Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronalnej w wielu skalach

Podsumowanie

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w sposób umożliwiający obserwację lokalnych zmian w morfologii neurytów.

Streszczenie

Morfologia neuronów odgrywa istotną rolę w określaniu sposobu funkcjonowania i komunikacji neuronów^1-3. W szczególności wpływa ona na zdolność neuronów do odbierania sygnałów z innych komórek² oraz przyczynia się do propagacji potencjałów czynnościowych^4,5. Morfologia neurytów wpływa również na sposób przetwarzania informacji. Różnorodność morfologii dendrytycznej ułatwia przesyłanie sygnałów lokalnych i dalekosiężnych oraz pozwala poszczególnym neuronom lub grupom neuronów na pełnienie wyspecjalizowanych funkcji w obrębie sieci neuronalnej^6,7. Zmiany w morfologii dendrytów, w tym fragmentacja dendrytów i zmiany w wzorcach rozgałęzień, zostały zaobserwowane w szeregu stanów chorobowych, w tym w chorobie Alzheimera⁸, schizofrenii^9,10 oraz w niepełnosprawności intelektualnej¹¹. Zdolność zarówno do zrozumienia czynników kształtujących morfologię dendrytów, jak i do identyfikowania zmian w ich budowie, jest niezbędna do zrozumienia funkcjonowania i dysfunkcji układu nerwowego.

Morfologię neurytów często analizuje się za pomocą analizy Sholla oraz poprzez zliczanie liczby neurytów i liczby końcówek gałęzi. Analizę tę stosuje się zazwyczaj do dendrytów, ale można ją również zastosować do aksonów. Wykonywanie tej analizy ręcznie jest czasochłonne i nieuchronnie wprowadza zmienność wynikającą z subiektywizmu i niespójności badacza. Program Bonfire stanowi półautomatyczne podejście do analizy morfologii dendrytów i aksonów, opierające się na dostępnych narzędziach do analizy morfologicznej z otwartym kodem źródłowym. Nasz program umożliwia wykrywanie lokalnych zmian w zachowaniach rozgałęziania dendrytów i aksonów poprzez przeprowadzanie analizy Sholla w podregionach drzewa neurytowego. Przykładowo, analiza Sholla jest wykonywana zarówno dla całego neuronu, jak i dla każdego podzbioru wypustek (pierwotnych, wtórnych, końcowych, korzeniowych itd.). Wzorzec budowy dendrytów i aksonów jest kształtowany przez szereg czynników wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, z których wiele działa lokalnie. W związku z tym wynikowa morfologia drzewa jest efektem specyficznych procesów oddziałujących na konkretne neuryty, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie analizy morfologicznej w mniejszej skali, aby zaobserwować te lokalne wariacje¹².

Program Bonfire wymaga zastosowania dwóch narzędzi analitycznych o otwartym kodzie źródłowym: wtyczki NeuronJ do programu ImageJ oraz programu NeuronStudio. Neurony są śledzone w programie ImageJ, a NeuronStudio służy do zdefiniowania połączeń między neurytami. Bonfire zawiera szereg niestandardowych skryptów napisanych w języku MATLAB (MathWorks), które są wykorzystywane do konwersji danych do odpowiedniego formatu w celu dalszej analizy, sprawdzania błędów użytkownika, a w końcowej fazie do przeprowadzenia analizy Sholla. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Schemat blokowy programu Bonfire przedstawiono na Rysunku 1.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem:

1) Disekcja szczura w dniu E18:

Standardowe metody wycinania neuronów hipokampa z zarodków w 18. dniu rozwoju (E18) zostały opisane wcześniej¹³. Aby móc wykorzystać program Bonfire do analizy cech morfologicznych neurytów, należy uzyskać 8-bitowe obrazy pojedynczych neuronów w formacie .tif. Można to osiągnąć na kilka sposobów, w zależności od stosowanego protokołu eksperymentalnego. Neurony można wysiać z wystarczająco niską gęstością, tak aby w polu widzenia mikroskopu znajdowały się pojedyncze komórki. Alternatywnie, aby obrazować pojedyncze neurony hodowane w gęstej kulturze, można przeprowadzić transfekcję neuronów za pomocą różnych metod, używając plazmidu kodującego białko fluorescencyjne.

2) Wymagania i instalacja oprogramowania:

1. W celu uruchomienia programu Bonfire należy zainstalować wtyczkę NeuronJ do oprogramowania ImageJ z NIH oraz program NeuronStudio. Pakiety oprogramowania można znaleźć na następujących stronach internetowych:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. Program Bonfire znajduje się pod adresem http://lifesci.rutgers.edu/~firestein. Na tej stronie dostępny jest również podręcznik użytkownika Bonfire. Ponadto wstępny opis programu Bonfire można znaleźć w publikacji Langhammer et al, Cytometry 2010. Wszystkie nasze dane zostały przeanalizowane przy użyciu systemu operacyjnego Windows.

3) Regulacja rozdzielczości obrazu:

Należy dostosować program Bonfire do rozdzielczości obrazów, które mają zostać przeanalizowane. W sekcji bonfire_parameters programu Bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej pix_conv wartością rozdzielczości obrazu (μm/pixel) dla analizowanych zdjęć.

2. Struktura plików:

Aby program Bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane zgodnie z poniższą strukturą (Rysunek 2). Będą one zawierać:

• Folder główny
• Podfoldery (zawierające poszczególne warianty warunków doświadczalnych)
• Pliki z obrazami komórek (pliki filename.tif) znajdujące się w folderach poszczególnych warunków
• Folder Bonfire zawierający pliki m-files programu Matlab Bonfire (znajdujący się również w folderze głównym)

3. Śledzenie neuronów w programie NeuronJ:

1. Przygotowanie obrazu do obrysowywania
   1. Otwórz obraz, klikając przycisk „Open” na pasku narzędzi NeuronJ i wybierając obraz, który chcesz obrysować.
   2. Zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk „maximize”.
   3. Dostosuj jasność i kontrast obrazu tak, aby możliwe było zwizualizowanie wszystkich neurytów, wybierając opcję „Image” na pasku narzędzi NeuronJ, a następnie „Adjust brightness/contrast”.
2. Obrysowanie ciała komórki w NeuronJ i zdefiniowanie obrysu jako „Type 06”
   1. Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. Obrysuj obwód ciała komórki.
   3. Wybierz przycisk „Label Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   4. Wybierz „N1” z rozwijanego menu „Tracing ID”.
   5. W oknie „NeuronJ: Attributes” wybierz „Type 06”, a następnie kliknij „OK”.
3. Obrysowywanie neurytów w NeuronJ
   1. Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. Dodaj obrys wzdłuż każdej gałęzi neurytu. W zależności od eksperymentu można wybrać tylko dendryty lub akson.
   3. Sugerujemy, aby rysowane segmenty kończyły się w każdym punkcie rozgałęzienia, a każda gałąź potomna rozpoczynała się w tym punkcie jako nowy obrys.
   4. Wybierz przycisk „Save Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   5. Zapisz utworzony obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu.
4. Eksport plików z obrysami i pliku identyfikatora obrysów z NeuronJ
   Z NeuronJ należy wyeksportować dwa rodzaje plików i zapisać je w odpowiednich folderach z warunkami, wraz z plikami .tif i .ndf.
   1. Wybierz przycisk „Export Trace” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. W oknie dialogowym „NeuronJ: Export” wybierz opcję „Tab-deliminated text-files: separate file for each tracing” i kliknij „OK”.
   3. Pozwól programowi NeuronJ wybrać nazwy plików oraz miejsce zapisu.
   4. Wybierz przycisk „Measure Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   5. W oknie „NeuronJ: Measurements” wybierz opcję „Display tracing measurements” i kliknij „Run”.
   6. W oknie „NeuronJ: Tracings” wybierz „File”.
   7. Wybierz „Save As” i zapisz plik jako filename_info. „filename” musi dokładnie odpowiadać nazwie oryginalnego pliku obrazu (w tym wielkości liter), po której następuje _info; nazwa nie powinna zawierać 3-literowego rozszerzenia pliku. Na przykład dla oryginalnej nazwy obrazu Cell20.tif plik ten zostanie nazwany „Cell20_info”. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku .xls. Jeśli tak się stanie, rozszerzenie pliku należy usunąć ręcznie.

4. Użycie programu Bonfire do zbudowania wstępnych plików .swc na podstawie danych z NeuronJ:

1. Reorganizacja folderów przy użyciu polecenia 'bonfire_load'
   1. Otwórz program Matlab, klikając dwukrotnie ikonę.
   2. Kliknij przycisk ' ' w prawym górnym rogu okna poleceń.
   3. W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder 'Bonfire' znajdujący się w folderze głównym.
   4. Wpisz 'bonfire_load' w oknie poleceń Matlab i naciśnij enter.
   5. W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie kliknij 'OK'.
   6. Spowoduje to reorganizację struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów dla poszczególnych komórek, zawierających wszystkie dane dla każdej z nich.
2. Tworzenie plików filename_prelim.swc przy użyciu polecenia 'bonfire_ndf2swc'
   1. Wpisz 'bonfire_ndf2swc' w oknie poleceń i naciśnij enter.
   2. W oknie 'Browse For Folder' wybierz ten sam folder z warunkiem, który został wcześniej zreorganizowany za pomocą 'bonfire_load', a następnie kliknij 'OK'.
   3. W folderze każdej komórki dla wybranego warunku zostanie utworzony plik .swc. Każdy folder komórki będzie teraz zawierał 5 plików: oryginalny obraz .tif, plik .ndf, plik identyfikatora śladu _info, plik .txt oraz plik .swc.

5. Użycie NeuronStudio do sfinalizowania plików .swc:

1. Otwarcie i kalibracja obrazów neuronów w programie NeuronStudio
   1. Uruchom program NeuronStudio.
   2. W pasku narzędzi NeuronStudio wybierz File→Open.
   3. Znajdź i otwórz obraz neuronu w formacie .tif, który chcesz edytować.
   4. Wybierz Run→Settings i wpisz wartość „1” w każdym z 3 pól (X,Y,Z) w oknie „Voxel Size”.
   5. Wybierz File→Import SWC. Wybierz odpowiedni plik .swc. Na obrazie pojawi się nałożony ślad. Ciało komórki powinno być zaznaczone czerwonym okręgiem.
2. Użycie NeuronStudio do łączenia neurytów
   1. Użyj narzędzi w programie NeuronStudio, aby prawidłowo zidentyfikować punkty rozgałęzień oraz punkty końcowe (zaleca się zapoznanie z funkcjami i skrótami NeuronStudio przed analizą danych).
   2. W szczególności użyj „neurite tool” do łączenia węzłów w taki sposób, aby:
      • Każdy punkt rozgałęzienia (żółte węzły) tworzył tylko dwie odnogi
      • Wszystkie ślady były ciągłe i połączone z somą (tylko jeden czerwony węzeł)
3. Eksport danych z NeuronStudio
   1. Wybierz File→Save Neurites (zapisz pod domyślną nazwą).
4. Sprawdzanie błędów w plikach .swc za pomocą „bonfire_trace_check”
   1. Wpisz „bonfire_trace_check” w oknie poleceń programu Matlab i naciśnij enter.
   2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z danymi warunkowymi, które przed chwilą przetworzyłeś, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”.
   3. Jeśli w którymkolwiek z obrazów w folderze wystąpią błędy, program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu.
   4. Korygowanie błędów w NeuronStudio
      1. Otwórz plik obrazu zapisany w kroku eksportu.
      2. Zlokalizuj i napraw błąd(y).
      3. Kliknij File→Save Neurites.
      4. Powtórz czynność dla pozostałych obrazów wymagających poprawy.
      5. Ponownie uruchom „bonfire_trace_check” (5.4).

6. Użycie narzędzia „bonfire” do ekstrakcji danych morfologicznych z plików .swc:

1. Wpisz polecenie 'bonfire' w oknie komend i naciśnij enter.
2. W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz przeanalizować, a następnie wybierz 'OK'.
3. Analiza Bonfire wygeneruje okno dla każdego z analizowanych neuronów, w którym zostanie przedstawiony wykres morfologii neuronów wraz z pierścieniami Sholla wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie 'bonfire' utworzy plik .mat zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy.

7. Użyj 'bonfire_results', aby wyświetlić dane:

1. Wpisz 'bonfire_results' w oknie poleceń programu Matlab.
2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder warunków, które chcesz wyświetlić, a następnie wybierz „OK”.
3. Okno „Browse for Folder” zostanie tymczasowo zamknięte i ponownie otwarte, umożliwiając wybór dodatkowych warunków do wyświetlenia.
4. Po zakończeniu wyboru folderów z warunkami wybierz „Cancel”, aby wyjść z procesu selekcji.
5. Funkcja 'Bonfire_results' wygeneruje wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów warunków.

8. Użyj funkcji „bonfire_export”, aby wyeksportować dane do programu Excel:

1. Wpisz polecenie 'bonfire_export' w oknie komend.
2. W oknie „Przeglądaj foldery” wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz wyeksportować, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”. Bonfire_export utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i umieści je w wybranym folderze warunków.

9. Reprezentatywne wyniki:

Przykład danych wygenerowanych przez program Bonfire dla zbioru danych zawierającego dwa warunki przedstawiono na Rysunku 3. W tym przykładzie neurony w Warunku 1 posiadają więcej neurytów w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Zjawisko to można zaobserwować na obrazach przykładowych (Rysunek 3B), a także na krzywej Sholla dla całkowitego drzewa dendrytycznego (Rysunek 3A) oraz na wykresie liczby punktów końcowych (Rysunek 3C). Ponadto, ponieważ program Bonfire wykonuje również analizę Sholla w podregionach obrazów, jesteśmy w stanie dokładniej zidentyfikować rodzaj neurytów, których liczba wzrosła. Zarówno całkowita liczba przecięć neurytów 3^rd rzędu lub wyższych (Rysunek 3F), jak i całkowita liczba neurytów pośrednich i końcowych (Rysunek 3G) są zwiększone w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Trendy te można zaobserwować również na Rysunkach 3D i 3E.

Rysunek 1: Schemat działania programu Bonfire. Neurony są śledzone przy użyciu ImageJ. Następnie dane są eksportowane i konwertowane przez program Bonfire na wstępne pliki .swc. NeuronStudio służy do zdefiniowania łączności neurytów. Bonfire weryfikuje błędy, a następnie oblicza krzywe Sholla, liczbę neurytów pierwotnych, wtórnych i wyższych rzędów oraz liczbę punktów rozgałęzień i końcówek neurytów. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.

Rysunek 2: Struktura plików wymagana do analizy w programie Bonfire. Struktura plików musi być zgodna z przedstawioną, w przeciwnym razie program nie będzie działać prawidłowo. Nazwy folderów i plików oraz liczba folderów i plików mogą zostać zmienione.

Rysunek 3: Przykładowe dane wyjściowe z programu Bonfire. A) Całkowite krzywe Sholla. B) Przykładowe odwrócone obrazy dla obu warunków. C) Średnia liczba punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę. D) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów pierwotnych, wtórnych oraz trzeciorzędowych lub wyższych. E) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów korzeniowych, pośrednich i końcowych. F) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty zostały pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędowe lub wyższe. G) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty zostały pogrupowane jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.

Dyskusja

Program Bonfire jest półautomatycznym narzędziem do analizy morfologii dendrytów i aksonów. Znacznie zwiększa on wydajność i dokładność analizy Sholla w porównaniu do prowadzenia analizy ręcznie. Ponadto program Bonfire zapisuje dane na każdym etapie procesu, co umożliwia audyt danych oraz weryfikację dokładności analizy. Dzięki temu zadanie analizy danych może zostać rozdzielone pomiędzy wiele osób bez utraty precyzji. Wreszcie, poprzez przeprowadzanie analizy w podregionach obrazów, program jest w stanie zidentyfikować...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wtyczka NeuronJ			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
Oprogramowanie ImageJ			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Program Bonfire			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
Program MatLab	Mathworks