Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plasmodium, pasożyty wywołujące malarię, są przenoszone poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju Anopheles, co skutkuje ponad 250 milionami nowych zakażeń każdego roku. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż nie istnieje szczepionka przeciw malarii, co podkreśla potrzebę opracowania nowych strategii kontroli. Jednym z innowacyjnych podejść jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych komarów do skutecznego ograniczenia transmisji pasożytów malarii. Wykazano, że celowe zmiany w szlakach sygnalizacji komórkowej komara, dokonane za pomocą celowanej mutagenezy, regulują rozwój pasożyta 1. Na podstawie tych badań możemy zacząć identyfikować potencjalne geny będące celami transformacji. Celowana mutageneza opierała się tradycyjnie na rekombinacji homologicznej między genem docelowym a dużą cząsteczką DNA. Jednak konstrukcja i wykorzystanie tak złożonych cząsteczek DNA do generowania stabilnie przekształconych linii komórkowych jest kosztowne, czasochłonne i często nieefektywne. Dlatego strategia wykorzystująca oligonukleotydy modyfikowane zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA-ONs) stanowi użyteczną alternatywę dla wprowadzania sztucznych substytucji pojedynczych nukleotydów do epigenowych i chromosomalnych celów genowych (przegląd w 2). Celowana mutageneza za pośrednictwem LNA-ONs była stosowana do wprowadzania mutacji punktowych w interesujących genach w hodowlach komórkowych drożdży oraz myszy 3,4. Pokazujemy tutaj, że LNA-ONs mogą być użyte do wprowadzenia zmiany pojedynczego nukleotydu w transfektowanym celu episomalnym, co skutkuje przełączeniem ekspresji z niebieskiego białka fluorescencyjnego (BFP) na zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach Anopheles gambiae oraz Anopheles stephensi. Konwersja ta dowodzi po raz pierwszy, że efektywna mutageneza genów docelowych w komórkach komarów może być zapośredniczona przez LNA-ONs i sugeruje, że technika ta może znaleźć zastosowanie w mutagenezie celów chromosomalnych in vitro oraz in vivo.
Protokół
- Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest upewnienie się, że komórki komara wykorzystywane w eksperymencie są zdrowe i osiągnęły stopień konfluencji około 80%, jeśli są to komórki adherentne (Rycina 1). Przerośnięte lub niezdrowe komórki spowodują niską wydajność transfekcji i doprowadzą do niespójnych wyników.
- Podgrzej wszystkie pożywki przed użyciem w 28°C kąpiel wodna przez 30 minut.
- *A. stephensi* Komórki MSQ43 wymagają pożywki E5: MEM, Earle's z glutaminą, 5% inaktywowanego ciepłem FCS, 0,2% D-glukozy, 1% antybiotyku penicylina-streptomycyna oraz 1% nieistotnych aminokwasów.
- A. gambiae Komórki SUA5B wymagają pożyw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj metodę in vitro oraz dowody na ukierunkowaną konwersję pojedynczego nukleotydu w docelowym genie episomalnym po transfekcji LNA-ON do komórek A. stephensi i A. gambiae. Konwersja genu zapśredniczona przez LNA-ON wymaga indukcji specyficznej dla danego miejsca odpowiedzi naprawy DNA; nasze dane wskazują, że komórki komarów mogą wspierać ten mechanizm w celu mutagenezy specyficznej dla danego miejsca. Chociaż przedstawiona tutaj metoda opiera się na konwersji celu episomalnego.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Abbie Spinner z California National Primate Research Center za pomoc w przeprowadzeniu cytometrii przepływowej. Badanie to zostało sfinansowane z funduszy National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 oraz AI078183.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczyn do transfekcji Effectene | Qiagen | 301425 | |
| plazmid kontrolny GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| plazmid BFP (pcDNA5/FRT/TO) | Prezent od dr. Concordeta3 | ||
| LNA-ONs | Prezent od dr Concordeta3 | ||
| MEM, Earle’z glutaminą | Invitrogen | 11095 | |
| płódcowa surowica cielęca (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’S Muszka owocówka pożywka | Invitrogen | 11730 | |
| Aminokwasy nieesencjalne | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glukozy | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Antybiotyk penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15140 | |
| płytki hodowlane 6-dołkowe | Corning | 3516 |
Bibliografia
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
