Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolacja komórek odpornościowych naciekających ośrodkowy układ nerwowy (OUN) podczas infekcji, urazów, autoimmunizacji lub neurodegeneracji jest często niezbędna do zdefiniowania ich fenotypu i funkcji efektorowych. Podejścia histochemiczne są kluczowe dla określenia lokalizacji naciekających komórek oraz analizy związanej z nimi patologii OUN. Jednakże techniki histochemii in-situ i barwienia immunofluorescencyjnego są ograniczone liczbą przeciwciał, które można wykorzystać jednocześnie do charakterystyki podtypów komórek odpornościowych w danej tkance. Dlatego podejścia histologiczne w połączeniu z immunofenotypowaniem metodą cytometrii przepływowej są krytyczne dla pełnej charakterystyki składu miejscowego nacieku w OUN. Niniejszy protokół opiera się na rozdzielaniu zawiesin komórkowych z OUN w nieciągłych gradientach Percoll. Obecny artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, który może być efektywnie wykorzystany do identyfikacji różnych populacji komórek odpornościowych w jednej próbce za pomocą cytometrii przepływowej.
Protokół
Przygotowanie odczynników
Przygotować zapasowy izotoniczny percoll (SIP), 4 ml na mózg, mieszając 9 części percollu z jedną częścią 10X HBSS bez Ca++ i Mg++.
Przygotować SIP w stężeniu 70% w 1X HBSS bez Ca++ i Mg++, w ilości 2 ml na mózg, odmierzonej do 15 ml polipropylenowej probówki stożkowej.
Uwaga: Zaleca się stosowanie percolu w temperaturze pokojowej; w przypadku użycia zimnego roztworu komórki mają tendencję do agregowania się, a separacja komórek jest mniej wydajna.
Pobieranie i homogenizacja tkanek
Znieczulić myszy i przeprowadzić perfuzję przez lewą komorę serca lodowatym 1X HBSS. Wypreparować mózg oraz rdzeń kręgowy i przechowywać w RPMI bez czerwieni fenolowej do momentu uśmiercenia wszystkich myszy.
Umieścić tkanki w homogenizatorze Dounce o pojemności 7 lub 15 ml zawierającym 3 ml RPMI, delikatnie przygotować zawiesinę komórkową za pomocą luźno dopasowanego tłoka (rozmiar A), a następnie ciasno dopasowanego tłoka (rozmiar B), aby dalej rozdzielić tkanki. Uzupełnić objętość zawiesin komórkowych do 7 ml za pomocą RPMI.
Konfiguracja gradientu
Dodać 3 ml SIP do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 30% SIP
Powoli nanieś 10 mL zawiesiny komórkowej na wierzch 70% SIP. Jest to najbardziej krytyczny etap procedury; należy użyć pipetora ustawionego w trybie grawitacyjnym, aby uniknąć zmieszania roztworów 70% i 30%. Na styku faz 70% i 30% powinna być widoczna bardzo wyraźna, płaska linia.
Wiruj przez 30 min przy 500G w temperaturze 18°C. Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalnym hamowaniem lub bez niego, aby nie zaburzyć interfejsu.
Za pomocą pipety transferowej ostrożnie usuń warstwę zanieczyszczeń z góry probówki, a następnie pobierz 2,0-3,0 ml interfazy 70%-30% do czystej probówki stożkowej zawierającej 8 ml 1X HBSS. Upewnij się, że percoll zawierający interfazę został rozcieńczony około trzykrotnie, wymieszaj kilka razy poprzez odwracanie probówki i wiruj przez 7 min przy 500G w temperaturze 18°C.
Resuspender osad w 1 ml buforu do barwienia komórek, przenieść go do probówki 1,5 ml i przemyć ponownie, odwirugowując w mikrocentry fudze przy 10,000G przez 1 min w 4°C.
Barwienie przeciwciałami
Osady resuspender w 50 μl oczyszczonego przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 rozcieńczonego 1:200 w buforze do barwienia komórek w celu zablokowania miejsc wiązania Fc. Inkubować na lodzie przez 10 min. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
Dodaj 50 μl mieszaniny koktajlu przeciwciał i inkubuj na lodzie przez 30 min. Każde przeciwciało musi zostać najpierw mianowane w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia. Użyj odpowiednich kombinacji fluorochromów dobranych zgodnie z możliwościami laserów i ustawieniami filtrów konkretnego cytometru przepływowego.
Przemyj komórki buforem do barwienia komórek, resuspenduj osady w 100-200 μl buforu do barwienia komórek i poddaj natychmiastowej analizie w cytometrze; alternatywnie komórki można resuspendować w 2% paraformaldehydzie (PFA) przygotowanym w PBS i przechowywać przez noc w temperaturze 4°C.
Reprezentatywne wyniki:
Po wirowaniu gradientów interfaza 70%-30% powinna wykazywać wyraźną białą otoczkę, a ilościowe oznaczenie komórek odzyskanych od myszy naiwnej powinno dać wynik 3-5 x105 komórek na mysz (mózg wraz z rdzeniem kręgowym). W przypadku zapalenia mózgu liczba komórek zapalnych może być zróżnicowana w zależności od rodzaju uszkodzenia OUN lub modelu choroby (Rycina 1).
Rysunek 1. Izolacja komórek mononuklearnych z mózgów osobników naiwnych oraz z mózgów z EAE w szczycie choroby. Zawiesiny komórek mózgu rozdzielono na nieciągłych gradientach Percoll 70%/30%. Barwione komórki inkubowano z Fc-block, a następnie z przeciwciałami anty-CD45 przez 30 min w lodzie. Komórki przepłukano buforem do barwienia komórek i utrwalono w 2% PFA przed akwizycją w cytometrze LSR-II. Intensywność CD45 jest mierzona na osi Y, gdzie uwidoczniono trzy odrębne populacje. Dalsza charakterystyka fenotypu immunologicznego naciekających komórek CD45hi została przeprowadzona z użyciem dodatkowych przeciwciał, a następnie przeanalizowana metodą cytometrii przepływowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analizy markerów powierzchniowych leukocytów OUN z prawidłowych i zapalnych tkanek mysich są stosowane od kilku dekad1-3. Protokoły izolacji opierają się na rozdziale mikrogleju i leukocytów poprzez wirowanie gradientowe4. W niniejszej pracy opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji leukocytów OUN z wykorzystaniem nieciągłych gradientów Percoll. Po izolacji komórek barwienie różnymi przeciwciałami, takimi jak – lecz nie ograniczając się do nich – CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19 itp., pozwala na ident...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1/T dla AEC) oraz University of Texas at San Antonio.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Homogenizacja tkanek i gradienty
Cytometria przepływowa
|
Bibliografia
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
