$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przygotowanie odczynników
Przygotuj zapasowy izotoniczny perkol (SIP), 4 ml na mózg, mieszając 9 części perkolu z jedną częścią 10X HBSS bez Ca++ i Mg++.
Przygotuj SIP na poziomie 70% w 1X HBSS bez Ca++ i Mg++, 2 ml na mózg dozowane do 15 ml polipropylenowej stożkowej tuby.
Uwaga: Zaleca się, aby perkol był używany w temperaturze pokojowej, jeśli jest używany na zimno, komórki mają tendencję do zbijania się, a separacja komórek jest mniej efektywna.
Pobieranie i homogenizacja tkanek
Znieczulenie myszy i przepuszczenie przez lewą komorę lodowato zimnym 1X HBSS. Wypreparuj mózg i rdzeń kręgowy i utrzymuj w RPMI bez czerwieni fenolowej, dopóki wszystkie myszy nie zostaną złożone w ofierze.
Umieść chusteczki w 7 lub 15 ml homogenizatorze z dounce zawierającym 3 ml RPMI, delikatnie przygotuj zawiesinę komórkową za pomocą luźno dopasowanego tłuczka (rozmiar A), a następnie tłuczka o dużej mocy (rozmiar B), aby jeszcze bardziej rozdzielić tkanki. Uzupełnić objętość zawiesin komórek do 7 ml za pomocą RPMI.
Ustawienie gradientu
Dodaj 3 ml SIP do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe 30% SIP
Powoli nakładaj 10 ml zawiesiny komórek na 70% SIP. Jest to najbardziej krytyczny etap procedury, należy użyć zestawu pipet w trybie grawitacyjnym, unikając mieszania się roztworów 70% i 30%. Na skrzyżowaniu 70%-30% powinna być widoczna bardzo wyraźna płaska linia.
Wirować 30 min przy 500G 18°C. Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalnym hamulcem lub bez przerwy, aby interfaza nie została zakłócona.
Używając pipety transferowej, delikatnie usuń warstwę zanieczyszczeń z górnej części rurki i zbierz 2,0-3,0 ml interfazy 70%-30% do czystej stożkowej probówki zawierającej 8 ml 1X HBSS. Upewnij się, że perkol zawierający interfazę jest rozcieńczony około trzykrotnie, wymieszaj kilka razy przez inwersję i odwiruj 7 minut w 500G w temperaturze 18°C.
Ponownie zawiesić osad w 1 ml bufora do barwienia komórek i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml i umyć jeszcze raz za pomocą mikrowirówki o temperaturze 10 000G 1 min w temperaturze 4°C.
Barwienie przeciwciał
Zawieś granulki w 50 μl oczyszczonego antymysiego CD16/CD32 rozcieńczonego w stosunku 1:200 w buforze do barwienia komórek, aby zablokować miejsca wiązania Fc. Inkubować nad lodem przez 10 minut. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
Dodaj 50 μl mieszanki koktajli przeciwciał i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Każde przeciwciało musi być najpierw miareczkowane w celu oceny optymalnego rozcieńczenia. Użyj odpowiednich kombinacji fluorochromów dobranych zgodnie z możliwościami ustawień lasera i filtra konkretnego cytometru przepływowego.
Umyj komórki w buforze do barwienia komórek, ponownie zawieś granulki w 100-200 μl bufora do barwienia komórek i natychmiast przeanalizuj w cytometrze, lub alternatywnie komórki mogą być ponownie zawieszone w 2% paraformaldehydzie (PFA) przygotowanym w PBS i przechowywanym przez noc w temperaturze 4°C.
Reprezentatywne wyniki:
Po obróceniu gradientów, interfaza 70%-30% powinna mieć zdefiniowane białe halo, a kwantyfikacja komórek odzyskanych od naiwnej myszy powinna dać 3-5 x105 komórek na mysz (mózg plus rdzeń kręgowy). Stan zapalny mózgu może mieć różną liczbę komórek zapalnych w zależności od uszkodzenia OUN lub modelu choroby (ryc. 1).
Rysunek 1. Izolacja komórek jednojądrzastych, od naiwnego i EAE-mózg w szczytowym momencie choroby. Zawiesiny komórek mózgowych rozdzielono na nieciągłych gradientach 70%/30% percollu. Wybarwione komórki inkubowano z blokiem Fc, a następnie przeciwciałami anty-CD45 przez 30 minut na lodzie. Komórki przepłukano w buforze do barwienia komórek i utrwalono w 2% PFA przed nabyciem w LSR-II. Intensywność CD45 mierzy się na osi Y, gdzie wizualizowane są trzy odrębne populacje. Dalsza charakterystyka fenotypu immunologicznego komórek naciekających CD45hi jest realizowana przy użyciu dodatkowych przeciwciał, a następnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.