Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy materiał jest demonstracją wykorzystania modeli elektrycznych do charakteryzacji błon biologicznych. Ćwiczenie to wprowadza również terminologię biofizyczną stosowaną w elektrofizjologii. W modelu błony wykorzystuje się ten sam sprzęt, co w przypadku preparatów żywych. Badane są wybrane właściwości izolowanego sznura nerwowego: potencjały czynnościowe nerwu, rekrutacja neuronów oraz reaktywność sznura nerwowego na czynniki środowiskowe.
Protokół
1. WSTĘP
1.1) Wstęp
Podstawowa wiedza na temat obwodów elektrycznych jest cennym narzędziem pozwalającym zrozumieć i zkonceptualizować wiele aspektów teorii i eksperymentów fizjologicznych. Celem niniejszego ćwiczenia jest zapoznanie z ogólnymi zasadami dotyczącymi źródeł napięcia, rezystancji elektrycznej oraz pojemności elektrycznej. Te wstępne pojęcia stanowią podstawę do zrozumienia takich zjawisk, jak przewodzenie synaptyczne i rozprzestrzenianie się sygnałów elektrycznych wzdłuż włókna nerwowego.
Ostrzeżenie: W standardowych codziennych obwodach elektrycznych składających się z metalowych przewodów i rezystorów PRĄD jest przenoszony przez elektrony, które mają ładunek ujemny. W systemach biologicznych prąd jest przenoszony przez JONY, które mogą mieć jeden lub więcej ładunków dodatnich lub ujemnych. Zgodnie z konwencją prąd płynie od bieguna dodatniego do ujemnego (choć oczywiście elektrony w rzeczywistości poruszają się w przeciwnym kierunku).
Komponenty obwodu reprezentują właściwości elektryczne żywej tkanki, a w niektórych przypadkach obiektów nieożywionych (takich jak elektrody) wykorzystywanych w jej badaniu.
Podczas wykonywania ćwiczenia należy zapisywać wyniki i obliczenia.
1.2) Zasady ogólne
Podstawowe właściwości obwodów elektrycznych, w których płynie prąd stały, opisuje prawo Ohma
V = IR
Gdzie V = napięcie w woltach (V)
I = natężenie prądu w amperach (A)
R = rezystancja w omach (Ω)
Prawo to reguluje potencjały obserwowane w komórkach nerwowych za pomocą elektrod. W pierwszej kolejności zaprezentujemy prawo Ohma oraz jego zastosowanie w materiałach biologicznych.
1.3) Materiały
| Element | Ilość |
| Płytka stykowa | 1 |
| Rezystory: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Kondensatory: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Przewody | 12 |
| PowerLab | 1 |
| Przewody wyjściowe PowerLab | 1 |
| Przewody wejściowe PowerLab | 1 |
| Woltomierz (z funkcją pomiaru prądu) | 1 |
Klucz kodowania rezystorów
| Kolor | Cyfra |
| Czarny | 0 |
| Brązowy | 1 |
| Czerwony | 2 |
| Pomarańczowy | 3 |
| Żółty | 4 |
| Zielony | 5 |
| Niebieski | 6 |
| Fioletowy | 7 |
| Szary | 8 |
| Biały | 9 |
| Srebrny | Tolerancja 10% |
| Złoty | Tolerancja 5% |
1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Prążek - 1st Cyfra
2nd Pasmo - 2nd Cyfra
3rd Prążek – liczba zer
4th Przedział - Tolerancja
Rycina 1: Konfiguracja systemu. Komputer, płytka stykowa i zasilacz laboratoryjny ze stymulatorem wyjściowym.
System PowerLab (interfejs PowerLab firmy AD Instruments, Australia) będzie służył jako źródło napięcia w tym eksperymencie. Podłącz kabel USB PowerLab do komputera, włącz urządzenie PowerLab i uruchom program LabChart z pulpitu. Wybierz opcję „New File”. Pojawi się okno z wieloma kanałami rejestracji. Wybierz zakładkę „Setup” u góry i kliknij „Channel Settings”. W lewym dolnym rogu okna zmniejsz liczbę kanałów (Number of Channels) do 1; dla kanału 1 zmień zakres (Range) na 5 V. Podłącz kabel stymulatora z dwoma mini-haczykami do portów wyjściowych (Output) w PowerLab: czerwony przewód podłącz do dodatniego portu wyjściowego, a czarny do ujemnego portu wyjściowego. Następnie należy zmienić moc wyjściową, częstotliwość i czas trwania impulsu w PowerLab. Aby to zrobić, wybierz „Setup”, a następnie „Stimulator Panel”. Do pierwszej części eksperymentu wymagane są długie impulsy o wartości 1,5 V, dlatego ustaw amplitudę na 0,75 V; zapewni to zakres 1,5 V (PowerLab będzie emitować napięcie wahające się między wartościami +0,75 V a -0,75 V). Ustaw częstotliwość (0,5 Hz) oraz czas trwania impulsu (1 s).
Rycina 2: Schematy płytki stykowej. Kolorowe paski wzdłuż boków są połączone w jedną całość dla danego koloru. Dwie poziome kolumny w centrum są połączone w każdej połowie dla danego rzędu, ale nie przechodzą przez linię środkową ani do pasków bocznych. Każdy rząd w części środkowej jest niezależny od następnego rzędu.
Podczas korzystania z płytki stykowej po obu stronach znajdują się dwie kolumny służące do podłączenia przewodów wejściowych i wyjściowych. Biegun dodatni jest zazwyczaj podłączany do prawej kolumny dodatniej, w której wszystkie otwory w obrębie kolumny są ze sobą połączone. Wejście ujemne podłącza się do przeciwległej strony płytki stykowej, gdzie ponownie wszystkie otwory w kolumnie są połączone. W środku, pomiędzy dwiema grupami kolumn, znajduje się wiele rzędów po pięć ogniw, z których każde jest niezależne od pozostałych. Wszystkie ogniwa w pięcioelementowym rzędzie są ze sobą połączone, ale odizolowane od innych rzędów. Należy odnieść się do Rysunku 2. Podświetlone obszary pokazują, które części płytki stykowej są ze sobą połączone. Przydatny film instruktażowy dotyczący obsługi płytek stykowych można znaleźć w internecie pod adresem http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Ćwiczenie 1
Wykorzystaj prawo Ohma, aby obliczyć NATĘŻENIE PRĄDU płynącego w poniższym obwodzie:
Natężenie prądu (Obwód 1): ________________A
Ćwiczenie 2
Zmierz napięcie na rezystorze, rezystancję rezystora oraz natężenie prądu płynącego w powyższym obwodzie (Sieć 1).
Rycina 3: Woltomierz Wavetek Meterman.
Odtwórz Obwód 1 na płytce stykowej, używając rezystora 1500 Ω; w roli źródła napięcia (1.5 V) służy urządzenie PowerLab. Pomiary napięcia, natężenia prądu i rezystancji wykonuje się za pomocą woltomierza. Aby woltomierz mógł zebrać dokładne dane, zarówno czerwona, jak i czarna sonda muszą stykać się z nieizolowanym przewodem w obwodzie. Ponadto pokrętło powinno być ustawione na napięcie DC w zakresie odpowiednim dla skali danej konfiguracji eksperymentalnej. W celu pomiaru napięcia należy przyłożyć obie sondy woltomierza do dwóch końców rezystora. Podczas pomiaru rezystancji rezystora (a nie spadku napięcia) należy ODŁĄCZYĆ źródło napięcia i ponownie przyłożyć obie sondy do rezystora. Aby zmierzyć natężenie prądu, woltomierz musi być włączony SZEREGOWO w obwodzie; należy pamiętać, że czerwona i czarna sonda muszą być odpowiednio zorientowane względem kierunku przepływu prądu.
Napięcie (Sieć 1): ________________V
Opór (Sieć 1): ________________Ω
Natężenie prądu (Sieć 1): ________________A
Teraz za pomocą Power Lab zmierz napięcie w układzie 2 (identyczny jak układ 1, lecz na płytce stykowej), analogicznie do pomiaru wykonanego woltomierzem. Odłącz woltomierz i podłącz przewody sondy do pomiaru napięcia z czerwonym i czarnym zaciskiem. Następnie za pomocą kursora kliknij „Channel 1” (po prawej stronie ekranu). Kliknij i przejdź do „input amplifier”. Następnie w oknie kliknij przycisk „differential” i ustaw zakres na 5 V. Kliknij „OK”, aby zapisać zmiany.
Kliknij „Start” (prawy dolny róg), aby rozpocząć zbieranie danych. Pomiar odchyleń napięcia można przeprowadzić w dowolnym momencie, zatrzymując proces. Aby zmierzyć zgromadzone napięcie, kliknij „Stop”, a następnie użyj kursora „M” (lewy dolny róg) i przeciągnij go do linii bazowej. Następnie przesuń swobodny kursor do górnej części śladu napięcia, aby zmierzyć amplitudę. Odczytaj zmianę napięcia (ΔV) i zapisz dane na papierze. Wyniki można potwierdzić za pomocą samodzielnego woltomierza.
1.4) Rezystancja i konduktancja w połączeniu szeregowym
Zasada dzielnika napięcia: spadek napięcia na sumie wszystkich rezystancji połączonych szeregowo jest równy napięciu źródła. Napięcie na każdym pojedynczym rezystorze zależy od ułamka całkowitego oporu, jaki reprezentuje ten rezystor. Zatem:
Para rezystorów podzieli napięcie w stosunku odpowiadającym ich poszczególnym wartościom oporu.
Ćwiczenie 3
Oblicz spadek napięcia na każdym rezystorze w sieci 3. Zweryfikuj obliczenia, mierząc rzeczywiste napięcie za pomocą woltomierza oraz oprogramowania power lab, przy podłączonym źródle 1,5 V.
SIEĆ 3. Użyj dwóch rezystorów wskazanych powyżej.
| Obliczone: | Zmierzone: |
| Napięcie (na R1):_______V | Napięcie (na R1): ________________V |
| Napięcie (na R2):_______V | Napięcie (na R2): ________________V |
1.5) Przykładowe zastosowanie biologiczne:
Różne właściwości elektryczne wnętrza komórki oraz roztworu zewnętrznego aktywnej komórki nerwowej stanowią przykład dzielnika napięcia. Ten biologiczny obwód można badać za pomocą pomiarów wykonywanych elektrodami zewnętrznymi. Aktywny obszar komórki nerwowej, w którym przenikają jony, pełni funkcję źródła napięcia; prąd płynie z tego obszaru wzdłuż wnętrza komórki i powraca przez roztwór zewnętrzny. Zatem między dwoma punktami błony o różnym potencjale występuje przepływ prądu, który z konieczności jest taki sam wewnątrz włókna, jak i na zewnątrz; ponieważ oporność wnętrza jest większa od oporności zewnętrznej, tutaj następuje największy spadek napięcia.
Przeanalizujmy system oraz jego równoważny schemat elektryczny (Rycina 4: A i B.):
Obwód równoważny:
Rycina 4: A (góra). Przepływ prądu elektrycznego przez biologiczną błonę komórkową. B (dół). Równoważny obwód elektryczny. Źródło napięcia (120 mV) stanowi napięcie błonowe generowane przez potencjał czynnościowy komórki nerwowej.
Uwaga: R0 i Ri są w rzeczywistości połączone szeregowo (a nie równolegle) ze względu na położenie źródła zasilania. Równoważny rysunek obwodu przedstawia się następująco:
Rycina 5: Alternatywny równoważny obwód elektryczny dla Ryciny 4A.
Ćwiczenie 4.
Dane:
Vm, potencjał błonowy = 120 mV
Ri, oporność płynu wewnętrznego = 106 Ω
R0, oporność płynu zewnętrznego = 104 Ω
Oblicz V0, potencjał między elektrodami A i B.
V0: ________________V
Ćwiczenie 5.
Korzystając z Układu 4 (patrz poniżej), zmierz różnice potencjałów na każdym z rezystorów (R0 i Ri).
UKŁAD 4. Połącz rezystory 4.7 K Ω i 10 K Ω szeregowo ze źródłem 1.5 V:
Zmierz napięcia za pomocą woltomierza.
Napięcie (na R0): ________________V
Napięcie (na Ri): ________________V
UKŁAD 5 : Taki sam jak Układ 4, z wyjątkiem R0 = 1 K Ω
Należy zauważyć, że w Układzie 5 rezystancja zewnętrzna jest znacznie niższa (co odpowiada obecności dużej ilości płynu lub nieaktywnej tkanki tworzącej zwarcie między elektrodami), stąd znaczenie rejestrowania sygnałów z nerwów w powietrzu lub w oleju izolacyjnym, aby zwiększyć rezystancję zewnętrzną.
Napięcie (na R0): ________________V
Napięcie (na Ri): ________________V
1.6) Opór i przewodność w połączeniu szeregowym i równoległym
Przykładowe zastosowanie biologiczne:
Dobrym przykładem rezystorów połączonych szeregowo i równolegle jest konfiguracja elektryczna synapsy chemicznej. Przesył sygnałów elektrycznych nie jest możliwy przez większość synaps ze względu na efekt bocznikowania w szczelinie synaptycznej. Należy jednak zauważyć, że bocznik ten jest prawdopodobnie niezbędny, aby umożliwić wytworzenie wysokiego potencjału na błonie presynaptycznej, co wiąże się z uwalnianiem neuroprzekaźnika.
Rysunek 6: Model przepływu elektrochemicznego przez synapsę.
Należy zauważyć, że w żywej tkance istotne opory elektryczne tworzą się na błonach oraz w ograniczonych przestrzeniach pozakomórkowych. Stosunkowo duże przestrzenie wypełnione cieczą, takie jak cytoplazma komórkowa lub roztwory kąpielowe, nie stanowią znaczących oporów.
Ćwiczenie 6.
Sieć 6 (patrz powyżej oraz Płyta Obwodowa) jest analogiem chemicznej synapsy przekaźnikowej. W synapsach elektrycznych szczelina synaptyczna (oporność bocznikowa Rs) jest wyeliminowana, a prąd płynie bezpośrednio z komórki presynaptycznej do postsynaptycznej przez Rm1 i Rm2, a następnie przez Rm3. Tłumienie sieci można łatwo zmierzyć przy różnych wartościach rezystora, co ilustruje zmiany zachodzące w różnych synapsach. Podłącz PowerLab do źródła 1.5V (tj. ustawienie 0.75 Volt).
- Za pomocą multimetru zmierz różnicę potencjałów (PD) na każdym rezystorze w sieci zgodnie z instrukcją. Zapisz wartości rezystorów. Szczególną uwagę zwróć na różnicę potencjałów na Rm3 (membrana komórki postsynaptycznej). Napięcie: ________________V
- Zastąp rezystor 330 Ω w punkcie Rs rezystorem 330K Ω. Zmierz różnicę potencjałów w punkcie Rm3.
- Następnie, utrzymując wartość Rs na poziomie 330K Ω, zastąp rezystor 330K Ω w punkcie Rm2 rezystorem 33K Ω. Zmierz różnicę potencjałów na Rm3.. Napięcie: ________________V
- Teraz, utrzymując wartość Rs na poziomie 330K Ω oraz Rm2 na poziomie 33K Ω, zastąp rezystor 22K Ω w punkcie R m1 rezystorem 220 Ω. Zmierz różnicę potencjałów na Rm3. Napięcie: ________________V
Ćwiczenie 7
Przykład rezystancyjnej sieci szeregowo-równoległej występuje podczas rozpatrywania właściwości kablowych włókna nerwowego lub mięśniowego. STAŁA DŁUGOŚCI włókna to odległość, na której różnica potencjałów (PD) przez błonę spada do 37% swojej wartości początkowej. Tłumienie wynika z faktu, że rezystancje wewnętrzne i zewnętrzne płynu po obu stronach błony są bocznikowane przez (stosunkowo wysoką) poprzeczną rezystancję błony. Wartość tej rezystancji ogranicza przesyłanie sygnału wzdłuż aksonu komórki nerwowej. Stała długości wynosi 1/e, co odpowiada pomiarowi dla zaniku wykładniczego. dE/dT=-E/RC; gdzie E to różnica napięć, R to rezystancja, a C to pojemność. Lub w innej formie E=Eoexp (-t/RC); gdzie Eo to napięcie początkowe, a t to czas w sekundach. RC określa się również jako tau (τ), czyli stałą czasową.
Przy założeniu, że oporność płynu zewnętrznego jest pomijalna w porównaniu z opornościami wewnątrzkomórkową i błonową, pasywne właściwości rezystancyjne błony można przedstawić za pomocą następującego obwodu:
Rysunek 7: Implementacja sieci 7 w układzie na płytce stykowej.
Przyłóż napięcie na jednym końcu Sieci 7 pomiędzy punktami A i B. Użyj stymulatora, wybierając impuls o czasie trwania 1s, amplitudzie 1V (ustawionej na 0,5 V) i częstotliwości 0,75Hz. Podłącz woltomierz kolejno przez każdy rezystor „błonowy” i zanotuj różnicę potencjałów (PD) na tym rezystorze. Jeden koniec sondy woltomierza pozostaw nieruchomo (przewód A, czerwony), podczas gdy drugi przewód przesuwaj sukcesywnie wzdłuż lokalizacji 1-5. Wykreśl każdą wartość na wykresie zależności PD od „odległości” od źródła, przyjmując, że rezystory błonowe są oddalone od siebie o jednostkę odległości. Na podstawie wykresu wyznacz stałą długości tego obwodu. 
Wykres stałej długości Sieci 7:______________
Efektem zwiększenia poprzecznego oporu błony, co ma miejsce w przypadku osłonki mielinowej, lub zmniejszenia podłużnego oporu wewnętrznego włókna związanego ze zwiększeniem jego średnicy, jest zmiana stałej długości. Wartości rezystorów nie odpowiadają wartościom faktycznie występującym w aksonie nerwowym, lecz są do nich w przybliżeniu proporcjonalne. Podobnie „jednostka odległości” w modelu jest znacznie powiększona w stosunku do rzeczywistej komórki nerwowej.
1.7) Pojemność
Kondensatory magazynują ładunek. Jeśli do kondensatora przyłożone zostanie napięcie poprzez rezystor, prąd zacznie płynąć do kondensatora, a następnie PD (różnica potencjałów) na kondensatorze będzie rosła wykładniczo w czasie, dążąc do PD źródła; przebieg czasowy tej zmiany napięcia zależy od przyłożonego napięcia, pojemności oraz rezystancji szeregowej. Podobny, lecz odwrócony przebieg czasowy obserwuje się podczas rozładowywania kondensatora.
Podłącz wejście tego prostego układu rezystor-kondensator (RC) do stymulatora w punktach A i B. Użyj impulsów 1V (ustawionych na 0.5V) o czasie trwania 1s i częstotliwości 0.75Hz. Należy również ustawić częstotliwość próbkowania na 20 K /sec (prawa strona panelu). Podłącz zaciski wejściowe PowerLab równolegle do kondensatora. Rejestruj sygnał przez kilka sekund, a następnie zatrzymaj pomiar. Użyj okna Zoom, aby powiększyć czas narastania jednego z impulsów prostokątnych. Powiększenie może wymagać kilkukrotnego powtórzenia w celu rozciągnięcia śladu. Zmierz czas narastania od linii bazowej do szczytu przebiegu napięcia w momencie jego stabilizacji. Zaobserwuj przebieg czasowy zmiany potencjału oraz zniekształcenie impulsów prostokątnych. Zaobserwuj efekt zastąpienia kondensatora 10μF kondensatorem 0.1 μF. Podłączając sondę napięciową PowerLab równolegle do rezystora, można zaobserwować przebieg czasowy przepływu prądu w obwodzie. Zarejestruj tylko kilka impulsów, a następnie zatrzymaj pomiar, aby dokonać odczytów. Użyj kursora „M”, aby przejść do linii bazowej przed narastaniem, oraz kursora swobodnego, aby zaznaczyć miejsce, w którym napięcie zaczyna się stabilizować.
Ostatni przykład obejmuje zarówno komponenty rezystywne, jak i pojemnościowe. Pasywne właściwości kablowe włókien nerwowych i mięśniowych są determinowane przez podobne elementy, wynikające z właściwości błony komórkowej. W komórce występuje nie tylko poprzeczna rezystancja błony, ale także pojemność błony, uwarunkowana właściwościami elektrycznymi błony komórkowej. Skutkuje to wpływem na przebieg czasowy rozwoju potencjałów rozprzestrzeniających się elektrotonicznie.
Przykład:
Tę sieć można zbudować na podstawie Sieci 7, dołączając odpowiednie kondensatory równolegle do rezystorów błonowych (Rm).
Ćwiczenie 8.
Podłącz kondensatory 10 μF do Sieci 7. Wykorzystując impulsy z고자 stymulatora o czasie trwania 1s, napięciu 1V (ustawienie 0,5 V) i częstotliwości 0,75Hz, który powinien być podłączony w punktach A i B, obserwuj zmiany potencjału na każdym rezystorze błonowym. Przyjmując napięcie „progowe” (napięcie, przy którym w komórce nerwowej generowany jest potencjał czynnościowy) jako 0,2V, zmierz czas potrzebny na osiągnięcie wartości progowej potencjału na każdym rezystorze błonowym. Próg oznacza tutaj wartość potencjału, przy której w żywej komórce może zostać wygenerowany potencjał czynnościowy. Przedstaw wyniki na wykresie zależności czasu od „odległości”.
Rysunek 8: Implementacja sieci 9 na układzie z płytką stykową.
Wykres do ryciny 8.
Symuluj efekt zmniejszenia pojemności błony wywołany zwiększeniem grubości osłonki mielinowej poprzez zastąpienie kondensatorów mniejszymi o wartości 0.1μF. Zwróć uwagę na zmianę czasu osiągnięcia progu przy wybranym rezystorze. Nałóż uzyskane dane na ten sam wykres, na którym znajdują się wyniki dla większych kondensatorów.
W odniesieniu do błony mięśniowej można wskazać na zwiększoną pojemność wynikającą ze zwiększenia powierzchni błony poprzez powiązane z nią kanaliki T, co skutkuje większą pojemnością błonową w porównaniu z neuronem. Mniejsze kondensatory mogą służyć do zilustrowania zmniejszonej pojemności wynikającej z dodania mieliny do nieomyelinizowanego aksonu nerwowego. Głównym punktem do zapamiętania jest to, że pojemność elektryczna jest proporcjonalna do powierzchni i odwrotnie proporcjonalna do grubości warstwy dielektryka (mieliny), która oddziela „płyty” lub powierzchnie magazynujące kondensatora.
Właściwości przedstawione na obwodzie modelowym są obserwowane w preparatach żywych. Jednakże komórki różnią się swoimi właściwościami, takimi jak przeciekanie przez błonę oraz oporność osiowa. Niektóre komórki nie generują potencjałów czynnościowych. Niemniej jednak potencjał czynnościowy powstaje, gdy sygnał musi zostać przesłany na odległość kilku milimetrów, ponieważ pasywne właściwości elektryczne komórek tłumią sygnały na dystansie kilku milimetrów. W kolejnej serii doświadczeń zilustrowano rejestrację potencjałów czynnościowych.
1.8) Pytania dla studentów
- Jakie są typowe wartości stałej długości dla neuronów i komórek mięśniowych?
- Co by się stało, gdyby błona miała niską rezystancję błonową: czy stała czasowa (czas potrzebny do osiągnięcia 63% wartości końcowej) uległaby zmianie? Jeśli tak, to w jaki sposób zmieniłaby się przy niższej rezystancji błonowej? Jaki jest ogólny wzór matematyczny na stałą czasową (tau)?
- Dlaczego większe aksony, takie jak olbrzymi akson kalmara, mogą przewodzić sygnały elektryczne szybciej niż mniejsze aksony w tym samym preparacie kalmara?
2. WŁAŚCIWOŚCI PRZEWODZENIA KOMÓREK NERWOWYCH
2.1) Od prototypu na płyciestykowej do żywych komórek
Właściwości pasywne zaprezentowane w ćwiczeniach na płytkach drukowanych są mierzalne również w żywych komórkach; jednak wyodrębnienie tych właściwości może być utrudnione, gdy towarzyszą im potencjały czynnościowe w komórkach nerwowych. Właściwości aktywne neuronu to zdolność do utrzymywania spoczynkowego potencjału błonowego, generowania potencjałów czynnościowych oraz ich regeneracji wzdłuż fragmentu błony.
Przepływ ładunków elektrycznych wzdłuż sznura nerwowego może mieć również charakter regeneracyjny w obrębie poszczególnych neuronów oraz między kolejnymi neuronami. W brzuszny sznurze nerwowym (VNC) raka, niektóre neurony komunikują się za pomocą połączeń typu septate (tj. połączeń szczelinowych). Jak wykazano w poprzednich ćwiczeniach z płytką stykową, zmiana rezystancji może utrudniać przewodzenie sygnałów elektrycznych. Jest to analogiczne do zmiany przepływu prądu przez połączenia szczelinowe w obrębie brzusznego sznura nerwowego.
W kolejnej serii eksperymentów zbadamy prędkość przewodzenia oraz inne właściwości złożonego potencjału czynnościowego w VNC. Zaprezentujemy sposób pozyskiwania VNC do celów doświadczalnych oraz metodę wywoływania i pomiaru odpowiedzi z wykorzystaniem standardowego sprzętu przeznaczonego do laboratoriów dydaktycznych.
2.2) Przygotowanie raka
Do tego eksperymentu najlepiej nadaje się brzuszny sznur nerwowy raka. Nerw ten jest łatwy do wypreparowania, a w przypadku tego preparatu można zastosować różnorodne protokoły wpływające na przewodzenie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zapoznać się z poniższymi terminami dotyczącymi anatomii raka:
Rysunek 9. Ogólny schemat anatomii raka.
Zmodyfikowano z: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Podstawy przewodzenia w nerwie
Brzuszny sznur nerwowy skorupiaka z rodzaju crayfish bierze udział w przesyłaniu sygnałów inicjujących reakcje ucieczki, takie jak odruch gwałtownego ruchu ogonem. W niniejszym eksperymencie rejestracje będą przeprowadzane z całego, nienaruszonego sznura nerwowego. Potencjały poszczególnych neuronów w obrębie sznura nerwowego sumują się, tworząc złożony potencjał czynnościowy, który generuje mierzalne impulsy elektryczne wyświetlane przez oprogramowanie rejestrujące. Erlanger, Gasser i Bishop (1924) należą do pionierów opisujących złożone potencjały czynnościowe. Przedstawiono charakterystykę okresu refrakcyjnego, prędkość przewodzenia oraz neuronalne efekty działania inhibitora połączeń szczelinowych 1-heptanolu lub temperatury. Poznanie podstawowych zasad przesyłania sygnałów w komórkach nerwowych przyczynia się do lepszego zrozumienia funkcji neurologicznych w ujęciu ogólnym (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).
2.4) Materiały
| Element | Ilość |
| Duży rak (*Procambarus clarkii*) | 1 |
| Precyzyjne nożyczki preparacyjne | 1 |
| Pinceta | 1 |
| MLT016/X Komora nerwowa | 1 |
| Laptop z oprogramowaniem Scope | 1 |
| PowerLab | 1 |
| Wzmacniacz PowerLab | 1 |
| Kabel wyjściowy stymulatora dla PowerLab | 1 |
| Złącze USB PowerLab/komputera | 1 |
| Statyw manipulatora z elektrodą ssącą | 1 |
| Pipeta szklana z gruszką | 1 |
| Zlewka z solą fizjologiczną dla raków | 1 |
2.5) Metody
2.5.1) Disekcja
Przed przystąpieniem do sekcji rak i upewnij się, że szalka do nerwów, niezbędne narzędzia oraz roztwory są przygotowane.
- Zawiń raka w wilgotny ręcznik papierowy, aby go unieruchomić, lub po prostu trzymaj go w jednej dłoni, chwytając szczypce (chelipedy) kciukiem i palcem wskazującym.
- Drugą ręką wykonaj nożyczkami nacięcie w obrębie rostrum pomiędzy oczodołami.
- Tnij w dół od miejsca nacięcia, aż głowa zostanie całkowicie oddzielona.
- Wykonaj nacięcie u podstawy głowotułowia powyżej odwłoka; odetnij ogon. (W razie potrzeby można usunąć chelipedy i odnóża kroczne, aby ułatwić ten proces.)
- Usuń pławiki.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż obu stron brzusznej strony odwłoka. Należy uważać, aby nie uszkodzić głębszych tkanek.
- Odchyl uwolnioną część egzoszkieletu aż do podstawy wachlarza ogonowego, aby odsłonić brzuszny sznur nerwowy.
- Używając krawędzi pęsety, ostrożnie wyjmij brzuszny sznur nerwowy za jego końcówkę. Należy uważać, aby nie rozciągnąć ani nie zmiażdżyć sznura nerwowego. (Wszelkie zgrubienia zaobserwowane na sznurze nerwowym to zwoje nerwowe raka.)
- Rozmieść sznur nerwowy na metalowych prętach w komorze nerwowej. Niezbędne jest utrzymanie brzusznego sznura nerwowego w wilgotnym stanie. Aby to osiągnąć, wlej do komory nerwowej odpowiednią ilość soli fizjologicznej dla raków, tak aby poziom cieczy zrównał się z metalowymi prętami poprzecznymi. Następnie odessaj pipetą tyle soli fizjologicznej, aby poziom cieczy ledwie stykał się z dołami prętów.
Sól fizjologiczna dla raków (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES dostrojone do pH 7.4) - Po umieszczeniu nerwu podłącz do komory nerwowej kabel stymulatora z dwoma minihaczykami. Podłącz dodatni czerwony przewód do jednej z zewnętrznych metalowych pętli w pobliżu końca sznura nerwowego; podłącz ujemny czarny przewód do najbliższej sąsiedniej metalowej pętli, która wciąż styka się ze sznurem nerwowym.
- Ustaw elektrodę ssącą w manipulatorze w pobliżu przeciwległego końca nerwu.
- Ostrożnie wciągnij końcówkę brzusznego sznura nerwowego do elektrody rejestrującej.
2.5.2) Rejestracja
Po zassaniu końcówki rdzenia nerwowego do elektrody rejestrującej należy upewnić się, że elektroda jest przymocowana do sondy, a sonda jest odpowiednio uziemiona. Można to osiągnąć, po prostu podłączając kabel uziemiający do klatki Faradaya. Przewody dodatniej i ujemnej elektrody ssącej powinny być również przymocowane do odpowiednich miejsc na sondzie. Sonda powinna być podłączona do wzmacniacza różnicowego, który z kolei jest połączony z systemem PowerLab.
Podłącz przewody elektryczne z elektrody ssącej do stopnia głowicowego. Przewody należy podłączyć tak, aby czerwony (dodatni) znajdował się w lewym górnym rogu, zielony (masa) w środku, a czarny (ujemny) na dole. Jest to przedstawione na poniższym rysunku 10 dla stopnia głowicowego. Przewód masy można po prostu umieścić w kąpieli solnej. W ten sposób jeden przewód z elektrody ssącej trafia do wejścia +, a drugi do wejścia -. Nie ma znaczenia, który z przewodów elektrody ssącej zostanie podłączony do wejścia + lub -.
Rysunek 10: Wejścia stopnia głowicowego
Ustawienia wzmacniacza są następujące:
| KONTROLA | USTAWIENIA |
| Filtr górnoprzepustowy | DC |
| Filtr notch | WYŁ. |
| Filtr dolnoprzepustowy | 20 kHz |
| Porównanie pojemności | Przeciwnie do ruchu wskazówek zegara |
| Pokrętła precyzyjnej i wstępnej regulacji przesunięcia poziomu stałego (DC Offset) | Przeciwnie do ruchu wskazówek zegara |
| Przesunięcie składowej stałej (+OFF) | WYŁ. |
| Pokrętło wzmocnienia | 50 |
| Wejście (DIFF MONO GND) | RÓŻNICA |
| TRYB(STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | WYŁ. |
Podłącz dołączony kabel USB do tylnego panelu PowerLab oraz do gniazda komputera. Uruchom oprogramowanie Scope na pulpicie komputera. W prawym górnym rogu ekranu zaznacz „Channel 2” i wyłącz go. Dostosuj widok ekranu tak, aby widoczny był tylko Channel 1, przesuwając suwak znajdujący się na środku ekranu w dół. Następnie w prawym górnym rogu ekranu kliknij „Input Amplifier” dla kanału 1. Wybierz następujące opcje:
| KONTROLA | USTAWIENIE |
| ZAKRES | 500 mV |
| AC | ZAZNACZONO |
| DOLNOPRZEPUSTOWY | WYŁĄCZONY |
| JEDNOKOŃCOWY | ZAZNACZONO |
| INWERTUJ | ZAZNACZONO |
Następnie, ponownie w sekcji „Set up”, kliknij „Sampling”. W polu o nazwie „Sweep” na wyświetlonym ekranie wybierz następujące opcje:
| KONTROLA | USTAWIENIE |
| TRYB | WIELOKROTNY |
| PRÓBKA | 100 SWEEPS |
| ŹRÓDŁO | UŻYTKOWNIK |
| OPÓŹNIENIE | 0 SECONDS |
Na koniec, w zakładce „Set up”, wybierz „Stimulator”. Kliknij pole, aby wyłączyć funkcję „Isolated Stim”. Wybierz następujące ustawienia:
| KONTROLA | USTAWIENIE |
| TRYB | WIELOKROTNY |
| OPÓŹNIENIE | 5 ms |
| CZAS TRWANIA | 1 ms |
| IMPULS(E) | 2 |
| ODSTĘP | 15 ms |
| ZAKRES | 5 V |
| AMPLITUDA | 0,5 |
Zobacz sekcję „Time Base” w panelu po prawej stronie. Zmień wartość „Sample” na 1024, a „Time” na 200 msec.
Rysunek 11: Dwa złożone potencjały czynnościowe z 15 msec odstępem między bodźcami, zarejestrowane za pomocą oprogramowania Scope.
Ćwiczenie 1.
Wybierz przycisk „Start” w lewym dolnym rogu ekranu. Przy powyższych ustawieniach w oknie zbierania danych Scope powinno pojawić się wyraźnie zdefiniowany złożony potencjał czynnościowy (Rysunek 11). Naszkicuj ogólny kształt potencjału czynnościowego na poniższym wykresie (Rysunek 12):
Rysunek 12: Pusty wykres do naszkicowania kształtu złożonego potencjału czynnościowego.
Powoli zmniejszaj napięcie, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu. Amplituda potencjału czynnościowego powinna maleć, aż charakterystyczny wzór fali całkowicie zniknie. Zmniejszenie napięcia redukuje liczbę neuronów rekrutowanych do generowania złożonego potencjału czynnościowego. Większe aksony są prawdopodobnie rekrutowane przy niższych napięciach i przewodzą sygnały szybciej, przez co mają tendencję do pojawiania się jako pierwsze w złożonym potencjale czynnościowym. Stopniowo zwiększaj napięcie, aby zaobserwować efekt odwrotny; w miarę rekrutacji większej liczby neuronów fala złożonego potencjału czynnościowego staje się większa. To ćwiczenie ilustruje fakt, że poszczególne neurony mają różne progi generowania potencjału czynnościowego. Gdy złożony potencjał czynnościowy nie zwiększa się już przy dalszym wzroście napięcia stymulującego, oznacza to, że wszystkie neurony zostały zrekrutowane; na ekranie komputera powinny być widoczne dwa wyraźne piki fali potencjału czynnościowego.
Ćwiczenie 2.
Po zbadaniu rekrutacji neuronów i wynikającego z niej złożonego potencjału czynnościowego, zaobserwuj efekt okresu refrakcji. Można to zrobić, podając dwa bodźce w krótkich odstępach czasu i zmieniając odstęp międzybodźcowy, a następnie obserwując, przy jakim odstępie międzybodźcowym amplituda złożonego potencjału czynnościowego wywołanego przez drugi bodziec jest zmniejszona w porównaniu do pierwszego złożonego potencjału czynnościowego. Zmieniaj opóźnienie między impulsami za pomocą karty w lewym górnym rogu ekranu. Skracaj opóźnienie tak długo, aż drugi złożony potencjał czynnościowy przestanie być wywoływany. Czas między impulsami, przy którym drugi potencjał czynnościowy nie jest już wywoływany, to bezwzględny okres refrakcji. Czas od zakończenia bezwzględnego okresu refrakcji do momentu, w którym drugi bodziec generuje potencjał czynnościowy o pełnej amplitudzie, nazywany jest względnym okresem refrakcji. Podaj szacunkowe wartości bezwzględnego i względnego okresu refrakcji w wyznaczonych miejscach.
Bezwzględny okres refrakcji: ___________________
Względny okres refrakcji: ___________________
2.5.3) Pomiar prędkości przewodzenia
Za pomocą linijki milimetrowej zmierz odległość między drutem stymulującym znajdującym się najbliżej elektrody rejestrującej a samą elektrodą rejestrującą. Na podstawie zarejestrowanego przebiegu zmierz czas do poszczególnych szczytów zdarzeń w potencjale złożonym, aby móc określić prędkość przewodzenia poszczególnych sygnałów elektrycznych. Przelicz odległość z mm na metry oraz czas z msec na sekundy, aby otrzymać jednostkę metrów na sekundę.
Prędkość przewodzenia 1.ej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 2.ej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 3.iej fali: __________________
Prędkość przewodzenia 4.tej fali: __________________
2.5.4) Manipulacja złączami szczelinowymi i/lub prędkością przewodzenia
Następnie zbadaj właściwości inhibitora neuronalnego. Efekt rozprzęgania wywołany przez heptanol został po raz pierwszy opisany w aksonach z przegrodami (tj. z połączeniami szczelinowymi) raka przez Johnston et al. (1980). Efekt ten, związany z komunikacją elektryczną, został wkrótce potwierdzony w różnych układach kręgowców i bezkręgowców (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Aby zrozumieć rolę komunikacji elektrycznej w tym brzusznym sznurze nerwowym, do rozprzęgania połączeń szczelinowych można zastosować sól fizjologiczną z (1mM) 1-heptanolem. Za pomocą szklanej pipety przepłucz cały sznur nerwowy roztworem heptanolu. Zaobserwuj zmianę zarejestrowaną przez oprogramowanie Scope i podsumuj ją. (Zwróć uwagę na zmianę kształtu fali oraz na to, czy zmieniła się prędkość przewodzenia fal). Alternatywnie, zamiast stosowania 1-heptanolu, sól fizjologiczną do kąpieli można zastąpić solą fizjologiczną schłodzoną w lodzie, a następnie monitorować wszelkie zmiany w kształcie fali lub prędkości przewodzenia fal.
Dyskusja
Naszym celem w prezentacji wideo online oraz w niniejszej pracy jest wykazanie, że właściwości biofizyczne komórek mogą być częściowo modelowane jako obwody elektryczne. Ponadto, dzięki zastosowaniu stosunkowo łatwo dostępnej żywej tkanki nerwowej, możliwe jest wprowadzenie do laboratoriów dla studentów studiów licencjackich fundamentalnych zasad dotyczących prędkości przewodzenia, okresów refrakcji i technik rejestracji elektrofizjologicznej przy niewielkich nakładach na sprzęt. Przedstawione zagadnienia i podstawowe paradygmaty mogą być łatwo dostosowane do wymagań różnych kursów.
Utrzymywanie raków oraz ich powszechność sprawiają, że są one atrakcyjnymi modelami do eksperymentów prowadzonych przez studentów. Brzuszne sznury nerwowe skorupiaków są zazwyczaj wytrzymałe i zachowują integralność fizjologiczną w minimalnym roztworze soli przez wiele godzin, co jest wystarczające dla 3-godzinnych zajęć laboratoryjnych dla studentów.
Biorąc pod uwagę, że niektóre z dużych aksonów w VNC homara są połączone za pomocą złączy szczelinowych, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty dotyczące ich wkładu i wykazać inne właściwości niż te występujące w standardnym preparacie nerwu kulszowego żaby. Nerw kulszowy jest klasycznym modelem do badania złożonych potencjałów czynnościowych oraz właściwości przewodzenia. Dla studentów interesującym eksperymentem porównawczym mogłoby być zestawienie właściwości przewodzenia, rekrutacji aksonów oraz okresów refrakcji w obu tych preparatach.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Do przeprowadzenia tych eksperymentów wykorzystano zmodyfikowane procedury z podręcznika laboratoryjnego stosowanego w kursie organizowanym przez dr. H.L. Atwooda na Katedrze Zoologii Uniwersytetu w Toronto. Ćwiczenia zostały również opracowane i zmodyfikowane na podstawie podręcznika przygotowanego na „6th INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE”, który odbył się na Uniwersytecie Korea w Seulu, w Korei Południowej w 1993 roku (Cooper et al., 1993). Obecne modyfikacje były konieczne, aby dostosować procedury do sprzętu powszechnie dostępnego w dzisiejszych laboratoriach studenckich na różnych uniwersytetach. Projekt wspierany przez Uniwersytet Kentucky, Katedrę Biologii, Biuro Studiów licencjackich oraz Kolegium Nauk i Sztuk.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Płyta obwodowa | |||
| |||
Doświadczenia z zakresu fizjologii | |||
|
Bibliografia
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
- Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
- Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
- Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
- Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
- Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie