tylne reaguje również na glutaminian i quisqualate (Jones, 1962; Wrong et al. 2003), ale nie zgłoszono wyraźnych dowodów na unerwienie glutaminergiczne. Wewnątrzkomórkowe przekaźniki, które pośredniczą w działaniu różnych przekaźników, są w dużej mierze niezbadane, ale istnieją dowody na udział cAMP w zdolności dopaminy do wzmacniania skurczów (Knotz i Mercier, 1995).

Chociaż tylne jelito skorupiaka kurczy się spontanicznie po odnerwieniu, takie skurcze są zazwyczaj słabe i niezorganizowane (Wales, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Ruch perystaltyczny wymaga skoordynowanego wyjścia motorycznego z ośrodkowego układu nerwowego, najwyraźniej pochodzącego z ostatniego zwoju brzusznego (Winlow i Laverack, 1972a, b, c). U raków moc motoryczna jest przenoszona do jelita tylnego przez siódmy korzeń^brzuszny, który zawiera 75 aksonów, których ciała komórkowe są zlokalizowane w ostatnim zwoju brzusznym (Kondoh i Hisada, 1986). Przynajmniej część peptydów wydaje się być dostarczana do splotu jelita tylnego z neuronów pochodzących z ostatniego zwoju brzusznego (Dircksen i wsp. 2000; Mercier i wsp. 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), ale dopamina jest dostarczana przez neurony w bardziej przednich zwojach (Mercier i wsp. 1991a). Ponieważ moc motoryczna przez siódmy korzeń^brzuszny jest niezbędna do dużych, skoordynowanych skurczów, jest prawdopodobne, że niektóre lub wszystkie domniemane przekaźniki wymienione powyżej przyczyniają się w jakiś sposób do perystaltyki. Ich względny wkład nie jest jednak znany. Pewien wgląd można uzyskać, badając ich wpływ na mięśnie okrężne i podłużne oddzielnie (Mercier i Lee, 2002).

Oprócz kontrolowania ruchu niestrawionego pokarmu, splot nerwowy związany z jelitem tylnym skorupiaka wydaje się odgrywać ważną funkcję endokrynną związaną z linieniem. Tylne jelito kraba, Carcinus maenas, zawiera komórki endokrynne, które uwalniają hormon hiperglikemiczny skorupiaków i związany z nim peptyd prekursorowy podczas ekdyzy (Webster i in. 2000), co sugeruje rolę w pobieraniu wody i obrzęku związanym z linieniem. W ten sposób jelito tylne skorupiaka uczestniczy w kilku ważnych procesach fizjologicznych.

Ten raport jest przede wszystkim narzędziem nauczania dla zaawansowanych uczniów szkół średnich i studentów na kursach fizjologii, którzy uczestniczą w eksperymentach. Uczniowie, jak również potencjalny mechanizm stojący za tym, jak kurczy się i funkcjonuje jelito tylne, mogą być poruszone. Wykorzystane zostaną środki farmakologiczne, neuroprzekaźniki i neurohormony, a także skonstruowane zostaną krzywe dawka-odpowiedź, które zaangażują studentów w pozyskiwanie i interpretację danych fizjologicznych i farmakologicznych. Można również osiągnąć ogólne zrozumienie funkcji receptora w odniesieniu do agonistów i antagonistów. Studenci nauczą się również prezentować dane w formie graficznej na potrzeby analizy statystycznej.

Bardzo łatwo jest wypreparować i zarejestrować skurcze jelita rakowego. W preparacie wypreparowanym jelito jest łatwo narażone na działanie substancji egzogennych. Zmiany w aktywności perystaltycznej mogą być monitorowane wizualnie lub za pomocą przetwornika siły, który może również monitorować siłę skurczów. Ze względu na swoją prostotę i niezawodność jako preparat do testów biologicznych, jelito grube raka jest nadal bardzo przydatne do badania wielu pytań badawczych dotyczących mechanizmów perystaltyki, modulacji wyjścia motorycznego i skurczu mięśni oraz funkcji receptorów. Jelito tylne jest również przydatne do testowania insektycydów, skorupiaków i zanieczyszczeń pod kątem określonych mechanizmów działania.

2. Metody

2.1) Materiały

• rak
• sól fizjologiczna z raków
• narzędzia do preparacji (grube i drobne nożyczki, kleszcze grube i cienkie)
• Szalka Petriego z dnem Sylgarda
• stalowe kołki preparacyjne
• zlewki (do przechowywania roztworów chemicznych)
• Parafilm (do pokrywania i mieszania roztworów)

2.2) Sekcja

1. Raki (Procambarus clarkii) o długości ciała 6-10 cm należy umieścić na lodzie na 5 do 10 minut w celu znieczulenia zwierzęcia przed rozpoczęciem sekcji.
2. Jedną ręką przytrzymaj znieczulonego raka zza pazurów. Szybko odetnij od oczodołu do środka głowy po obu stronach, a następnie odetnij głowę rakowi (Uwaga: krew z preparatu będzie lepka po wyschnięciu, więc umyj narzędzia po zakończeniu).
   
   Rysunek 1: Dekapitacja raków
3. Odetnij chelipedy i nogi do chodzenia.
4. Odetnij lewą i prawą płetwę ogonową, pozostawiając tylko środkową płetwę ogonową (uropod).
5. Po grzbietowej stronie rak przeciąć brzusznie zarówno po lewej, jak i po prawej stronie naskórka grzbietowego.
   
   Rysunek 2: Usunięcie naskórka grzbietowego
6. Ciąć poprzecznie po grzbietowej stronie naskórka, upewniając się, że cięcie jest płytkie, aby zapobiec uszkodzeniu przewodu pokarmowego. Następnie usuń dolną część grzbietowego naskórka brzusznego.
7. Umieść wypreparowane raki w naczyniu wyłożonym Sylgardem.
8. Przypnij raki do naczynia na końcu płetwy ogonowej. Można użyć więcej kołków po obu stronach G.I., jeśli to konieczne, aby przytrzymać korpus.
9. Napełnij naczynie solą fizjologiczną z raków, przykrywając G.I. Upewnij się, że ciągle polewasz G.I. solą fizjologiczną za pomocą pipety. Sól fizjologiczna to zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936), który jest wytwarzany z 205 mM NaCl; 5,3 mM KCl; 13,5 mM CaCl₂ 2H₂O; 2,45 mM MgCl₂ 6H₂O; 5 mM HEPES i dostosowane do pH 7,4. Wypreparowany rak powinien wyglądać tak, jak pokazano na rysunku 3.
   
   Rysunek 3: Wypreparowane raki z nienaruszonym oznaczeniem geograficznym.

2.3) Eksperymenty

2.3.1) Skurcze u zwierzęcia

1. Przygotować roztwory badanego związku o tej samej temperaturze, co sól fizjologiczna do kąpieli. On może użyć indywidualnych roztworów serotoniny (100 nM, 1 mikroM), glutaminianu (1 mikroM) i dopaminy (1 mikroM) wytwarzanych w soli fizjologicznej raków jako substancji wyjściowych do testów.
2. Pozwól wypreparowanym rakom siedzieć w roztworze raków przez około dziesięć minut, aby mogły dostosować się do szoku wywołanego rozbiorem i ekspozycją na sól fizjologiczną. Powinny zacząć pojawiać się powolne skurcze perystaltyki jelita grubego.
3. Po rozpoczęciu skurczów zapisz liczbę skurczów, które występują w ciągu trzydziestu sekund (zwróć uwagę na rodzaj skurczów, które występują: tj. typ perystaltyki lub spastyka oraz kierunek wszelkich fal perystaltycznych).
   Tabela 1: Skurcze w rakach Saline
   Liczba skurczów Rodzaj skurczów    
4. Za pomocą pipety usuń sól fizjologiczną z jamy odsłoniętego brzucha raków i nałóż sól fizjologiczną zawierającą substancję, która ma być badana, bezpośrednio na jelito tylne.
5. Natychmiast po dodaniu roztworu zapisz liczbę skurczów, które występują po trzydziestu sekundach i zanotuj rodzaj skurczów, które występują (np. perystaltyczne lub spastyczne ).
   Tabela 2: Skurcze z ekspozycją na związki
   Testowany związek koncentracja Liczba skurczów Rodzaj skurczów                        
6. Natychmiast po zarejestrowaniu reakcji na substancję badaną, przepłukać G.I. kilka razy zwykłą solą fizjologiczną z raków. Odstawić preparat na 5 minut, spłukując go co około 30 sekund solą fizjologiczną z raków.
7. Za pomocą pipety umieść sól fizjologiczną zawierającą następny badany związek lub zróżnicowane stężenie ostatniej badanej substancji bezpośrednio na jelicie tylnym. Najlepiej zacząć od niższego stężenia i stopniowo przechodzić do wyższych stężeń.
8. Natychmiast po dodaniu każdej nowej substancji lub każdego nowego stężenia zapisuj liczbę skurczów, które występują po trzydziestu sekundach i zanotuj rodzaj skurczów.

2.3.2) Rejestrowanie sił skurczu w preparatach wycinanych

Rysunek 4: Instalacji

1. Podłącz przetwornik do zasobnika mostka.
2. Przymocuj czujnik mostka do PowerLab 26T.
3. Podłącz PowerLab 26T do portu USB w komputerze.
4. Otwórz LabChart7, klikając ikonę labchart7 na pulpicie.
   • Otworzy się okno LabChart Welcome Center. Zamknij to.
   • Kliknij Konfiguracja
   • Kliknij ustawienia kanału. Zmień liczbę kanałów na 1 (lewy dolny róg box) naciśnij OK.
   • W lewym górnym rogu wykresu ustaw cykle na sekundę na około 2k. Ustaw wolty (y- osi) do około 500 lub 200 mV.
   • Kliknij Kanał 1 po prawej stronie wykresu. Kliknij Wzmacniacz wejściowy. Zapewniać że ustawienia: single-ended, AC sprzężone i odwrócone (odwraca sygnał w razie potrzeby) i wygładzanie , są sprawdzane.
   • Aby rozpocząć nagrywanie, naciśnij start.
5. Weź preparat i przetnij przewód pokarmowy na styku klatki piersiowej i brzucha. Następnie ostrożnie przeciąć część telsonową ogona. Usuń przewód pokarmowy z wypreparowanego raku i umieść go w naczyniu Sylgard. Istnieje naczynie krwionośne, które biegnie wzdłuż grzbietowej części przewodu pokarmowego. Ostrożnie wyciągnij to z przewodu pokarmowego. Do preparatu wlać sól fizjologiczną ze świeżych raków.
6. Umieść przetwornik siły w zacisku w pobliżu wypreparowanego raku.
7. Zaczepić przetwornik siły w raku G.I., jak pokazano na rysunku 5.
   
   Rysunek 5: Izolowane jelito tylne raków w soli fizjologicznej przymocowane do haka przetwornika siły
8. Poczekaj, aż G.I. zacznie się kurczyć, i naciśnij start na LabChart7.
9. Pozwól programowi działać przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz oznaczony: "Tylko sól fizjologiczna". Wypełnij tabelę 4.
   Tabela 4: Skurcze z procentowym składem
   Liczba skurczów Amplituda skurczów (mV)    
10. Dodaj interesujące Cię związki testowe i natychmiast naciśnij "start" na wykresie LabChart7.
11. Pozwól programowi działać przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz bezpośrednio na pliku wykresu, jaka substancja została dodana i jakie jest jej stężenie. Wypełnij poniższą tabelę.
    Tabela 5: Skurcze z _________ związkiem
    Liczba skurczów Amplituda skurczów (mV)    
12. Preparat spłukać solą fizjologiczną z raków za pomocą pipety.
13. W podobny sposób dodawać inne substancje lub różne stężenia. Natychmiast naciśnij "start" na LabChart7.
14. Pozwól programowi działać przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz oraz etykietę bezpośrednio na pliku wykresu, wskazując użyty związek i stężenie.

3. Analiza danych

1. Z 2.3.1 eksperymentu narysuj liczbę skurczów od każdego roztworu (sól fizjologiczna, serotonina, glutaminian) w funkcji czasu. Wyjaśnij wszelkie trendy.
2. Z 2.3.2 eksperymentu proszę przedstawić wykres liczby skurczów z każdego roztworu (sól fizjologiczna, serotonina, glutaminian) w funkcji amplitudy skurczów w mV. Wyjaśnij wszelkie trendy.

3.1 ) Pomiar szybkości i siły skurczów

Aby indeksować tempo skurczów, można zmierzyć czas od początku jednego odchylenia do początku następnego lub policzyć całkowite odchylenia w ciągu minuty lub dwóch. Wartości te można następnie ująć w skurczach na minutę lub na sekundę, w zależności od tego, jak szybko występują.

Aby zindeksować siłę skurczów, można użyć względnej miary do porównania różnych warunków. Na zapisanym pliku można użyć znacznika "M" i przejść do linii bazowej. Następnie użyj kursora i przejdź do szczytu ugięcia i zanotuj wartość podaną w prawym górnym rogu ekranu jako wartość delta (różnica od M do szczytu). Należy pamiętać, że kursor musi być nieruchomy, aby mierzyć zmianę. Następnie przesuń M do następnej interesującej nas formy fali i powtórz pomiar.

Dyskusja

Szczegóły zawarte w powiązanym filmie i tekście opisują kluczowe kroki potrzebne do zarejestrowania aktywności w jelicie tylnym raków in situ , a także in vitro. Jednym z celów naszego raportu jest zwiększenie świadomości na temat potencjału tego preparatu w prowadzonych przez studentów laboratoriach badawczych, które uczą podstawowych pojęć z zakresu fizjologii i farmakologii.

Preparaty te można wykorzystać do zbadania szeregu pytań eksperymentalnych, które doprowadzą do lepszego zrozumienia fizjologicznych funkcji jelita grubego. Mechanizmy leżące u podstaw regulacji fal perystaltycznych i ich odwrócenia nie są jeszcze znane. Mechanizmy większej kontroli całego przewodu pokarmowego również nie są w pełni poznane. Pytanie, w jaki sposób wyższe ośrodki integrują swoją aktywność z autonomicznym wyjściem, które bezpośrednio kontroluje system GI, pozostaje otwartym obszarem badań (Shuranova i in., 2006). Ponadto zdolności osmoregulacyjne jelita grubego skorupiaka oraz funkcje osmoregulacji podczas linienia i stresu środowiskowego nie zostały w pełni wyjaśnione. Jest jeszcze wiele pytań, które czekają na odpowiedzi w tym przygotowaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rak (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standardowa sól fizjologiczna dla raków: zmodyfikowana z roztworu Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2,45 MgCl26H2O; 5 HEPES i dostosowane do pH 7,4. Serotonina, glutaminian i dopamina są wytwarzane w soli fizjologicznej z raków. Wszystkie chemikalia są pozyskiwane z firmy chemicznej Sigma (St. Louis, MO). Narzędzia do preparacji: Pęseta Fine #5, drobne nożyczki, uchwyt ostrza noża, szpilki do owadów #26002-20 (wszystkie uzyskane z Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Szalka Petriego z dnem Sylgarda Zlewki (do przechowywania roztworów chemicznych) Sygnały elektryczne są nagrywane on-line do interfejsu PowerLab 26T interfejsu do komputera (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Używamy standardowego oprogramowania ADInstruments o nazwie Chart lub Scope. Bridge pod dla przetwornika siły (dla różnych typów przetworników siły wymagane są różne czujniki mostkowe). MLT0402 (2 gramy) przetwornik siły to stopień badawczy, jak pokazano na filmie. MLT 0210/D (10 mg-25 gramów) oraz MLT 500/A (0-500g) to przetworniki stopni edukacyjnych (ADInstruments).