Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Morfologia neuronalna odgrywa istotną rolę w określaniu sposobu, w jaki neurony funkcjonują i komunikują się ze sobą1-3. W szczególności wpływa ona na zdolność neuronów do odbierania sygnałów z innych komórek2 oraz przyczynia się do propagacji potencjałów czynnościowych4,5. Morfologia neurytów wpływa również na sposób przetwarzania informacji. Różnorodność morfologii dendrytów ułatwia sygnalizację lokalną i dalekosiężną, umożliwiając pojedynczym neuronom lub grupom neuronów pełnienie wyspecjalizowanych funkcji w obrębie sieci neuronalnej6,7. Zmiany w morfologii dendrytów, w tym fragmentacja dendrytów oraz zmiany w wzorcach rozgałęzień, zostały zaobserwowane w wielu stanach chorobowych, w tym w chorobie Alzheimera8, schizofrenii9,10 oraz w opóźnieniu rozwoju intelektualnego11. Zdolność zarówno do zrozumienia czynników kształtujących morfologię dendrytów, jak i do identyfikacji zmian w tej morfologii, jest niezbędna dla zrozumienia funkcji i dysfunkcji układu nerwowego.
Morfologię neurytów często analizuje się za pomocą analizy Sholla oraz poprzez zliczanie liczby neurytów i liczby zakończeń gałęzi. Analizę tę stosuje się zazwyczaj do dendrytów, ale można ją również zastosować do aksonów. Przeprowadzanie tej analizy ręcznie jest czasochłonne i nieuchronnie wprowadza zmienność wynikającą z błędu eksperymentatora i braku spójności. Program Bonfire jest półautomatycznym podejściem do analizy morfologii dendrytów i aksonów, opartym na dostępnych narzędziach do analizy morfologicznej z otwartym kodem źródłowym. Nasz program umożliwia wykrywanie lokalnych zmian w zachowaniu rozgałęzień dendrytów i aksonów poprzez wykonywanie analizy Sholla w podregionach drzewa neurytów. Na przykład analiza Sholla jest przeprowadzana zarówno dla całego neuronu, jak i dla każdego podzbioru wypustek (pierwotnych, wtórnych, terminalnych, korzeniowych itp.). Na wzorce rozgałęzień dendrytów i aksonów wpływa szereg czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, z których wiele działa lokalnie. W związku z tym wynikająca morfologia drzewa jest efektem specyficznych procesów oddziałujących na konkretne neuryty, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie analizy morfologicznej w mniejszej skali, aby zaobserwować te lokalne wariacje12.
Program Bonfire wymaga użycia dwóch otwartoźródłowych narzędzi analitycznych: wtyczki NeuronJ do programu ImageJ oraz programu NeuronStudio. Neurony są śledzone w ImageJ, a NeuronStudio służy do definiowania łączności między neurytami. Bonfire zawiera szereg niestandardowych skryptów napisanych w języku MATLAB (MathWorks), które są wykorzystywane do konwersji danych do odpowiedniego formatu w celu dalszej analizy, sprawdzania błędów użytkownika, a ostatecznie do przeprowadzenia analizy Sholla. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Schemat blokowy programu Bonfire przedstawiono na Ryc. 1.
Protokół
1. Przed rozpoczęciem:
1) Disekcja szczura w 18. dniu embrionalnym (E18):
Standardowe metody preparowania neuronów hipokampa E18 zostały opisane wcześniej13. Aby wykorzystać program Bonfire do analizy cech morfologicznych neurytów, należy uzyskać 8-bitowe obrazy .tif pojedynczych neuronów. Można to osiągnąć na kilka sposobów, w zależności od stosowanego protokołu eksperymentalnego. Neurony można wysiać z odpowiednio niską gęstością, tak aby w polu widzenia mikroskopu pojawiły się pojedyncze komórki. Alternatywnie, w celu obrazowania pojedynczych neuronów hodowanych w gęstej kulturze, można przeprowadzić transfekcję neuronów za pomocą różnych metod z wykorzystaniem plazmidu kodującego białko fluorescencyjne.
2) Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja:
- Aby uruchomić program Bonfire, należy zainstalować zarówno wtyczkę NeuronJ do oprogramowania ImageJ z NIH, jak i program NeuronStudio. Pakiety oprogramowania można znaleźć na następujących stronach internetowych:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Program Bonfire znajduje się pod adresem http://lifesci.rutgers.edu/~firestein. Pod tym adresem dostępna jest również instrukcja obsługi Bonfire. Ponadto pierwotny opis programu Bonfire można znaleźć w publikacji Langhammer et al, Cytometry 2010. Wszystkie nasze dane zostały przeanalizowane z wykorzystaniem systemu operacyjnego Windows.
3) Regulacja rozdzielczości obrazu:
Należy dostosować program Bonfire do rozdzielczości obrazów, które mają zostać poddane analizie. W sekcji bonfire_parameters programu Bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej pix_conv wartością rozdzielczości obrazu (μm/pixel) dla używanych obrazów.
2. Struktura plików:
Aby program Bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane zgodnie z następującą strukturą (Rysunek 2). Będziesz posiadać:
- Folder główny
- Podfoldery (zawierające każdą z Twoich różnych warunków
- Pliki obrazów komórek (pliki filename.tif) znajdujące się w folderach poszczególnych warunków
- Folder Bonfire zawierający pliki mfiles Bonfire Matlab (znajdujący się również w folderze głównym)
3. Śledzenie neuronów w programie NeuronJ:
- Przygotowanie obrazu do obrysowywania
- Otwórz obraz, klikając przycisk „Open” na pasku narzędzi NeuronJ i wybierając obraz, który chcesz obrysować.
- Zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk „maximize”.
- Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby umożliwić wizualizację wszystkich neurytów, wybierając opcję „Image” na pasku narzędzi NeuronJ, a następnie „Adjust brightness/contrast”.
- Obrysowanie ciała komórki w programie NeuronJ i zidentyfikowanie obrysu jako „Type 06”
- Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
- Obrysuj obwód ciała komórki.
- Wybierz przycisk „Label Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
- Z rozwijanego menu „Tracing ID” wybierz „N1”.
- W oknie NeuronJ: Attributes wybierz „Type 06”, a następnie kliknij „OK”.
- Obrysowywanie neurytów w programie NeuronJ
- Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
- Dodaj obrys wzdłuż każdej gałęzi neurytu. W zależności od eksperymentu można wybrać tylko dendryty lub akson.
- Zaleca się, aby rysowane segmenty kończyły się na każdym punkcie rozgałęzienia, a każda gałąź potomna zaczynała się w tym punkcie jako nowy obrys.
- Wybierz przycisk „Save Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
- Zapisz utworzony obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu.
- Eksport plików obrysów i pliku identyfikatora obrysu z programu NeuronJ
Z programu NeuronJ należy wyeksportować dwa typy plików i zapisać je w odpowiednich folderach z warunkami, obok plików .tif i .ndf.- Wybierz przycisk „Export Trace” na pasku narzędzi NeuronJ.
- W oknie dialogowym „NeuronJ: Export” wybierz opcję „Tab-deliminated text-files: separate file for each tracing”, a następnie kliknij „OK”.
- Pozwól programowi NeuronJ wybrać nazwy plików oraz lokalizację zapisu.
- Wybierz przycisk „Measure Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
- W oknie „NeuronJ: Measurements” wybierz opcję „Display tracing measurements”, a następnie kliknij „Run”.
- W oknie „NeuronJ: Tracings” wybierz „File”.
- Wybierz „Save As” i zapisz plik jako filename_info. „filename” musi być identyczny z nazwą oryginalnego pliku obrazu (w tym z wielkością liter), po której następuje _info; nazwa nie powinna zawierać 3-literowego rozszerzenia pliku. Na przykład dla oryginalnej nazwy obrazu Cell20.tif, plik ten zostanie nazwany „Cell20_info”. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku .xls. Jeśli tak się stanie, rozszerzenie pliku należy usunąć ręcznie.
4. Użycie programu Bonfire do zbudowania wstępnych plików .swc na podstawie danych z NeuronJ:
- Reorganizacja folderów za pomocą funkcji 'bonfire_load'
- Otwórz program Matlab, klikając dwukrotnie w ikonę.
- Kliknij przycisk ' ' w prawym górnym rogu okna poleceń.
- W oknie „Browse For Folder” wybierz folder 'Bonfire' w folderze głównym.
- Wpisz 'bonfire_load' w oknie poleceń Matlab i naciśnij enter.
- W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie wybierz 'OK'.
- Doprowadzi to do reorganizacji struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów komórek zawierających wszystkie dane dla każdej poszczególnej komórki.
- Tworzenie plików filename_prelim.swc za pomocą funkcji 'bonfire_ndf2swc'
- Wpisz 'bonfire_ndf2swc' w oknie poleceń i naciśnij enter.
- W oknie „Browse For Folder” wybierz ten sam folder z warunkiem, który przed chwilą zreorganizowano za pomocą 'bonfire_load', a następnie wybierz 'OK'.
- Spowoduje to utworzenie pliku .swc w każdym folderze komórki dla wybranego warunku. Każdy folder komórki będzie teraz zawierać 5 plików: oryginalny obraz .tif, plik .ndf, plik identyfikatora śladu _info, plik .txt oraz plik .swc.
5. Użycie NeuronStudio do sfinalizowania plików .swc:
- Otwieranie i kalibracja obrazów neuronów w programie NeuronStudio
- Uruchom program NeuronStudio.
- W pasku narzędzi NeuronStudio wybierz File→Open.
- Znajdź obraz neuronu w formacie .tif, który chcesz edytować, i otwórz go.
- Wybierz Run→Settings i wpisz „1” w każdym z 3 pól (X, Y, Z) w oknie „Voxel Size”.
- Wybierz File→Import SWC. Wybierz odpowiedni plik .swc. Na obrazie pojawi się nałożony ślad (trace). Ciało komórki (soma) powinno być oznaczone czerwonym okręgiem.
- Użycie programu NeuronStudio do łączenia neurytów
- Użyj narzędzi w NeuronStudio, aby prawidłowo zidentyfikować punkty rozgałęzień i punkty końcowe (zalecamy zapoznanie się z funkcjami i skrótami klawiszowymi NeuronStudio przed analizą danych).
- W szczególności użyj narzędzia „neurite tool”, aby łączyć węzły w taki sposób, by:
- każdy punkt rozgałęzienia (żółte węzły) tworzył tylko dwie gałęzie,
- wszystkie ślady były ciągłe i połączone z somą (tylko jeden czerwony węzeł).
- Eksport danych z NeuronStudio
- Wybierz File→Save Neurites (zapisz pod domyślną nazwą).
- Sprawdzanie błędów w plikach .swc za pomocą funkcji „bonfire_trace_check”
- Wpisz „bonfire_trace_check” w oknie poleceń programu Matlab i naciśnij enter.
- W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które właśnie przetworzyłeś, a następnie zatwierdź wybór przyciskiem „OK”.
- Jeśli w którymkolwiek z obrazów w folderze wystąpią błędy, program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu.
- Naprawianie błędów w NeuronStudio:
- Otwórz plik obrazu zapisany na etapie eksportu.
- Zlokalizuj i napraw problem(y).
- Kliknij File→Save Neurites.
- Powtórz czynność dla pozostałych obrazów wymagających poprawy.
- Ponownie uruchom „bonfire_trace_check” (punkt 5.4).
6. Użycie programu „bonfire” do wyodrębnienia danych morfologicznych z plików .swc:
- Wpisz polecenie 'bonfire' w oknie komend i naciśnij enter.
- W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz przeanalizować, a następnie kliknij 'OK'.
- Analiza Bonfire wygeneruje okno dla każdego z analizowanych neuronów, w którym zostanie przedstawiony wykres morfologii neuronalnej wraz z pierścieniami Sholla wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie 'bonfire' utworzy plik .mat zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy.
7. Użyj 'bonfire_results', aby wyświetlić dane:
- Wpisz 'bonfire_results' w oknie poleceń programu Matlab.
- W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkiem, który chcesz wyświetlić, a następnie zatwierdź przyciskiem 'OK'.
- Okno 'Browse for Folder' zostanie tymczasowo zamknięte i otworzy się ponownie, umożliwiając wybór dodatkowych warunków do wyświetlenia.
- Po zakończeniu wyboru folderów z warunkami wybierz 'Cancel', aby wyjść z procesu selekcji.
- Funkcja 'Bonfire_results' wygeneruje wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami.
8. Użyj funkcji „bonfire_export”, aby wyeksportować dane do programu Excel:
- Wpisz polecenie 'bonfire_export' w oknie wiersza poleceń.
- W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz wyeksportować, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”. Narzędzie Bonfire_export utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i zapisze je w wybranym folderze z warunkami.
9. Reprezentatywne wyniki:
Przykład danych wygenerowanych przez program Bonfire dla zestawu danych obejmującego dwa warunki przedstawiono w Rycina 3W tym przykładzie neurony w warunkach 1 (Condition 1) posiadają więcej neurytów dystalnie względem ciała komórki. Zjawisko to można zaobserwować na obrazach przykładów (Rysunek 3B) a także na krzywej Sholla całkowitego drzewa dendrytycznego (Rycina 3A) oraz na wykresie liczby punktów końcowych (Rysunek 3C). Ponadto, ponieważ program Bonfire przeprowadza również analizę Sholla w obrębie podregionów obrazów, jesteśmy w stanie dokładniej zidentyfikować rodzaj neurytów, których liczba uległa zwiększeniu. Zarówno całkowita liczba przecięć 3rd neurytów rzędu lub większego (Rycina 3F) oraz całkowita liczba neurytów pośrednich i końcowych (Rycina 3G) zwiększają się dystalnie w stosunku do ciała komórki. Tendencje te można zaobserwować również w Ryciny 3D i 3E.
Rycina 1: Schemat blokowy programu Bonfire. Neurony są śledzone przy użyciu ImageJ. Następnie dane są eksportowane i konwertowane przez program Bonfire do wstępnych plików .swc. Program NeuronStudio służy do definiowania łączności neurytów. Bonfire sprawdza występowanie błędów, a następnie oblicza krzywe Sholla, liczbę neurytów pierwotnych, wtórnych i wyższego rzędu oraz liczbę punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.
Rysunek 2: Struktura plików wymagana do analizy w programie Bonfire. Struktura plików musi być zgodna z przedstawioną, w przeciwnym razie program nie będzie działał poprawnie. Nazwy folderów i plików oraz ich liczba mogą zostać zmienione.
Rysunek 3: Przykładowe dane wyjściowe z programu Bonfire. A) Całkowite krzywe Sholla. B) Przykład odwróconych obrazów dla obu warunków. C) Średnia liczba punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę. D) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów pierwotnych, wtórnych oraz trzeciorzędowych lub wyższych. E) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów korzeniowych, pośrednich i końcowych. F) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty są pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędowe i wyższe. G) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty są pogrupowane jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Program Bonfire jest programem półautomatycznym służącym do analizy morfologii dendrytów i aksonów. Znacznie zwiększa on wydajność i dokładność analizy Sholla w porównaniu do przeprowadzania tej analizy ręcznie. Ponadto program Bonfire zapisuje dane na każdym etapie procesu, co umożliwia audyt danych oraz weryfikację dokładności analizy. Dzięki temu zadanie analizy danych można rozdzielić pomiędzy wiele osób bez utraty precyzji. Wreszcie, poprzez przeprowadzanie analizy w podregionach obrazów, program jest w stanie ziden...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów. Agencje finansujące nie brały udziału w opracowaniu Bonfire od strony naukowej.
Podziękowania
Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu Busch Biomedical, grantu NSF IBN-0548543, grantu NSF IBN-0919747, grantu fundacji March of Dimes 1-FY04-107 oraz grantu fundacji March of Dimes 1-FY08-464 (przyznanego B.L.F). M.K.K. oraz C.G.L. otrzymali wsparcie z grantu szkoleniowego NIH Biotechnology Training Grant T32 GM008339-20, a C.G.L. otrzymał również stypendium przeddoktoranckie NJ Commission on Spinal Cord Research 08-2941-SCR-E-0.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wtyczka NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| Oprogramowanie ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Program Bonfire | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| Program MatLab | Mathworks |
Bibliografia
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
