Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Podsumowanie

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Streszczenie

Podczas pandemii wirusa grypy z 1918 roku, w wyniku której zmarło około 50 milionów ludzi na całym świecie, większość zgonów nie była wynikiem samej infekcji wirusem grypy. Uważa się, że większość osób zmarła w wyniku wtórnej infekcji bakteryjnej, wywołanej głównie przez bakterię Streptococcus pneumoniae (pneumokoki). Synergistyczna relacja między infekcjami wywołanymi przez wirusa grypy a pneumokoki była następnie obserwowana podczas pandemii azjatyckiego wirusa grypy w 1957 roku, a także podczas sezonowych wybuchów tego wirusa (przegląd w ^{1, 2}). W niniejszej pracy opisujemy protokół wykorzystywany do badania mechanizmu (lub mechanizmów), które mogą mieć udział w zwiększonej zapadalności w wyniku jednoczesnej infekcji wirusem grypy A oraz S. pneumoniae. Opracowaliśmy model mysi dla noworodków, aby w sposób wiarygodny i powtarzalny wykazać skutki infekcji wirusem grypy u myszy skolonizowanych przez S. pneumoniae. Stosując ten protokół, przedstawiliśmy pierwsze spostrzeżenia na temat kinetyki transmisji pneumokoków między współmiejskimi noworodkowymi myszami z wykorzystaniem obrazowania in vivo ³.

Protokół

1. Przygotowanie zakaźnego zapasu bioluminescencyjnych S. pneumoniae

1. Zaszczep probówkę McCarteya zawierającą 10 ml bulionu Todd-Hewitt z dodatkiem 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego i niewielkim kawałkiem agaru z krwią bioluminescencyjnym szczepem S. pneumoniae i inkubuj statycznie w temperaturze 37°C do uzyskania gęstości optycznej (600 nm) na poziomie 0,40-0,45.
2. Umieść kulturę na wilgotnym lodzie na 5 min, aby zatrzymać komórki w tej fazie wzrostu.
3. Do 10 ml kultury S. pneumoniae w środkowej fazie logarytmicznej wzrostu dodaj 1 ml 80% (v/v) glicerolu, wymieszaj, rozdziel na pożądane objętości i przechowuj w temperaturze -70°C.
4. Wyznacz dawkę zakaźną zapasu bioluminescencyjnego S. pneumoniae poprzez liczenie żywych komórek z rozcieńczeń seryjnych na płytkach z agarem z krwią.

2. Wzrost i przygotowanie zapasu wirusa grypy typu A

1. Wirus grypy typu A jest hodowany w płynie alantoicznym 10-dniowych zarodkowych jaj kurzych.
2. Rozmrozić fiolkę z wirusem grypy typu A w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
3. Używając źródła światła umieszczonego nad workiem powietrznym (prześwietlanie jaj), zaznaczyć na skorupce jaja położenie worka powietrznego w miejscu wolnym od przebiegających pod spodem naczyń krwionośnych.
4. Zdezynfekować powierzchnię jaj, przecierając je 70% etanolem, a następnie wytrzeć do czysta.
5. Za pomocą rysika jubilerskiego przebić mały otwór w worku powietrznym tuż nad zaznaczeniem.
6. Umieśćcając jaja w wytłaczance tak, aby worek powietrzny znajdował się u góry, użyć strzykawki 1mL 13mm i igły 26G, aby zaszczepić każde jajo przez otwór w skorupce 0,1mL odpowiednio rozcieńczonego wirusa grypy typu A. Igłę skierować bezpośrednio w dół do jamy alantoicznej, przebijając worek powietrzny.
7. Uszczelnić otwór roztopionym woskiem i inkubować jaja przez 2 dni w nawilżonym inkubatorze do jaj w temperaturze 35°C. Po 2 dniach inkubacji prześwietlić jaja, aby sprawdzić obecność naczyń krwionośnych i potwierdzić, że zarodek wciąż żyje. Jeśli wnętrze jaja jest czarne, zarodek obumarł i jajo należy odrzucić — nie wolno go używać do pobierania wirusa grypy typu A.
8. Przechowywać jaja w temperaturze 4°C przez noc, aby zabić zarodki i doprowadzić do skurczenia naczyń krwionośnych w celu zminimalizowania ich uszkodzenia, ponieważ kontakt krwi z wirusem spowodowałby wiązanie wirusa z erytrocytami.
9. Następnego dnia zdezynfekować powierzchnię jaj, przecierając je 70% etanolem.
10. Pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby pobrać z jaj płyn alantoiczny zawierający wirusa grypy typu A. Usunąć wosk i za pomocą zakrzywionych nożyczek wyciąć górną część jaja, aby usunąć worek powietrzny nad błoną alantoiczną.
11. Przebić i odsunąć błonę alantoiczną za pomocą sterylnej pęsety.
12. Odssać płyn alantoiczny sterylną pipetą 10mL, odsuwając zarodek na bok za pomocą drugiej sterylnej pipety. Zgromadzić połączony płyn alantoiczny w probówkach 50mL i przez cały czas przechowywać na lodzie. Jeśli płyn alantoiczny jest zakrwawiony lub zawiera żółtko, nie dodawać go do wspólnej puli.
13. Wirować płyn alantoiczny przez 5min przy 2 000rpm w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zanieczyszczeń.
14. Rozdzielić zakaźny płyn alantoiczny do kriotubek 1-2 ml i przechowywać w temperaturze -70°C.
15. Wyznaczyć miano wirusa grypy typu A w rozmrożonym płynie alantoicznym w 3 niezależnie przeprowadzonych testach tworzenia plamek w komórkach nerki psa Madin-Darby (patrz poniżej). Do każdego eksperymentu użyć nowej alikwoty wirusa. Powtarzane zamrażanie i rozmrażanie obniży miano zakaźności.

3. Zakażenie donosowe myszy bioluminescencyjnym S. pneumoniae i/lub wirusem grypy A

1. Rozmrozić zamrożony zapas bioluminescencyjnych S. pneumoniae i rozcieńczyć do pożądanej dawki w PBS.
2. Delikatnie chwycić 5-dniowe myszy między palec wskazujący a kciuk i trzymać je w pozycji pionowej. Za pomocą pipety nanieść bioluminescencyjne S. pneumoniae do nozdrzy w objętości 3μl. Odczekać, aż cały inokulum zostanie wchłonięty, przed umieszczeniem myszy z powrotem w klatce. W przypadku infekcji pozorowanej (mock) użyć 3μl PBS.
3. Od trzech do dziewięciu dni po kolonizacji bioluminescencyjnymi S. pneumoniae, rozmrozić alikwot płynu alantoicznego zawierającego wirusa grypy A i rozcieńczyć w PBS do pożądanej koncentracji. Zainfekować myszy wirusem grypy A w objętości 3μl PBS zgodnie z opisem w kroku 3.2. W przypadku infekcji pozorowanej wirusem użyć 3μl rozcieńczonego płynu alantoicznego z niezinfekowanych jaj.
4. Codziennie monitorować stan zdrowia i dobrostan myszy, obserwując ich wygląd, zachowanie, kondycję organizmu, a w przypadku myszy w wieku ≤ 3 dni – obecność plam mlecznych. Wytyczne dotyczące humanitarnych punktów końcowych oraz kryteriów interwencji powinny zostać opracowane w konsultacji z lekarzem weterynarii ds. zwierząt laboratoryjnych (Tabela 3).

4. Obrazowanie bioluminescencyjne przy użyciu systemu IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences)

1. Przygotować mieszaninę ketaminy w stężeniu 0,75 mg/ml i ksylazyny w stężeniu 1,76 mg/ml w wodzie do iniekcji.
2. Aby znieczulić myszy, wstrzyknąć 100 μl / 10 g masy ciała do jamy otrzewnowej.
3. Umieścić znieczulone myszy w pudełku do obrazowania. Podczas umieszczania myszy w pudełku/komorze obrazującej należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby badany region anatomiczny znajdował się równolegle do kamery.
4. Umieścić pudełko z myszami w systemie IVIS i doprowadzić izofluran do wnętrza pudełka z przepływem 0,5 L/min w celu podtrzymania znieczulenia.
5. Ustawić urządzenie IVIS na odpowiednią platformę obrazowania i binning, a następnie rejestrować obraz przez 7 minut.
6. Pozwolić myszom dojść do siebie po znieczuleniu w ogrzewanym pudełku (np. przy użyciu podkładki grzewczej) przed powrotem do klatki domowej.
7. Obrazy są analizowane i dostrajane do tej samej skali przy użyciu pakietu oprogramowania Living Image wersja 3.0 (Caliper Life Sciences).
8. Sygnały bioluminescencyjne w wybranym obszarze zainteresowania (ROI) mogą być kwantyfikowane jako całkowity strumień (photon/s) lub średnia radiancja (photons/s/cm²/sr).

5. Przetwarzanie tkanek w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego i miana wirusa

1. Myszy uśmierca się przez uduszenie CO₂, a futro dezynfekuje 70% etanolem.
2. Unieruchom zwierzę na twardej desce do sekcji.
3. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela wykonaj cięcie przez środek głowy zwierzęcia, zaczynając od strony tylnej, a następnie odsłoń nosogardziel, odginając obie strony głowy na zewnątrz.
4. Zbierz tkankę nosogardzielną każdego zwierzęcia, zeskrobując ją z każdej połowy głowy za pomocą sterylnych pęset, i umieść w 1,5 mL schłodzonego do temperatury lodowej medium RPMI. Przechowuj w lodzie.
5. Otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek i usuń płuca, używając sterylnych pęset i nożyczek. Przepłucz płuca trzy razy w PBS, aby usunąć krew, a następnie zbierz je do 1,5 mL schłodzonego do temperatury lodowej medium RPMI. Przechowuj w lodzie.
6. Użyj homogenizatora do homogenizacji tkanek, a następnie ponownie umieść je w lodzie.
7. Pobierz alikwot homogenizatu tkankowego w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego. Przygotuj rozcieńczenia seryjne homogenizatu tkankowego i wysiej na podłoże HBA. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez 18-24 h i określ liczbę żywych bakterii. Miana bakterii w konkretnym narządzie można następnie skorelować z liczbą fotonów zaobserwowaną w tym regionie.
8. Odwirowkuj pozostałą część homogenizatu tkankowego przy 3 500 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C. Zbierz supernatant i przenieś go do czystych, sterylnych probówek. Przechowuj supernatant w temperaturze -70°C i określ miano wirusa za pomocą testu plackowego.

6. Metoda plackowa do oznaczania miana wirusa grypy A w homogenatach tkanek

1. Miana zakaźności wirusa określa się poprzez tworzenie blaszek na konfluentnych monowarstwach komórek nerki psa Madin-Darby (MDCK). Komórki MDCK hoduje się rutynowo w pożywce RF10 (Tabela 1) w butelkach do hodowli tkankowej (Nunc) i pasażuje po osiągnięciu konfluencji.
2. Odczepić komórki MDCK z butelek do hodowli tkankowej przy użyciu trypsyny. Przemyć komórki w RF10 i zebrać je poprzez wirowanie przy 1200 rpm przez 5 min. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w RF10. Policzyć komórki MDCK przy użyciu hemocytometru i barwnika żywotności. Wysiać do każdego dołka 35 mm płytek 6-dołkowych (Nunc) 1,2x10⁶ komórek MDCK w 3 ml RF10 i hodować komórki w 37°C i 5% CO₂ do osiągnięcia konfluencji (w ok. 24 godzinach).
3. Przygotować pożywkę Leibovitz dsL15 oraz pożywkę do nakładki z 1,8% (w/v) agarozy (Tabela 1). Rozdzielić pożywkę dsL15 i 1,8% (w/v) agarozę w ilościach 50 ml do sterylnych butelek. Przechowywać pożywkę dsL15 w 4°C do momentu użycia, a agarozę w 56°C do momentu użycia.
4. Sprawdzić, czy monowarstwy komórek MDCK są konfluentne, a następnie przemyć komórki pożywką RPMI+, odsysając RF10 i zastępując go ok. 1,5 ml RPMI+. Na żadnym etapie procedury nie wolno dopuścić do całkowitego wyschnięcia płytek. Inkubować płytki w 37°C do momentu dodania próbek zawierających wirusa.
5. Przygotować rozcieńczenia seryjne próbek wirusa w RPMI+. Przechowywać próbki w lodzie do momentu użycia.
6. Odsysać RPMI+ z monowarstw i dodać 135 µL RPMI+ z odpowiednimi rozcieńczeniami próbki wirusa do każdego dołka. Każdą próbkę testować w dublecie.
7. Inkubować komórki MDCK z próbkami wirusa przez 45 min w 37°C i 5% CO₂. Delikatnie wstrząsać płytkami co 15 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirusa i zapobiec wysychaniu monowarstw komórek MDCK.
8. Przenieść agarozę z kąpieli wodnej 56°C do kąpieli 46°C i ogrzać pożywkę dsL15 do 46°C w kąpieli wodnej.
9. Po 45-minutowej inkubacji wirusa na monowarstwach MDCK wyjąć płytki z inkubatora z 5% CO₂. Wyjąć agarozę i pożywkę L15 z kąpieli wodnej 46°C. Dodać 0,2 ml 0,1% trypsyny do 50 ml pożywki dsL15, a następnie dodać 50 ml dsL15+trypsyna do 50 ml 1,8% (w/v) agarozy. Delikatnie wymieszać agarozę z L15 i dodać 3 ml pożywki do nakładki do każdego dołka płytek 6-dołkowych. Delikatnie zakręcić, aby upewnić się, że cała monowarstwa komórek MDCK jest pokryta. Po zastygnięciu nakładki inkubować płytki w 37°C i 5% CO₂ przez 2-4 dni.
10. Po zakończeniu okresu inkubacji policzyć liczbę blaszek jako miarę zakaźności wirusa. W razie potrzeby blaszki można zwizualizować poprzez barwienie monowarstw fioletem krystalicznym rozpuszczonym w metanolu.

7. Sekcja C - Klucze do sukcesu:

1 Wszystkie prace eksperymentalne z S. pneumoniae (np. szczepienie kultur w płynnych podłożach, przetwarzanie tkanek myszy zakażonych S. pneumoniae) są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.

1.1 Tworzymy bioluminescencyjne szczepy S. pneumoniae poprzez wprowadzenie plazmidu pPJTG28 ³. Dostępna jest jednak szeroka gama różnych bioluminescencyjnych szczepów S. pneumoniae 4-6. Bioluminescencyjne szczepy S. pneumoniae można również zakupić w Caliper Life Sciences Inc (MA, USA).

1.1 Kinetyka wzrostu różnych szczepów S. pneumoniae może się różnić i powinna zostać określona dla każdego szczepu. Osiągnięcie OD600nm=0,4 do 0,45 może zająć od 3 do 4 godzin.

1.4 Normalnie oczekiwalibyśmy, że zapasy zakaźne osiągną stężenie 10e8 CFU/ml, i zalecamy zakres rozcieńczeń od 10e-4 do 10e-8 w celu określenia stężenia żywych bakterii.

2.6 Odpowiedni miano do inokulacji jaj zależy od użytego szczepu wirusa i może mieścić się w zakresie od 10e-3 do 10e-5. Szczepy wirusa grypy A otrzymane z nadsączów kultur tkankowych mogą być czasami stosowane w formie nieleju (bez rozcieńczenia).

3.2a Do kolonizacji 5-dniowych myszy rutynowo stosujemy 2 000 CFU szczepu S. pneumoniae EF3030 ³. Dokładna dawka zakaźna inokulum jest określana retrospektywnie dla każdego eksperymentu poprzez wysiew rozcieńczeń seryjnych inokulum na płytki z agarem z krwią konia. Zdolność szczepu S. pneumoniae do kolonizacji myszy jest najpierw określana poprzez oznaczanie liczby żywych komórek w homogenatach tkanek (np. nosogardzieli, płuc) w kilku punktach czasowych po inokulacji myszy.

3.2b Podawanie bakterii lub wirusa zwierzętom drogą wziewną nie wymaga stosowania środków znieczulających. Myszy młodociane (podobnie jak dorosłe) powinny być unieruchomione ręcznie i trzymane w pozycji pionowej przez badacza, następnie na nozdrza nanosi się inokulum (3 µL w przypadku myszy młodocianych, do 10 µL w przypadku myszy dorosłych), a następnie poprzez obserwację potwierdza się wchłonięcie całej dawki.

3.2c Wyjmij noworodki myszy pojedynczo z gniazda i inokuluj bakteriami lub wirusem zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby zaznacz ogon zwierzęcia permanentnym markerem i niezwłocznie umieść zwierzę z powrotem w klatce. Potrzyj zwierzę materiałem z ściółki, aby matka przyjęła młode z powrotem do gniazda. Uwaga: oznaczenia permanentnym markerem szybko ścierają się ze zwierząt i muszą być odnawiane codziennie. Alternatywnie, do identyfikacji poszczególnych zwierząt można zastosować system tatuażu.

3.3 Do zakażania myszy w wieku od 8 do 14 dni stosujemy 20 PFU wirusa grypy A Udorn/307/72 (H3N2) 3. Śmiertelność i zachorowalność obserwowana u zwierząt będą zależeć od użytego szczepu S. pneumoniae oraz wirusa grypy A. Tabela 3 przedstawia przydatny zestaw humanitarnych punktów końcowych i kryteriów interwencyjnych do zastosowania u myszy w wieku poniżej 21 dni. Zazwyczaj nie stwierdzamy śmiertelności ani zachorowalności przy użyciu S. pneumoniae EF3030 i szczepu wirusa grypy A Udorn/307/72 (H3N2), gdy myszy mają >10 dni.

4.2 W celu zapewnienia dokładności myszy można zważyć przed wstrzyknięciem roztworu anestetyka. Jako wytyczną przyjmuje się, że dla 20-dniowych myszy stosuje się około 50-75 µL roztworu anestetyka. Mysz uznaje się za w pełni znieczuloną, gdy nie reaguje na uszczypnięcie w ogonie lub tylnej kończynie. Podczas przebywania w systemie IVIS myszy będą również wystawione na działanie izofluranu, co wzmocni znieczulenie. Termin obrazowania po zakażeniu myszy zależy od zastosowanych szczepów S. pneumoniae oraz wirusa grypy A, a także od analizowanych objawów. Może być konieczne przeprowadzenie kilku eksperymentów pilotażowych w celu zoptymalizowania czasu obrazowania bioluminescencyjnego.

4.3 Myszy można umieścić w komorze izolacyjnej (która zapobiega przedostawaniu się zanieczyszczeń do wnętrza komory lub na zewnątrz) lub alternatywnie umieścić bezpośrednio w urządzeniu do obrazowania. W eksperymentach z młodymi myszami stosujemy komorę izolacyjną, aby zapewnić utrzymanie zwierząt w narkozie podczas procedury obrazowania oraz zapobiec kontaminacji systemu IVIS bakteriami S. pneumoniae i/lub wirusem grypy A.

4.3 Należy wykorzystać obraz brzuszny myszy, aby uzyskać obraz dróg oddechowych. Obraz boczny myszy zapewnia dokładniejszy obraz uszu.

4.4 Gdy myszy są umieszczane bezpośrednio w komorze, izofluran jest podawany za pomocą stożków nosowych. W przypadku eksperymentów z użyciem młodych myszy zaleca się stosowanie skrzynki izolacyjnej, ponieważ stożki nosowe nie pasują na młode myszy.

4.5 Całkowity czas ekspozycji potrzebny do zarejestrowania obrazu może różnić się w zależności od eksperymentu, w zależności od siły sygnału bioluminescencyjnego, lokalizacji sygnału, szczepu bakteryjnego oraz użytego szczepu myszy. W przypadku tego ostatniego zarówno pigment, jak i futro mogą znacząco tłumić całkowity wykrywalny sygnał. Kamera w systemie IVIS Spectrum to matryca CCD z cienką warstwą odprowadzającą ładunki i tylnym podświetleniem, oferująca szeroki zakres dynamiczny (65536 poziomów szarości). W idealnym przypadku czas ekspozycji powinien być ustawiony tak, aby zarejestrować od 60 do 60 000 zliczeń. W naszym doświadczeniu z myszami C57BL/6 wydłużenie czasu obrazowania powyżej 7 minut nie poprawia znacząco stosunku sygnału do szumu. Alternatywne opcje zwiększenia sygnału bioluminescencyjnego obejmują zwiększenie stopnia binningu (np. na „large”) oraz zastosowanie mniejszego pola widzenia. Co ważne, kwantyfikacji nie należy przeprowadzać na obszarach obrazu zawierających nasycone piksele, ponieważ prowadzi to do niedoszacowania liczby wykrytych fotonów. W przypadku niepewności co do optymalnych warunków, można posłużyć się funkcją automatycznej ekspozycji jako wytyczną.

4.5 Jeśli silny sygnał bioluminescencyjny w jednej części ciała myszy utrudnia wykrycie bioluminescencji w pobliskim obszarze, wybrane regiony myszy można zakryć czarnym papierem, a następnie kontynuować obrazowanie w standardowy sposób

4.7 Jeśli sygnał luminescencyjny jest kwantyfikowany w fotonach (w przeciwieństwie do liczby impulsów), różnice w warunkach obrazowania (np. czasie obrazowania) pomiędzy eksperymentami nie będą wpływać na pomiar sygnału bioluminescencyjnego.

4.8 Jeśli do pomiaru fotonów w określonym obszarze wykorzystuje się całkowity strumień, należy upewnić się, że dla wszystkich próbek zastosowano ten sam kształt „obszaru zainteresowania”.

5.1a Myszy można poddać eutanazji w dowolnym punkcie czasowym po zakażeniu wirusem grypy A, w zależności od zainteresowań badacza. Zazwyczaj określamy miano bakterii i wirusa 6 dni po zakażeniu wirusem grypy A Udorn/307/72 (H3N2) i nie obserwujemy żadnej śmiertelności ani zachorowalności. Jednakże zachorowalność i śmiertelność obserwowane w tych eksperymentach będą się różnić w zależności od użytego szczepu S.pneumoniae oraz wirusa grypy A, a wybrany punkt czasowy powinien uwzględniać wskaźniki śmiertelności i zachorowalności, aby zminimalizować wpływ na dobrostan zwierząt. Tabela 3 stanowi przydatny przewodnik po kryteriach interwencji i humanitarnych punktach końcowych do zastosowania w tych eksperymentach. Zazwyczaj myszy są poddawane eutanazji, a tkanki przetwarzane zgodnie z opisem w ciągu 3 godzin po obrazowaniu bioluminescencyjnym in vivo.

5.1b Myszy w wieku poniżej 10 dni są odporne na hipoksję i są uśmiercane poprzez dekapitację. W opisanym układzie eksperymentalnym myszy mają co najmniej 14 dni i mogą być uśmiercane poprzez uduszenie CO₂.

5.7 Płytki z agarem krwi można uzupełnić o 5μg/ml gentamycyny, aby zapobiec wzrostowi bakterii komensalnych w homogenatach tkanek nosa. Zakres stosowanych rozcieńczeń zależy od użytego szczepu S. pneumoniae. W przypadku eksperymentów na 20-dniowych myszach ze szczepem S. pneumoniae EF3030 stosujemy próbki nierozcieńczone oraz rozcieńczenia 10e-1, 10e-2 i 10e-3.

5.8 Każdą próbkę homogenizatu tkanki należy przechowywać w co najmniej dwóch aliquotach, aby zapewnić próbkę zapasową w przypadku niepowodzenia testu plackowego wirusa! Dokładny miano wirusa można uzyskać jedynie z próbki rozmrożonej raz po zamrożeniu, a nie z próbek wielokrotnie zamrażanych i rozmrażanych.

6.1 Gdy osiągną 90-100% konfluencji, jedna kolba do hodowli tkankowej o powierzchni 150cm² dostarczy wystarczającą ilość komórek MDCK do pięciu płytek 6-dołkowych.

6.5 Optymalne rozcieńczenie seryjne będzie zależeć od użytego szczepu wirusa oraz czasu od momentu zakażenia. Zazwyczaj w przypadku homogenatów narządowych pobranych 6 dni po zakażeniu wirusem grypy A stosujemy próbkę nierozcieńczoną oraz rozcieńczenia 10e-1 i 10e-2.

6.6 Zastosowanie rozcieńczeń seryjnych zapasu wirusa stanowi odpowiednią kontrolę dodatnią do wykorzystania w każdym teście plackowym. Jako kontrolę ujemną można zastosować RPMI+.

8. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Schematyczna budowa zarodkowego jaja kury.

Rysunek 2. BLI myszy zakażonej S. pneumoniae w dniu 3. i 4. po pozorowanej infekcji wirusem grypy.

Rysunek 3. BLI myszy z koinfekcją S. pneumoniae i wirusem grypy w dniu 3. i 4. po zakażeniu wirusem grypy.

Rycina 4. Obciążenie bakteryjne w nosie myszy z pojedynczą i współinfekcją.

Rycina 5. Miana wirusa w nosie i płucach myszy z koinfekcją.

Pożywki	Spis treści
1,8% (m/v) agarozy	Dodać 0,9 g agarozy do 50 ml destylowanej wody H2O2O, wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C przez 10 min. Przenieść do 56°C kąpiel wodna do chłodzenia.
Podwojone stężenie pożywki Leibovitza L15 (ds L15)	1 saszetkę proszku L15 (do przygotowania 1 l) rozpuszcza się w 450 ml sterylnej wody destylowanej H2O2i mieszano do czasu rozpuszczenia. pH skorygowano do wartości 6,8 za pomocą 1M HCl. Następnie dodano 4 ml 7% (w/v) NaHCO3, 0,4 ml HEPES (0,5M, pH 6,8) oraz 200 U/ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyna, 60 μg/ml gentamicyna. Doprowadzić objętość końcową do 500 ml i wysterylizować przez filtrowanie.
Agar z krwią końską (HBA)	4% HBA (Oxoid, Basingstoke, UK), dH2O2O, 7% (v/v) krew końska
RF10	RPMI-1640 zawierające 2 mM glutaminy, 2 nM pirogronianu sodu, 24 μg/ml gentamicyna, 100 J/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyna, 10% (v/v) serum cielęce inaktywowane termicznie.
RPMI+	pożywka RPMI-1640 zawierająca 2 mM glutaminy, 2 nM pirogronianu sodu, 24 μg/ml gentamicyna, 100 J/ml, penicylina, 100 μg/ml streptomycyna
bulion Todd-Hewitt + 0,5% ekstraktu z drożdży	bulion Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, UK) w dH2O2O uzupełnione o 2% (w/v) ekstraktu z drożdży

Tabela 1. Specyficzne pożywki użyte w tym protokole.

Nazwa materiału	Typ	Firma	Numer katalogowy	Komentarz
pożywka RPMI 1640	Odczynnik	Gibco	21870-076
Trypsyna	Odczynnik	Worthington Biochemical Corporation	LS003740	potraktowane TPCK
pożywka L-15 Leibovitza	Odczynnik	Gibco	41300-039
Agaroza, typ I	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A6013	Należy użyć agarozy o niskiej temperaturze topnienia, takiej jak agaroza SeaPlaque.
komórki nerki psa Madin-Darby	Odczynnik	ATCC	CCL-34

Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt:

Wpływ na dobrostan zwierząt
	Objawy od łagodnych do umiarkowanycha	ciężkie objawyb
Objawy nieswoiste:
Wygląd	Lekka do umiarkowanej piloerekcja bez odwodnienia (brak namiotowania skóry)	Piloerekcja oraz odwodnienie (utrata elastyczności skóry)
Kondycja organizmu	zredukowany przyrost masy ciała	Brak przyrostu masy ciała lub spadek masy ciała
Zachowanie	Wyciszony, lecz reagujący; zmniejszona interakcja z rówieśnikami.	Brak reakcji na aktywność i prowokację. Izolacja od pozostałych młodych z miotu.
Specyficzne schorzenia lub nieprawidłowe objawy kliniczne:
Brak plamki mlecznej (	Należy spróbować pobudzić do ssania, jeśli zjawisko to obserwowano przez <24h.	Jeśli po 24–48 godzinach nie stwierdzono obecności plamki mlecznej, nawet przy próbach stymulacji karmienia, lub jeśli jest oczywiste, że młode nie ssało, należy rozważyć eutanazję.
Inne objawy	Skonsultuj się z Kierownikiem Pomieszczeń dla Zwierząt lub Lekarzem Weterynarii Zwierząt Laboratoryjnych w celu ustalenia odpowiednich działań lub decyzji o eutanazji, jeśli zwierzę odczuwa umiarkowany lub silny ból bądź stres

Tabela 3. Kryteria interwencji dla myszy noworodkowych (<21 dni):

^a W przypadku zaobserwowania jednego lub więcej objawów o nasileniu „łagodnym do umiarkowanego”, należy zwiększyć częstotliwość obserwacji do dwóch razy dziennie i w razie potrzeby zasięgnąć porady inspektora ds. dobrostanu zwierząt, aby umożliwić wdrożenie odpowiedniego leczenia i opieki.

^b W przypadku zaobserwowania jednego lub więcej „ciężkich” objawów, należy poddać myszy eutanazji przy użyciu odpowiedniej metody. Myszy w wieku < 10 dni poddaje się eutanazji poprzez dekapitację, natomiast myszy w wieku > 10 dni poprzez uduszenie CO₂.

Dyskusja

In vivo obrazowanie z wykorzystaniem systemu IVIS to unikalna metodologia pozwalająca na wizualizację patogenezy mikrobiologicznej w czasie rzeczywistym ^{4, 6-9}. W niniejszej pracy przedstawiamy zastosowanie tej technologii w celu zrozumienia synergizmu między S. pneumoniae a wirusem grypy u młodych myszy. Dzięki nieinwazyjnemu charakterowi tej techniki byliśmy w stanie monitorować progresję infekcji u każdej myszy w czasie. Pozwoliło nam to udokumentować kinetykę transmisji pneumokoków pomiędzy współmieszkającymi młodymi myszami ³. Nieinwazyjność tej metody umożliwia badaczom wykorzystanie mniejszej liczby zwierząt w każdym eksperymencie, co tym samym ogranicza zużycie zwierząt doświadczalnych. System IVIS pozwala również na wizualizację rozprzestrzeniania się infekcji do wcześniej nieznanych miejsc w organizmie, a także do obszarów trudnych do pobrania próbek metodą sekcji (takich jak ucho środkowe).

Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowych potwierdziliśmy, że poziomy kolonizacji bioluminescencyjnego szczepu EF3030 były porównywalne do poziomów kolonizacji szczepu rodzicielskiego EF3030, wyliczając liczbę żywych komórek w homogenatach tkanek. Ponadto najpierw potwierdziliśmy, że zakażenie wirusem grypy prowadzi do zwiększenia ładunku bioluminescencyjnego EF3030 w nosogardzieli skolonizowanych zwierząt, co wykazano w przypadku szczepu rodzicielskiego EF3030 (wyniki nie zostały przedstawione).

Choć technologia IVIS jest łatwa w obsłudze i generuje powtarzalne oraz łatwe do interpretacji dane, eksperymenty muszą zostać starannie zaprojektowane, aby zmaksymalizować czułość i użyteczność tej metody. Na przykład na czułość kamery IVIS wpływają głębokość i nieprzezroczystość tkanki ⁸, co w naszym doświadczeniu podnosi próg detekcji sygnałów bioluminescencyjnych pochodzących z płuc. Dodatkowo ciemne futro i pigmentowana skóra redukują transmisję światła nawet 10-krotnie (w porównaniu z myszami bezwłosymi) ⁸. Podczas opracowywania tej metody zoptymalizowaliśmy protokół do stosowania u myszy C57BL/6 w wieku od 5 do 14 dni, a następnie wykazaliśmy, że IVIS może być wykorzystany do wykrywania kolonizacji bioluminescencyjnym szczepem S. pneumoniae EF3030 u myszy C57BL/6 w wieku 20 dni. Niemniej jednak detekcja sygnału może być większa, gdy eksperymenty te są przeprowadzane u myszy nago lub BALB/c. Mimo to kamera IVIS stanowi nowatorskie podejście do monitorowania, charakteryzowania i ostatecznego zrozumienia rozwoju choroby pneumokokowej in vivo po zakażeniu wirusem grypy A.