Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowy protokół rejestracji prądów wapniowych aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell w ludzkich limfocytach T pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.

Streszczenie

W limfocytach T wyczerpanie zapasów Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowego magazynu Ca²⁺ prowadzi do aktywacji plazmalemmalnych kanałów Ca²⁺, nazywanych kanałami wapniowymi aktywowanymi przez uwalnianie wapnia (CRAC). Kanały CRAC odgrywają ważną rolę w regulacji proliferacji limfocytów T oraz ekspresji genów. Nieprawidłowe funkcjonowanie kanałów CRAC w limfocytach T wiąże się z ciężkim złożonym niedoborem odporności oraz chorobami autoimmunologicznymi ^{1, 2}. Badanie funkcji kanałów CRAC w ludzkich limfocytach T może ujawnić nowe mechanizmy molekularne regulujące prawidłowe odpowiedzi immunologiczne i pomóc w zrozumieniu przyczyn powiązanych z nimi chorób ludzkich. Rejestracja elektrofizjologiczna prądów błonowych zapewnia najdokładniejszą ocenę funkcjonalnych właściwości kanałów oraz ich regulacji. Elektrofizjologiczna ocena prądów kanałów CRAC w komórkach T Jurkat, ludzkiej linii komórkowej białaczki T, została po raz pierwszy przeprowadzona ponad 20 lat temu ³, jednak pomiary prądów CRAC w normalnych ludzkich limfocytach T pozostają trudnym zadaniem. Trudności w rejestrowaniu prądów kanałów CRAC w normalnych limfocytach T wynikają z faktu, że limfocyty T pochodzące z krwi są znacznie mniejsze niż komórki T Jurkat, a w związku z tym endogenne prądy CRAC typu whole-cell mają bardzo niską amplitudę. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową procedurę, której rutynowo używamy do rejestracji prądów Ca²⁺ lub Na⁺ przepływających przez kanały CRAC w spoczynkowych ludzkich limfocytach T wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Opisana tutaj metoda została zaadaptowana z procedur stosowanych do rejestracji prądów CRAC w komórkach T Jurkat oraz aktywowanych ludzkich limfocytach T ^4-8.

Protokół

1. Przygotowanie spoczynkowych limfocytów T człowieka

1. Używając zestawu RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail oraz medium RosetteSep Density Medium, oczyść limfocyty T z próbek ludzkiej krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskana populacja komórek powinna zawierać 95% spoczynkowych limfocytów T CD3⁺. Limfocyty T izolujemy z próbek krwi obwodowej pobranych od zdrowych ochotników zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Internal Review Board UC Davis.
2. Po izolacji resuspenduj spoczynkowe limfocyty T do gęstości 0,5 x 10⁶ komórek/mL w medium do hodowli komórkowej zawierającym medium RPMI-1640 z glutaminą i HEPES, uzupełnione o 10% płodowej łydki serum, 2% GlutaMAX-I, 1% roztwór witamin RPMI 1640, 1% roztwór aminokwasów RPMI 1640, 1% pirogronianu sodu oraz 0,03% β-merkaptoetanolu.
3. Przenieś zawiesinę komórkową do kolb hodowlanych i inkubuj w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂ do 24 h przed rozpoczęciem eksperymentu.

2. Przygotowanie komory rejestracyjnej

1. Do przygotowania komór rejestracyjnych potrzebne są: a) silikonowe pierścienie O-ring, b) okrągłe, 25-mm szkiełka nakrywki oczyszczone 70% etanolem i destylowaną H₂O, c) zmieszany Sylgard184, przygotowany zgodnie z instrukcją producenta, oraz d) dwie płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.
2. Do płytki Petriego 60x15 mm wlać ~0.5 mL zmieszanego Sylgard184.
3. Za pomocą pęsety zanurzyć dolną część pierścienia O-ring w Sylgard184.
4. Nadmiar Sylgard184 usunąć z krawędzi pierścienia O-ring, kładąc go na czystej powierzchni, np. na drugiej płytce Petriego.
5. Umieścić pierścień na szkiełku nakrywce i docisnąć go.
6. Utwardzić Sylgard184, ogrzewając komory w temperaturze 85° C przez 40-60 min lub do czasu polimeryzacji Sylgard184.
7. Przechowywać komory rejestracyjne w pojemniku chroniącym przed kurzem.

3. Przygotowanie pipet do patch-clamp

1. W dniu eksperymentu wyciągnij pipety o średnicy końcówki ~2-μm, wykorzystując kapilary szklane i wyciągarkę do pipet. Stosujemy rurki borokrzemowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1.5 mm i średnica wewnętrzna: 1.10 mm). Przechowuj pipety w miejscu wolnym od kurzu.
2. Pokryj końcówki pipet preparatem Sylgard184 lub powłoką ochronną półprzewodników HIPEC R6101 zgodnie ze standardową procedurą ⁹.
3. Przed rozpoczęciem eksperymentu delikatnie wypoleruj końcówki pipet metodą wypalania.

4. Przygotowanie zestawu do patch clamp

1. Skonfiguruj i zapisz makra dla tworzenia gigaseala w oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem patch-clamp. W naszych badaniach wykorzystujemy wzmacniacz EPC-10 obsługiwany przez system Windows XP oraz oprogramowanie Pulse do akwizycji danych. Makra „set-up”, „on-cell” oraz „whole-cell” ustawiamy zgodnie z instrukcją obsługi EPC-10 i stosujemy we wszystkich eksperymentach.
2. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj roztwory do kąpieli oraz roztwory do pipet wymienione w Tabeli 1 i przechowuj je w temperaturze 4° C przez maksymalnie 1 tydzień.

Odczynniki chemiczne	Roztwory kąpieli (mM)			Odmiar rozwiąry (mM)
	# 1	# 2	# 3
CH3SO3Na	130	110	125	-
NaCl	2	4	5	-
Ca(OH)22	-	20	-	-
MgCl2	3	1	-	5
MgSO₄4	-	-	-	2
HEPES	10	10	10	15
HEDTA	-		10	-
EDTA	-	-	1	-
Aspartonian cezu	-	-	-	125
BAPTA	-	-	-	12
Glukoza	10	10	10	-

Tabela 1. Roztwory do rejestracji prądów CARC w konfiguracji whole-cell.

Wszystkie odczynniki chemiczne zostały zakupione od firmy Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.

3. Wyznacz potencjały złącza cieczowego (LJ) pomiędzy roztworem w pipecie patch a każdym z roztworów kąpieli ¹⁰Zapisz wartość LJ w odpowiednim miejscu za pomocą oprogramowania do akwizycji. Na przykład w programie Pulse wprowadź wartość LJ do pola sterowania „LJ” w oknie „Amplifier”.
4. Przed rozpoczęciem eksperymentów skonfiguruj i zapisz protokoły stymulacji, zgodnie z rysunkiem 1, w odpowiednim miejscu w oprogramowaniu akwizycyjnym. W programie Pulse protokół akwizycji ustawiamy w oknie „Pulse Generation”.
   
   Rycina 1. Protokół stymulacji. Przykładany jest rampowy skok napięcia od -120 do +10 mV o czasie trwania 50 ms w odstępach od 0,2 do 2 s (5 – 0,5 Hz). Potencjał spoczynkowy (V_h) pomiędzy rampami utrzymuje się na poziomie +30 mV.

5. Umieszczanie komórek na stoliku mikroskopu

1. Pokryj komory rejestracyjne poli-_L-lizyną przez ok. 20 min, a następnie przemyć H₂a następnie zbalansowanym roztworem soli Hanksa (HBSS) przed wysianiem komórek.
2. Płytka 500 μL zawiesiny komórkowej zawierającej 0,2-0,5 x10⁶ komórki do komory i inkubować przez 20 min w temperaturze 37° C.
3. Ustabilizuj komorę pomiarową z przytwierdzonymi komórkami w uchwycie do komory. Stosujemy wykonany na zamówienie uchwyt, w którym podstawa podtrzymuje dno szkiełka nakrywki, a część górna delikatnie dociska jej górną powierzchnię.
4. Umieść uchwyt komory na stole mikroskopu odwróconego.
5. Ustaw ostrość na komórki w świetle przechodzącym. Używamy obiektywu imersyjnego 40X.
6. Umieść elektrodę odniesienia Ag/AgCl w kąpieli.
7. Wyrównaj wielokanałowy system perfuzyjny sterowany grawitacyjnie. Końcówkę rurki dopływowej należy umieścić w 45° pod kątem do szkiełka nakrywki, blisko pola widzenia.
8. Ustaw rurkę ssącą naprzeciwko końcówki rurki dopływowej.
9. Przepłucz komorę solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) lub HBSS, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowej oraz słabo przytwierdzone komórki.

6. Rejestracja prądów kanałów CRAC

1. Należy znaleźć komórkę, która jest mocno przytwierdzona do szkiełka nakrywkowe. Zazwyczaj wybieramy komórkę o średniej wielkości i okrągłym kształcie, z gładką powierzchnią zewnętrzną.
2. Przeperfunduj komorę rejestracyjną roztworem Ca²⁺-wolny, 3 mM Mg²⁺-zawierający roztwór kąpieli nr 1 (Tabela 1) zawierający 0,5-1 μM tapsygargin przez 8–10 min w celu zablokowania pompy SERCA. Ten krok wykonujemy, aby opróżnić zapasy przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal).
3. Używając mikroloadera Eppendorf oraz pipety wyporowej P-20, należy napełnić pipetę do patch-clampingu roztworem do pipety (Tabela 1), a następnie umieścić pipetę w uchwycie pipety na głowicy wzmacniacza. Ca²⁺ chelator BAPTA został dodany do roztworu w pipecie w celu pasywnego opróżnienia zapasów oraz zmniejszenia poziomu Ca2+²⁺zależna od [ukryta wartość] inaktywacja kanałów CRAC.
4. Przyłożymy niewielkie dodatnie ciśnienie (~3 cale słupa wody)₂O) wewnątrz pipety patch przed wprowadzeniem do kąpieli. Używamy wykonanego na zamówienie urządzenia do wytwarzania ciśnienia i podciśnienia, podłączonego do linii sprężonego powietrza i próżni, w celu wytworzenia ciśnienia dodatniego lub ujemnego wewnątrz pipety patch.
5. Zanurz pipetę do patch-clamp w kąpieli, kontrolując proces wizualnie za pomocą mikroskopu. W oknie „Oscilloscope” powinien pojawić się prąd płynący przez pipetę. Skokowa zmiana amplitudy prądu powinna zostać wywołana przez impuls napięcia o małej amplitudzie (impuls testowy) podany za pomocą zdefiniowanego makra. W tym momencie należy wyznaczyć wartość oporności pipety. Oporność naszych pipet wynosi zazwyczaj 5–6 MΩ.
6. Skoryguj potencjał „offsetowy” powstający między pipetą a elektrodą odniesienia.
7. Pod kontrolą wizualną za pomocą mikroskopu zbliżyć końcówkę pipety do komórki, aż do momentu zetknięcia się z błoną komórkową.
8. Przyłożyć podciśnienie (20-40 cali słupa wody)₂O) wewnątrz pipety patch.
9. Monitoruj tworzenie się giga-uszczelnienia (gigaseal) w oknie „oscyloskopu”. Zauważysz, że amplituda prądu indukowanego przez impuls testowy maleje, a wartość oporności pipety wzrasta do >5 GΩ. Zazwyczaj gigaseal tworzy się w ciągu kilku sekund, jednak osiągnięcie stabilnego gigasealu może zająć od 1 do 2 minut.
10. Skompensuj pojemność pipety („C-Fast”).
11. Przerwij błonę patchową, przykładając dodatnie podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.
12. Ustaw potencjał holdingowy na +30 mV. Dodatni potencjał holdingowy pomaga zapobiegać zależnej od wapnia inaktywacji kanałów CRAC.
13. Skompensuj pojemność błony komórkowej („C-slow”); zapisz lub odnotuj wartość C-slow.
14. Sprawdź wartość rezystancji dostępowej „R”_s. W naszych eksperymentach R_s wynosi zazwyczaj 7-20 MΩ.
15. Rozpocząć aplikację serii ramp napięcia o częstotliwości 0,5 Hz (Ryc. 1) w roztworze Ca²⁺-wolny 3 mM Mg²⁺-zawierający roztwór kąpieli nr 1. W tym roztworze prąd CRAC jest pomijalnie mały w porównaniu z prądem „wycieku” ze względu na niską przepuszczalność kanałów CRAC dla Mg²⁺Zapisz i wykorzystaj aktualne ślady zarejestrowane w roztworze kąpieli nr 1 w przyszłych analizach jako prądy „wycieku” (leak currents). Bezwzględna amplituda prądu „wycieku” przy -10 mV powinna być mniejsza lub równa 5 pA. Jeśli komórka wykazuje „wyciek”, przerwij eksperyment i rozpocznij go ponownie, używając nowej pipety do patch-clampu i nowej komórki.
16. Aby zarejestrować Ca2+²⁺ prąd przez kanały CRAC (I_Ca-CRAC), zastąp Ca²⁺pozbawiony Mg, 3 mM Mg²⁺roztwór kąpielowy nr 1 zawierający 20 mM Ca²⁺roztwór kąpieli nr 2 (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. Pozwala to na Ca²⁺ przepływać przez kanały CRAC i generować prąd wewnątrzkomórkowy. W oknie „Oscilloscope” będzie widoczny rozwój wewnątrzprostującego prądu I_Ca-CRAC (Rycina 2). Amplituda prądu przy ujemnych napięciach będzie nadal wzrastać przez około 1 min z powodu Ca²⁺zależna od [czynnika] potencjalizacja prądu CRAC.
17. Zwiększyć częstotliwość stymulacji rampami napięcia do 5 Hz, co jest niezbędne do zapisu przejściowego prądu Na+⁺ prąd przez kanały CRAC.
18. Zastąp 20 mM Ca²⁺roztwór do kąpieli nr 2 zawierający Na⁺-zawierającego roztworu nr 3 pozbawionego kationów dwuwartościowych (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. W oknie „Oscyloskop” pojawi się przejściowy wzrost amplitudy prądu Na wewnątrznieprostującego⁺ prąd przepływający przez kanały CRAC (I_Na-CRAC; Rysunek 2).
19. Można zastosować 20 mM Ca²⁺roztwór kąpieli nr 2 zawierający 1-5 μM La³⁺ na koniec eksperymentu w celu zarejestrowania prądu „upływu”. Nie uznaliśmy jednak tego podejścia za przydatne, ponieważ prąd „upływu” zmienia się w czasie i pod koniec eksperymentu może stać się większy lub mniejszy. Wolimy przyjąć wartość prądu zarejestrowaną w Ca²⁺wolny od 3 mM Mg²⁺roztwór kąpieli nr 1 zawierający [substancję] na początku eksperymentu jako prąd „upływu”.
20. Zapisz zarejestrowane przebiegi prądowe do dalszej analizy.

7. Analiza danych

1. Wczytaj zapisane rekordy prądowe do oprogramowania analitycznego. Do analizy wykorzystujemy program Pulse.
2. Zmierz amplitudy prądu na początku i na końcu ramp napięciowych. Zazwyczaj mierzymy amplitudy prądu przy -10 mV oraz +100 mV, używając par kursorów w oknie „Oscilloscope” programu Pulse.
3. Wyeksportuj wartości amplitud prądu do programu graficznego w celu dalszej analizy i prezentacji graficznej. Wykorzystujemy oprogramowanie Origin Scientific Graphing and Analysis Software w wersji 7.

8. Reprezentatywne wyniki

Rycina 2. Prądy CRAC w spoczewającej ludzkiej limfocycie T. (A), przebieg czasowy prądów CRAC zarejestrowanych w konfiguracji voltage-clamp whole-cell przy -10 mV (zamalowane kółka) i +100 mV (puste kółka). Przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal) komórkę inkubowano wstępnie przez ok. 10 min w Ca²⁺wolny od 3 mM Mg²⁺roztwór kąpieli nr 1 zawierający 0.5 μM thapsygargin. Po okresie adaptacji kolejno stosowano następujące roztwory kąpielowe: Ca²⁺wolny od 3 mM Mg²⁺roztwór kąpielowy nr 1 zawierający (0 Ca + 3 Mg), a następnie 20 mM Ca²⁺-zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca), następnie roztwór kąpielowy nr 3 pozbawiony kationów dwuwartościowych (DVF), a następnie roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca). Komórkę stymulowano serią ramp napięciowych, zgodnie z rysunkiem 1. Częstotliwość ramp wynosiła 5 Hz w roztworze kąpielowym nr 3 (DVF) oraz 0,5 Hz we wszystkich pozostałych roztworach. Należy zwrócić uwagę na powolny rozwój prądu I_Ca-CRAC po zastosowaniu 20 mM Ca²⁺-zawierający roztwór kąpieli nr 2 oraz szybki, przejściowy rozwój I_Na-CRAC w roztworze kąpieli DVF nr 3. (B), reprezentatywne zapisy prądów zarejestrowane podczas ramp napięciowych w Ca²⁺-wolny 3 mM Mg²⁺roztwór kąpielowy nr 1 („wyciek”) zawierający 20 mM Ca²⁺zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF). (C, D), zależności prądowo-napięciowe I_Ca-CRAC (C) i ja_Na-CRAC (D) uzyskane poprzez odjęcie prądu „upływu” od prądów zarejestrowanych podczas ramp napięciowych w 20 mM Ca²⁺- zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF) przedstawione na panelu (B).

Dyskusja

Elektrofizjologiczne badanie prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka jest trudnym zadaniem, ponieważ amplituda endogennego prądu CRAC w tych komórkach jest niewielka ze względu na ich mały rozmiar (średnica spoczynkowego limfocytu T człowieka mieści się w zakresie 5-8 μm). W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółową procedurę niezawodnej rejestracji prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka wyizolowanych z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Technologia ta pozwala na badanie fizjologii i ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koktajl do wzbogacania ludzkich limfocytów T RosetteSep	Technologie komórek macierzystych	15061
Medium gęstościowe RosetteSep	Technologie komórek macierzystych	15705
pożywka RPMI-1640 z glutaminą/HEPES	Fisher Scientific	SH3025501
Płódcowa surowica cielęca	Omega Scientific	FB-01
GlutaMAX-I (roztwór 100X)	Invitrogen	35050
roztwór witamin do medium RPMI 1640 (100X)	Sigma-Aldrich	7256
roztwór aminokwasów 1640 (50X)	Sigma-Aldrich	R7131
Pirowinian sodu	Sigma-Aldrich	S8636
β-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M7522
Inozytolotrifosforan	Sigma-Aldrich	19766
BAPTA	Sigma-Aldrich	A4926
hydrobromian poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P2636
Chlorek lantanu	Sigma-Aldrich	262072
Tapsigargin	Calbiochem	586005
Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004
Powłoka ochronna do półprzewodników HIPEC R6101	Dow Corning
Stół laboratoryjny do izolacji wibracji o wysokiej wydajności serii 63-500	Technical Manufacturing Corp.	63-540
Wzmacniacz patch-clamp EPC 10 z przedwzmacniaczem głowicowym	HEKA Instruments
Mikromanipulator	Sutter Instrument Co.	MP-285
Mikroskop odwrócony Olympus 1X71 z obiektywem imersyjnym 40x	Olympus Corporation	1X71
Komputer z systemem Windows	Dell
Oprogramowanie Pulse	HEKA Instruments
Oprogramowanie do grafiki i analizy danych Origin Scientific	OriginLab
Wyciągarka pipet patch-clamp	Sutter Instrument Co.	P-97
Szkło borokrzemianowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1,5 mm i średnica wewnętrzna: 1,10 mm)	Sutter Instrument Co.	BF150-110-7.5
Narashige’Microforge	Tritech Research, Inc.	MF-830
Uszczelki pierścieniowe silikonowe	McMaster-Carr	111 S70
Łaseczki 25 mm	Fisher Scientific	12-545-102 25 mm 25CIR.-1