Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy materiał jest demonstracją wykorzystania modeli elektrycznych do charakteryzacji błon biologicznych. Ćwiczenie to wprowadza również terminologię biofizyczną stosowaną w elektrofizjologii. W modelu błony wykorzystuje się ten sam sprzęt, co w przypadku preparatów żywych. Badane są wybrane właściwości izolowanego sznura nerwowego: potencjały czynnościowe nerwu, rekrutacja neuronów oraz reaktywność sznura nerwowego na czynniki środowiskowe.
Protokół
1. WSTĘP
1.1) Wprowadzenie
Podstawowa wiedza z zakresu obwodów elektrycznych jest cennym narzędziem pozwalającym zrozumieć i skonceceptualizować wiele aspektów teorii i eksperymentów fizjologicznych. Celem niniejszego ćwiczenia jest zapoznanie z ogólnymi zasadami dotyczącymi źródeł napięcia, oporności elektrycznej oraz pojemności elektrycznej. Te wstępne pojęcia stanowią podstawę do zrozumienia takich zjawisk, jak przekaźnictwo synaptyczne i rozprzestrzenianie się sygnałów elektrycznych wzdłuż włókna nerwowego.
Uwaga: W standardowych codziennych obwodach elektrycznych składających się z metalowych przewodów i rezystorów, PRĄD jest przenoszony przez elektrony, które mają ładunek ujemny. W systemach biologicznych prąd jest przenoszony przez JONY, które mogą mieć jeden lub więcej ładunków dodatnich lub ujemnych. Zgodnie z konwencją prąd płynie od bieguna dodatniego do ujemnego (choć oczywiście elektrony w rzeczywistości poruszają się w przeciwnym kierunku).
Komponenty obwodu reprezentują właściwości elektryczne żywej tkanki, a w niektórych przypadkach obiektów nieożywionych (takich jak elektrody) wykorzystywanych w badaniach.
Podczas wykonywania ćwiczenia zapisuj wyniki i obliczenia w notatkach.
1.2) Zasady ogólne
Podstawowe właściwości obwodów elektrycznych, w których płynie prąd stały, opisuje prawo Ohma
V = IR
Gdzie V = napięcie w woltach (V)
I = natężenie prądu w amperach (A)
R = rezystancja w omach (Ω)
Prawo to opisuje potencjały obserwowane w komórkach nerwowych za pomocą elektrod. W pierwszej kolejności zaprezentujemy prawo Ohma oraz jego zastosowanie w materiałach biologicznych.
1.3) Materiały
| Element | Ilość |
| Płytka stykowa | 1 |
| Rezystory: 30 KΩ | 1 |
| 10 kΩ | 12 |
| 3 kΩ | 6 |
| 2 kΩ | 1 |
| 10 kΩ | 6 |
| 4,7 kΩ | 1 |
| 2,2 kΩ | 1 |
| 1,5 kΩ | 1 |
| 1 kΩ | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| 30 Ω | 1 |
| 20 Ω | 1 |
| 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Kondensatory: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Przewody | 12 |
| PowerLab | 1 |
| Przewody wyjściowe PowerLab | 1 |
| Przewody wejściowe PowerLab | 1 |
| Woltomierz (z funkcją pomiaru natężenia prądu) | 1 |
Klucz do kodowania rezystorów
| Kolor | Cyfra |
| Czarny | 0 |
| Brązowy | 1 |
| Czerwony | 2 |
| Pomarańczowy | 3 |
| Żółty | 4 |
| Zielony | 5 |
| Niebieski | 6 |
| Fioletowy | 7 |
| Szary | 8 |
| Biały | 9 |
| Srebro | Tolerancja 10% |
| Złoto | Tolerancja 5% |
1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Prążek - 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Cyfryzacja
2nd Prążek - 2nd Cyfra
3rd Prążek – liczba zer
4th Zakres – Tolerancja
Rysunek 1: Konfiguracja systemu. Komputer, płytka stykowa oraz PowerLab ze stymulatorem wyjściowym.
System PowerLab (interfejs PowerLab firmy AD Instruments, Australia) będzie służył jako źródło napięcia w tym doświadczeniu. Podłącz kabel USB PowerLab do komputera, włącz urządzenie PowerLab, a następnie uruchom program LabChart z pulpitu. Wybierz opcję „New File”. Pojawi się okno z wieloma kanałami rejestracji. Wybierz „Setup” u góry i kliknij „Channel Settings”. W lewym dolnym rogu okna zmniejsz liczbę kanałów (Number of Channels) do 1; dla kanału 1 zmień zakres (Range) na 5 V. Podłącz kabel stymulatora z dwoma mini-haczykami do portów wyjściowych (Output portals) w PowerLab: czerwony kabel łączący podepnij do dodatniego portu wyjściowego, a czarny kabel łączący do ujemnego portu wyjściowego. Następnie należy zmienić moc wyjściową, częstotliwość i czas trwania impulsu w PowerLab. Aby to zrobić, wybierz „Setup”, a następnie „Stimulator Panel”. Do pierwszej części doświadczenia wymagane są długie impulsy o wartości 1.5 V, dlatego ustaw amplitudę na 0.75 V; zapewni to zakres 1.5 V (PowerLab będzie emitować napięcie wahające się między dodatnimi a ujemnymi 0.75 V). Ustaw częstotliwość (0.5 Hz) oraz czas trwania impulsu (1 s).
Rysunek 2: Schematy płytki stykowej. Kolorowe paski wzdłuż boków są połączone jako jedna całość dla danego koloru. Dwie poziome kolumny w centrum są połączone w każdej połowie dla danego rzędu, ale nie przecinają linii środkowej ani nie łączą się z paskami bocznymi. Każdy rząd w części środkowej jest niezależny od kolejnego rzędu.
Podczas korzystania z płytki stykowej po obu stronach znajdują się dwie kolumny służące do prowadzenia przewodów wejściowych i wyjściowych. Biegun dodatni jest zazwyczaj podłączany do prawej kolumny dodatniej, w której wszystkie otwory są ze sobą połączone. Wejście ujemne podłącza się do przeciwległej strony płytki stykowej, gdzie ponownie wszystkie otwory w kolumnie są ze sobą połączone. W środkowej części, pomiędzy dwoma zestawami kolumn, znajduje się wiele rzędów po pięć pól, z których każde jest niezależne od pozostałych. Wszystkie pola w pięcioelementowym rzędzie są ze sobą połączone, ale odizolowane od innych rzędów. Patrz Rysunek 2. Podświetlone obszary pokazują, które części płytki stykowej są ze sobą połączone. Przydatny film instruktażowy dotyczący obsługi płytki stykowej można znaleźć w internecie pod adresem http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Ćwiczenie 1
Wykorzystaj prawo Ohma do obliczenia NATEŻENIA PRĄDU płynącego w poniższym obwodzie:
Prąd (Sieć 1): ________________A
Ćwiczenie 2
Zmierz napięcie na rezystorze, rezystancję rezystora oraz natężenie prądu płynącego w powyższym obwodzie (Sieć 1).
Rycina 3: Woltomierz Wavetek Meterman.
Odtwórz Układ 1 na płytce stykowej, używając rezystora 150 Ω; urządzenie PowerLab służy jako źródło napięcia (1.5 V). Pomiary napięcia, natężenia prądu i rezystancji wykonuje się za pomocą woltomierza. Aby woltomierz zebrał dokładne dane, zarówno czerwona, jak i czarna sonda muszą stykać się z odsłoniętym przewodem w obwodzie. Ponadto pokrętło należy ustawić na napięcie DC w zakresie odpowiednim dla skali danej konfiguracji eksperymentalnej. W celu pomiaru napięcia należy przyłożyć obie sondy woltomierza do dwóch końców rezystora. Podczas pomiaru rezystancji rezystora (a nie spadku napięcia) należy ODŁĄCZYĆ źródło napięcia i ponownie przyłożyć obie sondy do rezystora. Aby zmierzyć natężenie prądu, woltomierz musi być włączony SZEREGOWO w obwodzie; należy pamiętać, że czerwona i czarna sonda muszą być odpowiednio zorientowane względem kierunku przepływu prądu.
Napięcie (Sieć 1): ________________V
Opór (Sieć 1): ________________Ω
Natężenie prądu (Sieć 1): ________________A
Teraz za pomocą Power Lab zmierz napięcie w obwodzie 2 (takim samym jak obwód 1, ale na płytce stykowej), dokładnie tak, jak zrobiłeś to za pomocą woltomierza. Odłącz woltomierz i podłącz przewody sondy do pomiaru napięcia z czerwonym i czarnym zaciskiem. Następnie użyj kursora, aby kliknąć „Channel 1” (po prawej stronie ekranu). Kliknij i przejdź do sekcji „input amplifier”. Następnie w polu wyboru kliknij przycisk „differential” i ustaw zakres na 5 V. Kliknij „OK”, aby zapisać zmiany.
Kliknij „Start” (prawy dolny róg), aby rozpocząć zbieranie danych. Pomiar odchyleń napięcia można przeprowadzić w dowolnym momencie, zatrzymując proces. Aby zmierzyć zgromadzone napięcie, kliknij „Stop”, a następnie użyj kursora „M” (lewy dolny róg), przesuwając go na linię bazową. Następnie użyj wolnego kursora, aby przesunąć go do górnej krawędzi przebiegu napięcia i zmierzyć amplitudę. Odczytaj zmianę napięcia (ΔV) i zapisz dane na papierze. Wyniki można potwierdzić za pomocą oddzielnego woltomierza.
1.4) Rezystancja i konduktancja w połączeniu szeregowym
Zasada dzielnika napięcia: Spadek napięcia na sumie wszystkich rezystorów połączonych szeregowo jest równy napięciu źródła. Napięcie na każdym poszczególnym rezystorze zależy od ułamka całkowitego oporu, jaki stanowi ten rezystor. Zatem:
Para rezystorów podzieli napięcie w stosunku odpowiadającym ich poszczególnym rezystancjom.
Ćwiczenie 3
Oblicz spadek napięcia na każdym rezystorze w obwodzie nr 3. Zweryfikuj obliczenia, mierząc rzeczywiste napięcie za pomocą woltomierza oraz oprogramowania PowerLab, przy podłączonym źródle napięcia 1,5 V.
UKŁAD 3. Należy użyć dwóch powyższych rezystorów.
| Obliczone: | Zmierzone: |
| Napięcie (na R1):_______V | Napięcie (na R1): ________________V |
| Napięcie (na R2):_______V | Napięcie (na R2): ________________V |
1.5) Przykładowe zastosowanie biologiczne:
Różnice w właściwościach elektrycznych wnętrza komórki oraz roztworu zewnętrznego w aktywnej komórce nerwowej stanowią przykład dzielnika napięcia. Ten biologiczny obwód można badać za pomocą pomiarów wykonywanych elektrodami zewnętrznymi. Aktywny obszar komórki nerwowej, w którym przenikają jony, działa jako źródło napięcia; prąd płynie z tego obszaru wzdłuż wnętrza komórki i powraca przez roztwór zewnętrzny. Zatem między dwoma punktami błony różniącymi się potencjałem występuje przepływ prądu, który z konieczności jest taki sam wewnątrz włókna, jak i na zewnątrz; ponieważ oporność wewnątrz jest większa niż na zewnątrz, to tutaj następuje największy spadek napięcia.
Uwzględnij system oraz jego schemat zastępczy (Rysunek 4: A. i B.):
Obwód równoważny:
Rysunek 4: A (góra). Przepływ prądu elektrycznego przez błonę komórkową. B (dół). Równoważny obwód elektryczny. Źródło napięcia (120 mV) to napięcie błonowe generowane przez potencjał czynnościowy komórki nerwowej.
Uwaga: R0 oraz Ri znajdują się w rzeczywistości w szeregu (a nie w połączeniu równoległym) ze względu na położenie źródła zasilania. Równoważny schemat obwodu przedstawia się następująco:
Rysunek 5: Alternatywny równoważny obwód elektryczny dla rysunku 4A.
Ćwiczenie 4.
Przyjmij, że:
Vm, potencjał błonowy = 120 mV
Ri, opór płynu wewnętrznego = 106 Ω
R0, opór płynu zewnętrznego = 104 Ω
Oblicz V0, potencjał między elektrodami A i B.
V0: ________________V
Ćwiczenie 5.
Korzystając z sieci 4 (patrz poniżej), zmierz potencjały na każdym rezystorze (R0 oraz Ri).
UKŁAD 4. Połącz rezystory 4,7 kΩ i 10 kΩ szeregowo ze źródłem napięcia 1,5 V:
Zmierz napięcia za pomocą woltomierza.
Napięcie (na rezystorze R)0): ________________V
Napięcie (na R)i): ________________V
UKŁAD 5 : Taki sam jak Układ 4, z wyjątkiem R0 = 1 K Ω
Należy zauważyć, że w Układzie 5 rezystancja zewnętrzna jest znacznie niższa (co odpowiada obecności dużej ilości płynu lub nieaktywnej tkanki tworzącej bocznik dla elektrod), stąd znaczenie rejestracji sygnałów z nerwów w powietrzu lub w oleju izolacyjnym, aby zwiększyć rezystancję zewnętrzną.
Napięcie (na R0): ________________V
Napięcie (na Ri): ________________V
1.6) Opór i przewodność w połączeniach szeregowych i równoległych
Przykładowe zastosowanie biologiczne:
Dobrym przykładem rezystorów połączonych szeregowo i równolegle jest konfiguracja elektryczna synapsy chemicznej. Przesyłanie sygnałów elektrycznych nie jest możliwe w większości synaps ze względu na efekt bocznikowania szczeliny synaptycznej. Należy jednak zauważyć, że bocznik ten jest prawdopodobnie niezbędny, aby umożliwić wytworzenie dużego potencjału w błonie presynaptycznej, co wiąże się z uwalnianiem neuroprzekaźnika.
Rysunek 6: Model przepływu elektrochemicznego przez synapsę.
Należy pamiętać, że w żywej tkance znaczące opory elektryczne powstają na błonach oraz w ograniczonych przestrzeniach pozakomórkowych. Stosunkowo duże przestrzenie wypełnione cieczą, takie jak cytoplazma komórki lub roztwory kąpielowe, nie stanowią znaczących oporów.
Ćwiczenie 6.
Układ 6 (patrz powyżej oraz Płytka drukowana) jest analogiem chemicznej synapsy przekaźnikowej. W synapsach elektrycznych szczelina synaptyczna (opór bocznikowy Rs) jest wyeliminowana, a prąd płynie bezpośrednio z komórki presynaptycznej do postsynaptycznej przez Rm1 i Rm2, a następnie przez Rm3. Tłumienie układu można łatwo zmierzyć dla różnych wartości rezystorów, co ilustruje różnice między poszczególnymi synapsami. Podłącz urządzenie PowerLab do źródła 1.5V (tj. ustawienie 0.75 Volt).
- Zmierz różnicę potencjałów (PD) na każdym rezystorze w sieci zgodnie z instrukcją, używając multimetru. Zanotuj wartości rezystorów. Zwróć szczególną uwagę na PD na Rm3 (membrana komórki postsynaptycznej). Napięcie: ________________V
- Zastąp rezystor 30 Ω w punkcie Rs rezystorem 330K Ω. Zmierz PD w punkcie Rm3.
- Teraz, utrzymując Rs na poziomie 30K Ω, zastąp rezystor 30K Ω w punkcie Rm2 rezystorem 3K Ω. Zmierz PD na Rm3. Napięcie: ________________V
- Teraz, utrzymując Rs na poziomie 30K Ω oraz Rm2 na poziomie 33K Ω, zastąp rezystor 2K Ω w punkcie R m1 rezystorem 20 Ω. Zmierz PD na Rm3. Napięcie: ________________V
Ćwiczenie 7
Przykład szeregowo-równoległej sieci rezystancyjnej występuje podczas analizy właściwości kablowych włókna nerwowego lub mięśniowego. STAŁA DŁUGOŚCI włókna to odległość, na której różnica potencjałów (PD) przez błonę spada do 37% swojej wartości początkowej. Tłumienie wynika z faktu, że rezystancje wewnętrzna i zewnętrzna płynu po obu stronach błony są bocznikowane przez (stosunkowo wysoką) poprzeczną rezystancję błony. Wartość tej rezystancji ogranicza przesyłanie sygnału wzdłuż aksonu komórki nerwowej. Stała długości wynosi 1/e w pomiarze dla zaniku wykładniczego. dE/dT=-E/RC; gdzie E to różnica napięć, R to rezystancja, a C to pojemność. Lub w innej formie E=Eoexp (-t/RC); gdzie Eo to napięcie początkowe, a t to czas w sekundach. RC określa się również jako tau (τ), czyli stałą czasową.
Zakładając, że opór płynu zewnętrznego jest pomijalny w porównaniu do oporów wewnątrzkomórkowych i błonowych, pasywne właściwości rezystancyjne błony można przedstawić za pomocą następującego obwodu:
Rycina 7: Implementacja Sieci 7 na układzie na płytce stykowej.
Przyłoż napięcie na jednym końcu Sieci 7 pomiędzy punktami A i B. Użyj stymulatora, wybierając impuls o czasie trwania 1 s, amplitudzie 1 V (ustawionej na 0,5 V) i częstotliwości 0,75 Hz. Podłącz woltomierz kolejno przez każdy rezystor „błonowy” i odnotuj różnicę potencjałów (PD) na tym rezystorze. Pozostaw jeden koniec sondy woltomierza nieruchomo w punkcie (przewód A, czerwony), podczas gdy drugi przewód przesuwaj kolejno przez lokalizacje 1–5. Przedstaw każdą wartość na wykresie zależności różnicy potencjałów (PD) od „odległości” od źródła, przyjmując, że rezystory błonowe są oddalone od siebie o jednostkę odległości. Na podstawie wykresu wyznacz stałą czasową tego obwodu. 
Wykres stałej długości sieci 7:______________
Efektem zwiększenia poprzecznego oporu błony, co dzieje się w przypadku obecności osłonki mielinowej, lub zmniejszenia podłużnego oporu wewnętrznego włókna związanego ze zwiększeniem jego średnicy, jest zmiana stałej długości. Wartości rezystorów nie odpowiadają wartościom faktycznie występującym w aksonie nerwowym, lecz są do nich w przybliżeniu proporcjonalne. Podobnie „jednostka odległości” w modelu jest znacznie zwiększona w stosunku do rzeczywistej komórki nerwowej.
1.7) Pojemność
Kondensatory magazynują ładunek. Jeśli do kondensatora przyłożono napięcie poprzez rezystor, do kondensatora zaczyna płynąć prąd, a różnica potencjałów (PD) na kondensatorze rośnie wykładniczo w czasie, dążąc do wartości PD źródła; przebieg czasowy tej zmiany napięcia zależy od przyłożonego napięcia, pojemności oraz rezystancji szeregowej. Podobny, lecz odwrócony przebieg czasowy obserwuje się podczas rozładowywania kondensatora.
Podłącz wejście tej prostej sieci opornościowo-pojemnościowej (RC) do stymulatora w punktach A i B. Użyj impulsów o wartości 1V (ustawionych na 0,5V) o czasie trwania 1s i częstotliwości 0,75Hz. Należy również ustawić szybkość próbkowania na 20 K/s (po prawej stronie panelu). Podłącz zaciski wejściowe PowerLab równolegle do kondensatora. Rejestruj sygnał przez kilka sekund, a następnie zatrzymaj pomiar. Użyj okna Zoom, aby powiększyć czas narastania jednego z impulsów prostokątnych. Powiększanie może wymagać powtórzenia kilka razy w celu rozciągnięcia przebiegu. Zmierz czas narastania od linii bazowej do szczytu przebiegu napięcia w momencie jego stabilizacji. Zaobserwuj przebieg zmian potencjału oraz zniekształcenie impulsów prostokątnych. Zaobserwuj efekt zmiany... 10μF kondensator dla jednego z 0.1 μFPodłączając sondę woltomierza laboratoryjnego równolegle do rezystora, można obserwować przebieg czasowy przepływu prądu w obwodzie. Należy zarejestrować tylko kilka impulsów, a następnie zatrzymać pomiar. Użyj kursora „M”, aby przejść do linii bazowej przed wzrostem, oraz kursora swobodnego, aby zaznaczyć miejsce, w którym napięcie zaczyna się stabilizować.
Ostatni przykład obejmuje zarówno komponenty rezystywne, jak i pojemnościowe. Pasywne właściwości kablowe włókien nerwowych i mięśniowych są determinowane przez podobne elementy, wynikające z właściwości błony komórkowej. W komórce występuje nie tylko poprzeczna rezystancja błony, ale także pojemność błony, wynikająca z właściwości elektrycznych błony komórkowej. Efektem tego jest wpływ na przebieg czasowy rozwoju potencjałów rozprzestrzeniających się elektrotonicznie.
Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Tę sieć można skonstruować na podstawie Sieci 7, dołączając odpowiednie kondensatory równolegle do rezystorów błony (Rm).
Ćwiczenie 8.
Podłącz kondensatory 10 μF do Sieci 7. Używając impulsów o czasie trwania 1s, napięciu 1V (ustawienie 0,5 V) i częstotliwości 0,75Hz ze stymulatora, który powinien zostać podłączony w punktach A i B, obserwuj zmiany potencjału na każdym rezystorze błony. Przyjmując, że napięcie „progowe” (napięcie, przy którym w komórce nerwowej generowany jest potencjał czynnościowy) wynosi 0,2V, zmierz czas potrzebny do osiągnięcia wartości progowej przez potencjał na każdym rezystorze błony. Próg oznacza tutaj wartość potencjału, przy której w żywej komórce może zostać wygenerowany potencjał czynnościowy. Przedstaw wyniki na wykresie zależności czasu od „odległości”.
Rysunek 8: Implementacja sieci 9 na układzie na płytce stykowej.
Wykres do Rysunku 8.
Symuluj efekt spadku pojemności błony wywołany zwiększeniem grubości osłonki mielinowej, zastępując kondensatory mniejszymi o wartości 0,1μF. Zwróć uwagę na zmianę czasu osiągnięcia progu przy wybranym rezystorze. Nałóż uzyskane dane na ten sam wykres, na którym znajdują się wyniki dla większych kondensatorów.
W przypadku błony mięśniowej można myśleć o zwiększonej pojemności wynikającej ze zwiększenia powierzchni błony poprzez związane z nią kanaliki T, co skutkuje większą pojemnością błony w porównaniu z neuronem. Mniejsze kondensatory mogą służyć do zilustrowania zmniejszonej pojemności wynikającej z dodania mieliny do niezmielinizowanego aksonu nerwowego. Głównym punktem do zapamiętania jest to, że pojemność elektryczna jest proporcjonalna do powierzchni i odwrotnie proporcjonalna do grubości warstwy dielektrycznej (mieliny), która oddziela „płyty” lub powierzchnie magazynujące kondensatora.
Właściwości przedstawione na modelu obwodu obserwuje się w preparatach żywych. Jednakże komórki różnią się swoimi właściwościami, takimi jak przeciek przez błonę oraz oporność osiowa. Niektóre komórki nie generują potencjałów czynnościowych. Niemniej jednak potencjał czynnościowy jest wytwarzany, gdy sygnał musi zostać przesłany na odległość kilku milimetrów, ponieważ pasywne właściwości elektryczne komórek tłumią sygnały na takim dystansie. W kolejnej serii doświadczeń zilustrowano rejestrację potencjałów czynnościowych.
1.8) Pytania dla studentów
- Jakie są typowe wartości stałej długości dla neuronów i komórek mięśniowych?
- Co by się stało, gdyby błona miała niską rezystancję błonową: czy zmieniłaby się stała czasowa (czas osiągnięcia 63% wartości końcowej)? Jeśli tak, to w jaki sposób zmieniłaby się przy niższej rezystancji błonowej? Jaki jest ogólny wzór matematyczny na stałą czasową (tau)?
- Dlaczego większe aksony, takie jak gigantyczny akson kalmara, mogą przewodzić sygnały elektryczne szybciej niż mniejsze aksony w tym samym preparacie kalmara?
2. WŁAŚCIWOŚCI PRZEWODZENIA KOMÓREK NERWOWYCH
2.1) Od makiety elektronicznej do żywych komórek
Właściwości pasywne zademonstrowane w ćwiczeniach z płytką obwodową można zmierzyć również w żywych komórkach; jednak wyodrębnienie tych właściwości może być utrudnione, gdy towarzyszą im potencjały czynnościowe w komórkach nerwowych. Właściwości aktywne neuronu to zdolność do utrzymywania spoczynkowego potencjału błonowego, generowania potencjałów czynnościowych oraz ich regeneracji wzdłuż błony.
Przepływ elektryczny wzdłuż sznura nerwowego może być również regeneracyjny w obrębie poszczególnych neuronów oraz między kolejnymi neuronami. W brzuszny sznurze nerwowym (VNC) homara niektóre neurony komunikują się za pomocą złączy szczelinowych (septate junctions). Jak wykazano w poprzednich ćwiczeniach z płytką stykową, zmiana rezystancji może utrudnić przewodzenie sygnałów elektrycznych. Jest to analogiczne do zmiany przepływu prądu przez złącza szczelinowe w obrębie brzusznego sznura nerwowego.
W kolejnej serii doświadczeń zbadano prędkość przewodzenia oraz inne właściwości złożonego potencjału czynnościowego w VNC. Przedstawimy sposób pozyskania VNC do eksperymentów oraz metodę wywoływania i pomiaru odpowiedzi z wykorzystaniem standardowego sprzętu przeznaczonego do zajęć laboratoryjnych dla studentów.
2.2) Preparacja raka
Do tego eksperymentu najlepiej nadaje się brzuszny sznur nerwowy raka. Nerw ten jest łatwy do wypreparowania, a w przypadku tej preparacji można zastosować różnorodne protokoły wpływające na przewodnictwo. Przed rozpoczęciem eksperymentu zapoznaj się z poniższymi terminami dotyczącymi anatomii raka:
Rycina 9. Schemat ogólnej anatomii raka.
Zmodyfikowano z: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Podstawy przewodzenia w nerwie
Brzuszny sznur nerwowy raka służy do przesyłania sygnałów inicjujących reakcje ucieczkowe, takie jak odruch gwałtownego ugięcia ogona. W tym doświadczeniu rejestracje będą pobierane z całego, nienaruszonego sznura nerwowego. Poszczególne potencjały z każdego neuronu w obrębie sznura nerwowego sumują się, tworząc złożony potencjał czynnościowy, który generuje mierzalne impulsy elektryczne wyświetlane przez oprogramowanie rejestrujące. Erlanger, Gasser i Bishop (1924) należą do pionierów, którzy opisali złożone potencjały czynnościowe. Przedstawiono charakterystykę okresu refrakcji, prędkość przewodzenia oraz neuronalne efekty działania inhibitora połączeń szczelinowych 1-heptanolu lub temperatury. Poznanie podstawowych zasad przesyłania sygnałów w komórkach nerwowych przyczynia się do lepszego zrozumienia funkcji neurologicznych w ujęciu ogólnym (Bennett, et al., 191; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).
2.4) Materiały
| Element | Ilość |
| Duży rak (Procambarus clarkii) | 1 |
| Precyzyjne nożyczki preparacyjne | 1 |
| Pinceta | 1 |
| Komora nerwowa MLT016/X | 1 |
| Laptop z oprogramowaniem Scope | 1 |
| PowerLab | 1 |
| Wzmacniacz PowerLab | 1 |
| Kabel wyjściowy stymulatora dla PowerLab | 1 |
| Konektor USB PowerLab/Komputer | 1 |
| Statyw manipulatora z elektrodą ssącą | 1 |
| Pipeta szklana z gruszką | 1 |
| Zlewka z roztworem soli fizjologicznej dla raków | 1 |
2.5) Metody
2.5.1) Disekcja
Przed przystąpieniem do sekcji raka należy upewnić się, że przygotowano naczynie do preparatów nerwowych, niezbędne instrumenty oraz odpowiednie roztwory.
- Owinięto raków w wilgotny ręcznik papierowy w celu ich unieruchomienia lub po prostu trzymano raka w jednej dłoni, z chelipedami (szczypcami) pomiędzy kciukiem a palcem wskazującym.
- Drugą ręką wykonaj nożyczkami nacięcie przez rostrum pomiędzy oczodołami.
- Przetnij w dół od miejsca nacięcia, aż do całkowitego oddzielenia głowy.
- Należy wykonać nacięcie u podstawy głowotułowia powyżej odwłosa, a następnie usunąć ogon. (W razie potrzeby można usunąć szczypce i odnóża kroczne, aby ułatwić ten proces).
- Usuń pływakiki.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż obu stron brzusznej części jamy brzusznej. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić głębszych tkanek.
- Odchyl uwolnioną sekcję egzoszkieletu aż do podstawy wachlarza ogonowego, aby odsłonić brzuszny sznur nerwowy.
- Używając krawędzi pęsety, ostrożnie usuń brzuszny sznur nerwowy, chwytając go za końcówkę. Należy uważać, aby nie rozciągnąć ani nie zmiażdżyć sznura nerwowego. (Wszelkie zgrubienia zaobserwowane na sznurze nerwowym to zwoje nerwowe raka).
- Ułóż sznur nerwowy na metalowych prętach w komorze nerwowej. Niezbędne jest utrzymanie brzusznego sznura nerwowego w stanie wilgotnym. Aby to osiągnąć, dodaj do komory nerwowej tyle soli fizjologicznej dla raka, aby poziom cieczy zrównał się z metalowymi poprzeczkami. Następnie pipetą odessij taką ilość soli fizjologicznej, aby poziom cieczy zaledwie stykał się z dolną krawędzią prętów.
Sól fizjologiczna dla raka (mM: 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2)2.2H2O; 2,45 MgCl22.6H2O; 5 HEPES o pH skorygowanym do 7,4) - Po umieszczeniu nerwu, podłącz kabel stymulatora z dwoma elektrodami w formie mini-haczyków do komory nerwu. Przymocuj dodatnią czerwoną elektrodę do jednej z zewnętrznych metalowych pętli znajdujących się w pobliżu końca sznura nerwowego; przymocuj ujemną czarną elektrodę do najbliższej sąsiedniej pętli metalowej, która nadal pozostaje w kontakcie ze sznurem nerwowym.
- Umieść elektrodę ssącą wewnątrz manipulatora w pobliżu przeciwległego końca nerwu.
- Ostrożnie wciągnij końcówkę brzusznego sznura nerwowego do elektrody rejestrującej.
2.5.2) Rejestracja
Po wessaniu końcówki sznura nerwowego do elektrody rejestrującej należy upewnić się, że elektroda jest przymocowana do sondy, a sonda jest odpowiednio uziemiona. Można to osiągnąć, po prostu podłączając kabel uziemiający do klatki Faradaya. Przewody dodatniej i ujemnej elektrody ssącej powinny zostać również podłączone do odpowiednich miejsc w sondzie. Sonda powinna zostać podłączona do wzmacniacza różnicowego, który z kolei jest połączony z systemem PowerLab.
Podłącz przewody elektryczne z elektrody ssącej do wzmacniacza głowowego (head stage). Przewody należy podłączyć następująco: czerwony (dodatni) w lewym górnym rogu, zielony (masa) w środku, czarny (ujemny) na dole. Jest to przedstawione na rysunku 10 dla poniższego wzmacniacza głowowego. Przewód masy można po prostu umieścić w kąpieli solnej. W związku z tym jeden przewód z elektrody ssącej należy podłączyć do wejścia +, a drugi do wejścia -. Nie ma znaczenia, który z przewodów z elektrody ssącej zostanie podłączony do wejścia + lub -.
Rycina 10: Wejścia stopnia głowicowego
Ustawienia wzmacniacza są następujące:
| KONTROLA | USTAWIENIA |
| Filtr górnoprzepustowy | DC |
| Filtr zaporowy | WYŁ. |
| Filtr dolnoprzepustowy | 20 kHz |
| Pomiar pojemności | Przeciwnie do ruchu wskazówek zegara |
| Pokrętło precyzyjnego i grubego ustawiania offsetu DC | Przeciwnie do ruchu wskazówek zegara |
| Przesunięcie stałoprądowe (+OFF) | WYŁ. |
| Pokrętło wzmocnienia | 50 |
| Wejście (RÓŻNICOWE MONO UZIEMione) | RÓŻNICA |
| TRYB(STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | WYŁ. |
Podłącz dołączony kabel USB do tylnego panelu urządzenia PowerLab oraz do gniazda komputera. Uruchom oprogramowanie Scope na pulpicie komputera. W prawym górnym rogu ekranu wybierz „Channel 2” i wyłącz go. Dostosuj ekran tak, aby widoczny był tylko Channel 1, przesuwając pasek znajdujący się na środku ekranu w dół. Następnie kliknij „Input Amplifier” dla kanału 1 w prawym górnym rogu ekranu. Wybierz następujące parametry:
| KONTROLA | USTAWIENIA |
| ZAKRES | 50 mV |
| AC | SPRAWDZONE |
| FILTR DOLNOPRZEPUKOWY | WYŁ. |
| JEDNOSTRONNY | SPRAWDZONE |
| ODWRÓĆ | SPRAWDZONE |
Następnie, ponownie w sekcji „Set up”, kliknij „Sampling”. W polu zatytułowanym „Sweep” na pojawiającym się ekranie wybierz następujące opcje:
| KONTROLA | USTAWIENIA |
| TRYB | WIELOKROTNE |
| PRÓBKA | 10 POMIARÓW |
| Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. |
| OPÓŹNIENIE | 0 SEKUND |
Na koniec, w zakładce „Set up”, wybierz „Stimulator”. Kliknij w pole, aby wyłączyć funkcję „Isolated Stim”. Wybierz następujące ustawienia:
| KONTROLA | USTAWIENIE |
| TRYB | WIELOKROTNY |
| OPÓŹNIENIE | 5 ms |
| CZAS TRWANIA | 1 ms |
| IMPULS(Y) | 2 |
| ODSTĘP | 15 ms |
| ZAKRES | 5 V |
| AMPLITUDA | 0.5 |
Patrz na sekcję „Time Base” w panelu po prawej stronie. Zmień wartość „Sample” na 1024, a „Time” na 20 msec.
Rycina 1: Dwa potencjały czynnościowe złożone z 15 ms odstępem między bodźcami, zarejestrowane za pomocą oprogramowania Scope.
Ćwiczenie 1.
Wybierz przycisk „Start” w lewym dolnym rogu ekranu. Przy powyższych ustawieniach w oknie zbierania danych Scope powinien pojawić się wyraźnie zdefiniowany złożony potencjał czynnościowy (rycina 1). Naszkicuj ogólny kształt potencjału czynnościowego na poniższym wykresie (rycina 12):
Rysunek 12: Pusty wykres do naszkicowania kształtu złożonego potencjału czynnościowego.
Powoli zmniejszaj napięcie, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu. Amplituda potencjału czynnościowego powinna maleć, aż jego charakterystyczny wzór fali również zniknie. Zmniejszenie napięcia redukuje liczbę neuronów zaangażowanych w generowanie złożonego potencjału czynnościowego. Większe aksony są prawdopodobnie rekrutowane przy niższych napięciach i są to włókna o szybszym przewodzeniu, które mają tendencję do pojawiania się jako pierwsze w złożonym potencjale czynnościowym. Stopniowo zwiększaj napięcie, aby zaobserwować efekt przeciwny; w miarę rekrutacji większej liczby neuronów fala złożonego potencjału czynnościowego staje się większa. To ćwiczenie ilustruje fakt, że poszczególne neurony mają różne progi generowania potencjału czynnościowego. Gdy złożony potencjał czynnościowy nie zwiększa się już przy dalszym wzroście napięcia stymulującego, oznacza to, że wszystkie neurony zostały zrekrutowane; na ekranie komputera powinny być wówczas widoczne dwa wyraźne piki fali potencjału czynnościowego.
Ćwiczenie 2.
Po zbadaniu rekrutacji neuronów i wynikającego z niej potencjału czynnościowego złożonego, zaobserwuj efekt okresu refrakcji. Można to zrobić, podając dwa bodźce w krótkich odstępach czasu i zmieniając interwał międzybodźcowy, a następnie obserwując, przy jakim interwale potencjał czynnościowy złożony wywołany przez drugi bodziec ma zmniejszoną amplitudę w porównaniu do pierwszego potencjału czynnościowego złożonego. Zmieniaj opóźnienie między impulsami za pomocą karty w lewym górnym rogu ekranu. Skracaj opóźnienie tak długo, aż drugi potencjał czynnościowy złożony przestanie być wywoływany. Czas między impulsami, przy którym drugi potencjał czynnościowy nie jest już wywoływany, to absolutny okres refrakcji. Czas od końca absolutnego okresu refrakcji do momentu, w którym drugi bodziec generuje potencjał czynnościowy o pełnej amplitudzie, nazywa się względnym okresem refrakcji. Podaj szacunkowe wartości absolutnego i względnego okresu refrakcji w wyznaczonych miejscach.
Absolutny okres refrakcji: ___________________
Względny okres refrakcji: ___________________
2.5.3) Pomiar prędkości przewodzenia
Za pomocą linijki milimetrowej zmierz odległość między drutem stymulującym znajdującym się najbliżej elektrody rejestrującej a samą elektrodą rejestrującą. Na podstawie zarejestrowanego śladu zmierz czas do poszczególnych szczytów zdarzeń w potencjale złożonym, aby móc obliczyć prędkość przewodzenia poszczególnych sygnałów elektrycznych. Przelicz odległość z mm na metry, a czas z msec na sekundy, aby otrzymać jednostki m/s.
Prędkość przewodzenia 1.szej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 2.iej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 3.iej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 4.tej fali: __________________
2.5.4) Manipulacja złączami szczelinowymi i/lub prędkością przewodzenia
Następnie zbadaj właściwości inhibitora neuronalnego. Efekt rozsprzęgania przez heptanol został po raz pierwszy opisany w aksonach z przegrodami (tj. złączach szczelinowych) raka przez Johnston et al. (1980). Efekt ten, związany z komunikacją elektryczną, został wkrótce potwierdzony w różnych układach kręgowców i bezkręgowców (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Aby zrozumieć rolę komunikacji elektrycznej w tym brzusznym sznurze nerwowym, do rozsprzęgnięcia złączy szczelinowych można użyć soli fizjologicznej z dodatkiem (1mM) 1-heptanolu. Za pomocą szklanej pipety opłucz cały sznur nerwowy roztworem heptanolu. Obserwuj zmianę zarejestrowaną przez oprogramowanie Scope i podsumuj ją. (Zwróć uwagę na zmianę kształtu fali oraz na to, czy zmieniła się prędkość przewodzenia tych fal). Alternatywnie, zamiast stosowania 1-heptanolu, można zastąpić sól kąpielową lodowatą solą fizjologiczną i monitorować wszelkie zmiany w kształcie fali lub prędkości przewodzenia fal.
Dyskusja
Naszym celem w prezentacji wideo online oraz w niniejszej pracy jest wykazanie, że właściwości biofizyczne komórek mogą być częściowo modelowane jako obwody elektryczne. Ponadto, dzięki zastosowaniu stosunkowo łatwo dostępnej żywej tkanki nerwowej, możliwe jest wprowadzenie do laboratoriów dla studentów studiów licencjackich fundamentalnych zasad dotyczących prędkości przewodzenia, okresów refrakcji i technik rejestracji elektrofizjologicznej przy niewielkich nakładach na sprzęt. Przedstawione zagadnienia i podstawowe paradygmaty mogą być łatwo dostosowane do wymagań różnych kursów.
Utrzymywanie raków oraz ich powszechność sprawiają, że są one atrakcyjnymi modelami do eksperymentów prowadzonych przez studentów. Brzuszne sznury nerwowe skorupiaków są zazwyczaj wytrzymałe i zachowują integralność fizjologiczną w minimalnym roztworze soli przez wiele godzin, co jest wystarczające dla 3-godzinnych zajęć laboratoryjnych dla studentów.
Biorąc pod uwagę, że niektóre z dużych aksonów w VNC homara są połączone za pomocą złączy szczelinowych, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty dotyczące ich wkładu i wykazać inne właściwości niż te występujące w standardnym preparacie nerwu kulszowego żaby. Nerw kulszowy jest klasycznym modelem do badania złożonych potencjałów czynnościowych oraz właściwości przewodzenia. Dla studentów interesującym eksperymentem porównawczym mogłoby być zestawienie właściwości przewodzenia, rekrutacji aksonów oraz okresów refrakcji w obu tych preparatach.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Do przeprowadzenia tych eksperymentów wykorzystano zmodyfikowane procedury z podręcznika laboratoryjnego stosowanego w kursie organizowanym przez dr. H.L. Atwooda na Katedrze Zoologii Uniwersytetu w Toronto. Ćwiczenia zostały również opracowane i zmodyfikowane na podstawie podręcznika przygotowanego na „6th INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE”, który odbył się na Uniwersytecie Korea w Seulu, w Korei Południowej w 1993 roku (Cooper et al., 1993). Obecne modyfikacje były konieczne, aby dostosować procedury do sprzętu powszechnie dostępnego w dzisiejszych laboratoriach studenckich na różnych uniwersytetach. Projekt wspierany przez Uniwersytet Kentucky, Katedrę Biologii, Biuro Studiów licencjackich oraz Kolegium Nauk i Sztuk.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Płyta obwodowa | |||
| |||
Doświadczenia z zakresu fizjologii | |||
|
Bibliografia
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
- Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
- Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
- Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
- Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
- Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
Przedruki i uprawnienia
