Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plasmodium, pasożyty wywołujące malarię, są przenoszone poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju Anopheles, co skutkuje ponad 250 milionami nowych zakażeń każdego roku. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż nie istnieje szczepionka przeciw malarii, co podkreśla potrzebę opracowania nowych strategii kontroli. Jednym z innowacyjnych podejść jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych komarów do skutecznego ograniczenia transmisji pasożytów malarii. Wykazano, że celowe zmiany w szlakach sygnalizacji komórkowej komara, dokonane za pomocą celowanej mutagenezy, regulują rozwój pasożyta 1. Na podstawie tych badań możemy zacząć identyfikować potencjalne geny będące celami transformacji. Celowana mutageneza opierała się tradycyjnie na rekombinacji homologicznej między genem docelowym a dużą cząsteczką DNA. Jednak konstrukcja i wykorzystanie tak złożonych cząsteczek DNA do generowania stabilnie przekształconych linii komórkowych jest kosztowne, czasochłonne i często nieefektywne. Dlatego strategia wykorzystująca oligonukleotydy modyfikowane zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA-ONs) stanowi użyteczną alternatywę dla wprowadzania sztucznych substytucji pojedynczych nukleotydów do epigenowych i chromosomalnych celów genowych (przegląd w 2). Celowana mutageneza za pośrednictwem LNA-ONs była stosowana do wprowadzania mutacji punktowych w interesujących genach w hodowlach komórkowych drożdży oraz myszy 3,4. Pokazujemy tutaj, że LNA-ONs mogą być użyte do wprowadzenia zmiany pojedynczego nukleotydu w transfektowanym celu episomalnym, co skutkuje przełączeniem ekspresji z niebieskiego białka fluorescencyjnego (BFP) na zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach Anopheles gambiae oraz Anopheles stephensi. Konwersja ta dowodzi po raz pierwszy, że efektywna mutageneza genów docelowych w komórkach komarów może być zapośredniczona przez LNA-ONs i sugeruje, że technika ta może znaleźć zastosowanie w mutagenezie celów chromosomalnych in vitro oraz in vivo.
Protokół
- Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest upewnienie się, że komórki komara wykorzystywane w eksperymencie są zdrowe i osiągnęły stopień konfluencji około 80%, jeśli są to komórki adherentne (Rycina 1). Przerośnięte lub niezdrowe komórki spowodują niską wydajność transfekcji i doprowadzą do niespójnych wyników.
- Podgrzej wszystkie pożywki przed użyciem w 28°C kąpiel wodna przez 30 minut.
- *A. stephensi* Komórki MSQ43 wymagają pożywki E5: MEM, Earle's z glutaminą, 5% inaktywowanego ciepłem FCS, 0,2% D-glukozy, 1% antybiotyku penicylina-streptomycyna oraz 1% nieistotnych aminokwasów.
- A. gambiae Komórki SUA5B wymagają pożywki S2: Schneidera Muszka owocówka pożywka, 5% inaktywowana ciepłem surowica cielęca (FCS) i 1% antybiotyk penicylina-streptomycyna
- Odmrozić i przechowywać na lodzie wszystkie odczynniki do transfekcji, plazmidy oraz oligonukleotydy.
- Wszystkie procedury należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę sterylną.
- Dla komórek adherentnych (*A. gambiae* SUA5B, A. stephensi MSQ43) odessać starą pożywkę, nie naruszając komórek, i dodać równoważną objętość świeżej pożywki podgrzanej do 28°Cnastępnie należy wypłukać komórki z dna kolby za pomocą pipety.
- Należy oznaczyć stężenie komórek i dostosować je do stężenia końcowego 1x106 komórek/ml. Komórki można przechowywać w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania materiałów do odczynnika do transfekcji.
- Dodaj 1 ml komórek komara (1x106 (komórek/ml) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przygotuj oddzielną płytkę dla każdego warunku eksperymentalnego (patrz poniżej).
Tabela I przedstawia schemat pipietowania dla ogólnej transfekcji. Tabela II opisuje pięć warunków testowych w celu sprawdzenia skuteczności mutogenezy pojedynczego nukleotydu z wykorzystaniem LNA-ON specyficznych dla BFP. Dwie pierwsze próbki, pGFP i pBFP, stanowią odpowiednio kontrolę pozytywną i negatywną. Pozostałe to warunki eksperymentalne pBFP z rosnącym stężeniem LNA-ON specyficznych dla BFP. W krokach od 8 do 12 należy dodać odpowiednie objętości odczynników zgodnie z każdym warunkiem. - Przenieś plazmidowe DNA do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dodaj odpowiednią objętość buforu EC.
- Dla 1 μL plazmidowe DNA (1 μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.
- Dla 1 μL pGFP (1μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.
- Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.
- Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) i 1 μL WŁ.μg/ μL), dodaj 98 μL buforu EC.
- Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) oraz 5 μL WŁ. (1μg/ μL), dodać 94 μL buforu EC.
- Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) i 10 μL WŁ. (1μg/ μL), dodać 89 μL buforu EC.
- Następnie powoli dodawaj Enhancer na 1 μg wykorzystanego DNA.
- Dla 1 μL plazmidowe DNA, dodać 8 μL Enhancer.
- Dla 1 μL pGFP, dodać 8 μL Enhancer
- Dla 1 μL pBFP, dodać 8 μL Wzmacniacz.
- Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁĄCZ, dodaj 16 μL Enhancer.
- Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁĄCZ, dodaj 48 μL Wzmacniacz.
- Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁĄCZ, dodaj 88 μL Enhancer.
- Wymieszaj DNA, bufor i Enhancer na wirówce typu vortex przez 1 s, upewniając się, że cała zawiesina znajduje się na dnie probówki. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Dodać odczynnik Effectene zgodnie z 1 μg DNA plazmidowego i mieszaj w wirówce Vortex przez 10 s. Upewnij się, że cały roztwór znajduje się na dnie probówki, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Dla 1 μL plazmidowe DNA, dodać 10 μL Effectene (Tabela I).
- Dla 1 μL pGFP, dodać 10 μL Effectene (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP, dodać 10 μL Effectene (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁ. dodaj 20 μL Effectene (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁ., dodać 60 μL Effectene (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁ., dodać 110 μL Effectene (Tabela II).
- Dopełnić objętość w każdej probówce do końcowej wartości 1000 μL poprzez kroplowe dodawanie ogrzanej pożywki do mieszaniny DNA/buforu/Enhancera/Effectene. Na tym etapie może dojść do wytrącenia DNA, jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko. Należy delikatnie wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół 3–4 razy.
- Dla 1 μL plazmidowy DNA, dodać 882 μL pożywki (Tabela I).
- Dla 1 μL dodaj pGFP 882 μL pożywki (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP, dodać 882 μL pożywki (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁĄCZ, dodaj 864 μL pożywki (Tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁĄCZ, dodaj 792 μL pożywki (tabela II).
- Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁ., dodaj 702 μL podłoża (Tabela II).
- Następnie powoli dodawaj do każdej studzienki po 1 ml odpowiedniej mieszaniny DNA/Enhancer/Effectene, dozując ją kropla po kropli.
- Delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek i mieszaniny do transfekcji. Inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli.
- Jeden dzień po transfekcji należy delikatnie odessać medium i powoli zastąpić je równą objętością świeżo podgrzanego medium. Ważne jest, aby podczas tej czynności nie naruszyć warstw komórek znajdujących się na dnie studzienek.
- Dwa dni po transfekcji należy zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki kontroli pozytywnej transfekowane pGFP w celu określenia wydajności transfekcji (Rycina 2).
- Komórki SUA5B rosną bardzo szybko i mogą ulec przerośnięciu. Cztery dni po transfekcji należy rozrzedzić te komórki, odsysając stare medium i powoli dodając równą objętość świeżego, ogrzanego medium.
- Po dodaniu nowej pożywki do studniek, ododziel wszystkie komórki od dna każdej studnienki poprzez pipetowanie w górę i w dół, odlej połowę objętości (1 ml) zawiesiny komórkowej i dodaj 1 ml świeżej, ogrzanej pożywki, aby uzyskać objętość końcową 2 ml.
- Codziennie sprawdzać stan komórek, aby upewnić się, że są zdrowe i nie uległy nadmiernemu rozrostowi; w razie potrzeby przeprowadzić pasażowanie.
- Pozostawić komórki do wzrostu w normalnych warunkach przez pięć do siedmiu dni po transfekcji przed ich zebraniem do analizy.
- Pięć do siedmiu dni po transfekcji zebrać komórki, odsysając stare medium ze wszystkich studzienek i dodając do każdej z nich 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.
- Odseparować komórki od dna dołka poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek z zakrętką typu snap cap o pojemności 5 ml i niezwłocznie poddać komórki analizie metodą cytometrii przepływowej.
Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Nietransfekcyjne zdrowe komórki A. stephensi MSQ43 (A) i A. gambiae SUA5B (B) przy konfluencji około 80%.
Rysunek 2. Komórki A. stephensi MSQ43 (A) oraz A. gambiae SUA5B (B) przetransfekowane plazmidem kontrolnym wyrażającym GFP.
Rysunek 3. Dane cytometrii przepływowej potwierdzające konwersję BFP na GFP poprzez mutogenezę pojedynczego nukleotydu po transfekcji specyficznymi dla BFP oligonukleotydami z modyfikacją blokowanego kwasu nukleinowego (LNA-ONs). Komórki SUA5B transfektowano plazmidem wykazującym ekspresję GFP (pGFP) jako kontrolę pozytywną, plazmidem wykazującym ekspresję BFP (pBFP) jako kontrolę negatywną lub pBFP wraz z rosnącymi stężeniami specyficznych dla BFP LNA-ONs. (A) Strategia bramkowania danych cytometrii przepływowej przedstawiająca od lewej do prawej: rozproszenie przednie (FSC) względem bocznego (SSC) żywych komórek, komórki negatywne pod kątem jodku propidyny (PI) oraz komórki pozytywne dla GFP pięć dni po transfekcji. (B) Wykres procentowej zawartości komórek pozytywnych dla GFP przedstawionych na (A) po transfekcji pBFP i rosnącymi stężeniami LNA-ONs.
Tabela I. Warunki transfekcji.
Tabela II. Warunki transfekcji zastosowane na Rysunku 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj metodę in vitro oraz dowody na ukierunkowaną konwersję pojedynczego nukleotydu w docelowym genie episomalnym po transfekcji LNA-ON do komórek A. stephensi i A. gambiae. Konwersja genu zapśredniczona przez LNA-ON wymaga indukcji specyficznej dla danego miejsca odpowiedzi naprawy DNA; nasze dane wskazują, że komórki komarów mogą wspierać ten mechanizm w celu mutagenezy specyficznej dla danego miejsca. Chociaż przedstawiona tutaj metoda opiera się na konwersji celu episomalnego...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Abbie Spinner z California National Primate Research Center za pomoc w przeprowadzeniu cytometrii przepływowej. Badanie to zostało sfinansowane z funduszy National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 oraz AI078183.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczyn do transfekcji Effectene | Qiagen | 301425 | |
| plazmid kontrolny GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| plazmid BFP (pcDNA5/FRT/TO) | Prezent od dr. Concordeta3 | ||
| LNA-ONs | Prezent od dr Concordeta3 | ||
| MEM, Earle’z glutaminą | Invitrogen | 11095 | |
| płódcowa surowica cielęca (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’S Muszka owocówka pożywka | Invitrogen | 11730 | |
| Aminokwasy nieesencjalne | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glukozy | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Antybiotyk penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15140 | |
| płytki hodowlane 6-dołkowe | Corning | 3516 |
Bibliografia
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
