Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Podsumowanie

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Streszczenie

Morfologia neuronalna odgrywa istotną rolę w określaniu sposobu, w jaki neurony funkcjonują i komunikują się ze sobą^1-3. W szczególności wpływa ona na zdolność neuronów do odbierania sygnałów z innych komórek² oraz przyczynia się do propagacji potencjałów czynnościowych^4,5. Morfologia neurytów wpływa również na sposób przetwarzania informacji. Różnorodność morfologii dendrytów ułatwia sygnalizację lokalną i dalekosiężną, umożliwiając pojedynczym neuronom lub grupom neuronów pełnienie wyspecjalizowanych funkcji w obrębie sieci neuronalnej^6,7. Zmiany w morfologii dendrytów, w tym fragmentacja dendrytów oraz zmiany w wzorcach rozgałęzień, zostały zaobserwowane w wielu stanach chorobowych, w tym w chorobie Alzheimera⁸, schizofrenii^9,10 oraz w opóźnieniu rozwoju intelektualnego¹¹. Zdolność zarówno do zrozumienia czynników kształtujących morfologię dendrytów, jak i do identyfikacji zmian w tej morfologii, jest niezbędna dla zrozumienia funkcji i dysfunkcji układu nerwowego.

Morfologię neurytów często analizuje się za pomocą analizy Sholla oraz poprzez zliczanie liczby neurytów i liczby zakończeń gałęzi. Analizę tę stosuje się zazwyczaj do dendrytów, ale można ją również zastosować do aksonów. Przeprowadzanie tej analizy ręcznie jest czasochłonne i nieuchronnie wprowadza zmienność wynikającą z błędu eksperymentatora i braku spójności. Program Bonfire jest półautomatycznym podejściem do analizy morfologii dendrytów i aksonów, opartym na dostępnych narzędziach do analizy morfologicznej z otwartym kodem źródłowym. Nasz program umożliwia wykrywanie lokalnych zmian w zachowaniu rozgałęzień dendrytów i aksonów poprzez wykonywanie analizy Sholla w podregionach drzewa neurytów. Na przykład analiza Sholla jest przeprowadzana zarówno dla całego neuronu, jak i dla każdego podzbioru wypustek (pierwotnych, wtórnych, terminalnych, korzeniowych itp.). Na wzorce rozgałęzień dendrytów i aksonów wpływa szereg czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, z których wiele działa lokalnie. W związku z tym wynikająca morfologia drzewa jest efektem specyficznych procesów oddziałujących na konkretne neuryty, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie analizy morfologicznej w mniejszej skali, aby zaobserwować te lokalne wariacje¹².

Program Bonfire wymaga użycia dwóch otwartoźródłowych narzędzi analitycznych: wtyczki NeuronJ do programu ImageJ oraz programu NeuronStudio. Neurony są śledzone w ImageJ, a NeuronStudio służy do definiowania łączności między neurytami. Bonfire zawiera szereg niestandardowych skryptów napisanych w języku MATLAB (MathWorks), które są wykorzystywane do konwersji danych do odpowiedniego formatu w celu dalszej analizy, sprawdzania błędów użytkownika, a ostatecznie do przeprowadzenia analizy Sholla. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Schemat blokowy programu Bonfire przedstawiono na Ryc. 1.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem:

1) Disekcja szczura w 18. dniu embrionalnym (E18):

Standardowe metody wycinania neuronów hipokampa E18 zostały opisane wcześniej¹³. Aby wykorzystać program Bonfire do analizy charakterystyki morfologicznej neurytów, należy uzyskać 8-bitowe obrazy .tif poszczególnych neuronów. Można to osiągnąć na kilka sposobów, w zależności od stosowanego protokołu eksperymentalnego. Neurony można wysiać z wystarczająco niską gęstością, aby w polu widzenia mikroskopu pojawiły się pojedyncze komórki. Alternatywnie, w celu obrazowania pojedynczych neuronów hodowanych w gęstej kulturze, można je transfekować za pomocą różnych metod transfekcji plazmidem kodującym białko fluorescencyjne.

2) Wymagania i instalacja oprogramowania:

1. Aby uruchomić program Bonfire, należy zainstalować wtyczkę NeuronJ do oprogramowania ImageJ z NIH oraz program NeuronStudio. Pakiety oprogramowania można znaleźć na następujących stronach internetowych:
   ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
   NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
   NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
2. Program Bonfire jest dostępny pod adresem http://lifesci.rutgers.edu/~firestein. Pod tym adresem znajduje się również podręcznik użytkownika Bonfire. Ponadto wstępny opis programu Bonfire można znaleźć w publikacji Langhammer et al, Cytometry 2010. Wszystkie nasze dane zostały przeanalizowane przy użyciu systemu operacyjnego Windows.

3) Dostosowanie rozdzielczości obrazu:

Należy dostosować program Bonfire do rozdzielczości obrazów, które chcesz analizować. W sekcji bonfire_parameters programu Bonfire zastąp aktualną wartość zmiennej pix_conv wartością rozdzielczości obrazu (μm/pixel) Twoich zdjęć.

2. Struktura plików:

Aby program Bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane zgodnie z poniższą strukturą (Rysunek 2). Należy przygotować:

• Folder główny
• Podfoldery (zawierające poszczególne warianty warunków doświadczalnych)
• Pliki z obrazami komórek (pliki filename.tif) znajdujące się w folderach z poszczególnymi warunkami
• Folder Bonfire zawierający pliki m Bonfire Matlab (znajdujący się również w folderze głównym)

3. Śledzenie neuronów w programie NeuronJ:

1. Przygotowanie obrazu do obrysowywania
   1. Otwórz obraz, klikając przycisk „Open” na pasku narzędzi NeuronJ i wybierając obraz, który chcesz obrysować.
   2. Zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk „maximize”.
   3. Dostosuj jasność i kontrast obrazu tak, aby można było zwizualizować wszystkie neuryty, wybierając opcję „Image” na pasku narzędzi NeuronJ, a następnie „Adjust brightness/contrast”.
2. Obrysowanie ciała komórki w programie NeuronJ i zidentyfikowanie obrysu jako „Type 06”
   1. Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. Obrysuj obwód ciała komórki.
   3. Wybierz przycisk „Label Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   4. Wybierz „N1” z menu rozwijanego „Tracing ID”.
   5. W oknie „NeuronJ: Attributes” wybierz „Type 06”, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”.
3. Obrysowywanie neurytów w programie NeuronJ
   1. Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. Dodaj obrys wzdłuż każdego odgałęzienia neurytu. W zależności od eksperymentu możesz wybrać tylko dendryty lub akson.
   3. Sugerujemy, aby rysowane segmenty kończyły się na każdym punkcie rozgałęzienia, a każde odgałęzienie potomne rozpoczynało się w tym punkcie jako nowy obrys.
   4. Wybierz przycisk „Save Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   5. Zapisz utworzony obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu.
4. Eksport plików obrysów i pliku identyfikatora obrysu z programu NeuronJ
   Z programu NeuronJ należy wyeksportować dwa typy plików i zapisać je w odpowiednich folderach z warunkami, wraz z plikami .tif i .ndf.
   1. Wybierz przycisk „Export Trace” na pasku narzędzi NeuronJ.
   2. W oknie dialogowym „NeuronJ: Export” wybierz opcję „Tab-deliminated text-files: separate file for each tracing” i zatwierdź przyciskiem „OK”.
   3. Pozwól programowi NeuronJ wybrać nazwy plików oraz lokalizację zapisu.
   4. Wybierz przycisk „Measure Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.
   5. W oknie „NeuronJ: Measurements” wybierz opcję „Display tracing measurements” i kliknij „Run”.
   6. W oknie „NeuronJ: Tracings” wybierz „File”.
   7. Wybierz „Save As” i zapisz plik jako filename_info. „filename” musi dokładnie odpowiadać nazwie oryginalnego pliku obrazu (łącznie z wielkością liter), a następnie następować po nim _info; nazwa nie powinna zawierać 3-literowego rozszerzenia pliku. Na przykład dla oryginalnej nazwy obrazu Cell20.tif plik ten będzie nazywał się „Cell20_info”. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku .xls. Jeśli tak się stanie, rozszerzenie pliku należy usunąć ręcznie.

4. Użycie programu Bonfire do utworzenia wstępnych plików .swc na podstawie danych z NeuronJ:

1. Reorganizacja folderów za pomocą funkcji 'bonfire_load'
   1. Otwórz program Matlab, klikając dwukrotnie w ikonę.
   2. Kliknij przycisk ' ' w prawym górnym rogu okna poleceń.
   3. W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder 'Bonfire' w swoim folderze głównym.
   4. Wpisz 'bonfire_load' w oknie poleceń Matlab i naciśnij enter.
   5. W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie wybierz 'OK'.
   6. Spowoduje to reorganizację struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów dla poszczególnych komórek, zawierających wszystkie dane dla każdej z nich.
2. Tworzenie plików filename_prelim.swc za pomocą funkcji 'bonfire_ndf2swc'
   1. Wpisz 'bonfire_ndf2swc' w oknie poleceń i naciśnij enter.
   2. W oknie 'Browse For Folder' wybierz ten sam folder z warunkiem, który został przed chwilą zreorganizowany za pomocą 'bonfire_load', a następnie wybierz 'OK'.
   3. W folderze każdej komórki dla wybranego warunku zostanie utworzony plik .swc. Każdy folder komórki będzie teraz zawierał 5 plików: oryginalny obraz .tif, plik .ndf, plik identyfikatora śladu _info, plik .txt oraz plik .swc.

5. Użyj programu NeuronStudio do finalizacji plików .swc:

1. Otwieranie i kalibracja obrazów neuronów w programie NeuronStudio
   1. Uruchom program NeuronStudio.
   2. W pasku narzędzi programu NeuronStudio wybierz File→Open.
   3. Znajdź obraz neuronu w formacie .tif, który chcesz edytować, i otwórz go.
   4. Wybierz Run→Settings i wprowadź wartość „1” w każdym z 3 pól (X,Y,Z) w oknie „Voxel Size”.
   5. Wybierz File→Import SWC. Wybierz odpowiedni plik .swc. Na obrazie pojawi się nałożony szkic (trace). Ciało komórki (soma) powinno być oznaczone czerwonym kółkiem.
2. Łączenie neurytów za pomocą programu NeuronStudio
   1. Użyj narzędzi w programie NeuronStudio, aby prawidłowo zidentyfikować punkty rozgałęzień i punkty końcowe (zaleca się zapoznanie z funkcjami i skrótami klawiszowymi programu NeuronStudio przed rozpoczęciem analizy danych).
   2. W szczególności użyj „narzędzia neurytów” (neurite tool) do łączenia węzłów w taki sposób, aby:
      • każdy punkt rozgałęzienia (żółte węzły) tworzył tylko dwie gałęzie,
      • wszystkie szkice były ciągłe i połączone z somą (tylko jeden czerwony węzeł).
3. Eksport danych z programu NeuronStudio
   1. Wybierz File→Save Neurites (zapisz pod domyślną nazwą).
4. Sprawdzanie błędów w plikach .swc za pomocą funkcji „bonfire_trace_check”
   1. Wpisz „bonfire_trace_check” w oknie poleceń programu Matlab i naciśnij enter.
   2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które właśnie przetworzyłeś, a następnie wybierz „OK”.
   3. Jeśli w którymkolwiek z obrazów w folderze wystąpią błędy, program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu.
   4. Poprawianie błędów w programie NeuronStudio
      1. Otwórz plik obrazu zapisany na etapie eksportu.
      2. Zlokalizuj i napraw problem(y).
      3. Kliknij File→Save Neurites.
      4. Powtórz czynność dla pozostałych obrazów wymagających poprawy.
      5. Ponownie uruchom procedurę „bonfire_trace_check” (5.4).

6. Użycie programu „bonfire” do ekstrakcji danych morfologicznych z plików .swc:

1. Wpisz polecenie 'bonfire' w oknie komend i naciśnij enter.
2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem zawierający dane do analizy i zatwierdź przyciskiem „OK”.
3. Analiza Bonfire wygeneruje okno dla każdego analizowanego neuronu, przedstawiając na wykresie morfologię neuronalną wraz z pierścieniami Sholla wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie 'bonfire' utworzy plik .mat zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy.

7. Użyj 'bonfire_results', aby wyświetlić dane:

1. Wpisz 'bonfire_results' w oknie poleceń programu Matlab.
2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkami, które chcesz wyświetlić, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”.
3. Okno „Browse for Folder” tymczasowo się zamknie i ponownie otworzy, umożliwiając wybranie dodatkowych warunków do wyświetlenia.
4. Po zakończeniu wybierania folderów z warunkami wybierz „Cancel”, aby wyjść z procesu selekcji.
5. Funkcja 'Bonfire_results' wygeneruje wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami.

8. Użyj funkcji 'bonfire_export', aby wyeksportować dane do programu Excel:

1. Wpisz 'bonfire_export' w oknie poleceń.
2. W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz wyeksportować, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”. Program Bonfire_export utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i umieści je w wybranym folderze z warunkami.

9. Reprezentatywne wyniki:

Przykład danych wygenerowanych przez program Bonfire dla zestawu danych zawierającego dwa warianty przedstawiono na Rysunku 3. W tym przykładzie neurony z wariantu 1 posiadają więcej neurytów w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Zjawisko to można zaobserwować na obrazach przykładowych (Rysunek 3B), a także na krzywej Sholla dla całkowitego drzewa dendrytycznego (Rysunek 3A) oraz na wykresie liczby punktów końcowych (Rysunek 3C). Ponadto, ponieważ program Bonfire przeprowadza również analizę Sholla w podregionach obrazów, jesteśmy w stanie dokładniej zidentyfikować typy neurytów, których liczba wzrosła. Zarówno całkowita liczba przecięć neurytów 3^rd rzędu lub wyższych (Rysunek 3F), jak i całkowita liczba neurytów pośrednich oraz końcowych (Rysunek 3G) są zwiększone w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Tendencje te można zaobserwować również na Rysunkach 3D i 3E.

Rysunek 1: Schemat blokowy programu Bonfire. Neurony są śledzone przy użyciu ImageJ. Następnie dane są eksportowane i konwertowane przez program Bonfire do wstępnych plików .swc. Do zdefiniowania łączności neurytów wykorzystywany jest program NeuronStudio. Bonfire sprawdza występowanie błędów, a następnie oblicza krzywe Sholla, liczbę neurytów pierwszego, drugiego i wyższych rzędów oraz liczbę punktów rozgałęzień i końcówek neurytów. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.

Rysunek 2: Struktura plików wymagana do analizy w programie Bonfire. Struktura plików musi być zgodna z przedstawionym schematem, w przeciwnym razie program nie będzie działać poprawnie. Nazwy folderów i plików oraz ich liczba mogą ulec zmianie.

Rycina 3: Przykład danych wyjściowych z programu Bonfire. A) Całkowite krzywe Sholla. B) Przykład odwróconych obrazów dla obu warunków. C) Średnia liczba punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę. D) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów pierwotnych, wtórnych oraz trzeciorzędowych lub wyższych. E) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów korzeniowych, pośrednich i końcowych. F) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty zostały pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędowe lub wyższe. G) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty zostały pogrupowane jako segmenty korzeniowe, pośrednie lub końcowe.

Dyskusja

Program Bonfire jest programem półautomatycznym służącym do analizy morfologii dendrytów i aksonów. Znacznie zwiększa on wydajność i dokładność analizy Sholla w porównaniu do przeprowadzania tej analizy ręcznie. Ponadto program Bonfire zapisuje dane na każdym etapie procesu, co umożliwia audyt danych oraz weryfikację dokładności analizy. Dzięki temu zadanie analizy danych można rozdzielić pomiędzy wiele osób bez utraty precyzji. Wreszcie, poprzez przeprowadzanie analizy w podregionach obrazów, program jest w stanie ziden...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wtyczka NeuronJ			http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
Oprogramowanie ImageJ			http://rsbweb.nih.gov/ij/
Program Bonfire			http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudio			http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
Program MatLab	Mathworks