Rekapitulacja krzywej IV kanału jonowego z wykorzystaniem składowych częstotliwościowych

Podsumowanie

Istnieją przeszkody techniczne w jednoczesnym pomiarze przepływu prądu przez wiele kanałów jonowych, a następnie w rozróżnieniu, jaka część prądu transbłonowego wynika z każdego typu kanału. Aby zaspokoić tę potrzebę, niniejsza metoda przedstawia sposób generowania krzywej IV dla poszczególnych typów kanałów z wykorzystaniem specyficznych komponentów częstotliwościowych.

Streszczenie

WSTĘP: Obecnie nie istnieją ugruntowane metody pozwalające na jednoczesny pomiar wielu typów kanałów jonowych i rozdzielenie zmierzonego prądu na składowe przypisane do każdego typu kanału. Niniejsze badanie demonstruje, w jaki sposób spektroskopia impedancyjna może zostać wykorzystana do zidentyfikowania konkretnych częstotliwości, które wykazują wysoką korelację z amplitudą prądu stanu stacjonarnego mierzonego podczas eksperymentów metodą voltage clamp. Metoda ta polega na wprowadzeniu funkcji szumu zawierającej określone częstotliwości do protokołu skokowego napięcia. W przedstawionej pracy wykorzystano komórkę modelową, aby wykazać, że obwody voltage clamp nie wprowadzają wysokich korelacji, a sama funkcja szumu nie generuje żadnych wysokich korelacji w przypadku braku kanałów jonowych. Walidacja ta jest niezbędna przed zastosowaniem techniki w preparatach zawierających kanały jonowe. Celem przedstawionego protokołu jest zademonstrowanie sposobu charakteryzacji odpowiedzi częstotliwościowej pojedynczego typu kanału jonowego na funkcję szumu. Po zidentyfikowaniu konkretnych częstotliwości dla danego typu kanału, mogą one zostać użyte do odtworzenia krzywej zależności prądu stanu stacjonarnego od napięcia (krzywej IV). Częstotliwości, które silnie korelują z jednym typem kanału i minimalnie z innymi typami kanałów, mogą następnie służyć do szacowania wkładu prądowego wielu typów kanałów mierzonych jednocześnie.

METODY: Pomiary metodą clampowania napięcia przeprowadzono na modelu komórki, stosując standardowy protokół skoków napięcia (-150 do +50 mV, skoki co 5mV). Do każdego skoku napięcia wprowadzono funkcje szumu zawierające równe amplitudy częstotliwości z zakresu 1-15 kHz (amplitudy od zera do piku: 50 lub 100mV). Dla każdego potencjału skoku obliczono część rzeczywistą szybkiej transformaty Fouriera (FFT) sygnału wyjściowego z szumem i bez szumu. Amplitudę każdej częstotliwości jako funkcję skoku napięcia skorelowano z amplitudą prądu przy odpowiadających im napięciach.

WYNIKI I WNIOSKI: W przypadku braku szumu (kontrola) amplitudy wszystkich częstotliwości z wyjątkiem składowej stałej (DC) wykazały słabą korelację (|R|<0,5) z krzywą IV, podczas gdy składowa DC miała współczynnik korelacji większy niż 0,999 we wszystkich pomiarach. Jakość korelacji między poszczególnymi częstotliwościami a krzywą IV nie zmieniła się po dodaniu funkcji szumu do protokołu skoku napięcia. Podobnie, zwiększenie amplitudy funkcji szumu nie spowodowało wzrostu korelacji. Pomiary kontrolne wykazują, że sam układ zaciskowy napięcia (voltage clamp) nie powoduje wysokiej korelacji żadnych częstotliwości powyżej 0 Hz z krzywą IV w stanie ustalonym. Równie tak pomiary w obecności funkcji szumu wykazują, że funkcja szumu nie powoduje korelacji żadnych częstotliwości powyżej 0 Hz z krzywą IV w stanie ustalonym w przypadku braku kanałów jonowych. Na podstawie tej weryfikacji metodę można teraz zastosować w preparatach zawierających pojedynczy typ kanału jonowego w celu zidentyfikowania częstotliwości, których amplitudy korelują specyficznie z tym typem kanału.

Protokół

1. Przygotowanie funkcji szumu i sygnału wejściowego

1. Utwórz funkcję szumu zawierającą pożądane komponenty częstotliwości. Można to zrobić poprzez opisanie pożądanych komponentów częstotliwości w dziedzinie częstotliwości, a następnie obliczenie odwrotnej szybkiej transformaty Fouriera. W niniejszym badaniu zastosowano zakres 1 - 15 kHz. Wszystkie transformaty Fouriera oraz odwrotne transformaty Fouriera opisane w tej pracy zostały obliczone przy użyciu funkcji FFT i IFFT programu Matlab.
2. Odpowiednio przeskaluj amplitudę funkcji szumu. W niniejszym badaniu funkcję szumu przeskalowano tak, aby amplituda od zera do szczytu wynosiła 50 lub 100 mV.
3. Utwórz plik bodźca, korzystając z metod odpowiednich dla stosowanego oprogramowania akwizycyjnego. W przypadku programu Clampex 8 najpierw utwórz plik tekstowy z odpowiednim nagłówkiem. Poniżej nagłówka, w pierwszej kolumnie, wprowadź przyrosty czasu dla pojedynczego przejścia (sweep). Przyrosty czasu powinny mieć taki sam odstęp czasowy, jak interwał próbkowania stosowany w pomiarach. Dla każdego przejścia w protokole skoków napięcia wprowadź dokładne wartości napięć pożądane w każdym kroku czasowym. Powinno to obejmować funkcję szumu.

2. Wykonanie pomiarów metodą clampingu napięciowego

1. W oprogramowaniu akwizycyjnym utwórz protokół pomiarowy kompatybilny z wcześniej wygenerowanym plikiem stymulacji. W programie Clampex znajduje się menu umożliwiające przypisanie pliku stymulacji do aktualnego protokołu.
2. Podłącz komórkę modelową (lub biologiczną) do aparatury pomiarowej.
3. Przeprowadź eksperyment zgodnie z harmonogramem. W celach kontrolnych należy pamiętać o uwzględnieniu okresowych pomiarów bez zastosowania funkcji szumu.

3. Analiza po eksperymencie

1. Oblicz krzywą IV dla pojedynczego pomiaru. Jeśli w momencie zastosowania funkcji szumu pomiar znajduje się w stanie ustalonym, krzywą IV można utworzyć, wykorzystując fragment pomiaru w stanie ustalonym, znajdujący się czasowo poza zakresem funkcji szumu. Jeśli pomiar nie był w stanie ustalonym, funkcja szumu może zakłócić obliczenie krzywej IV, dlatego należy wykonać drugi pomiar bez zastosowania funkcji szumu.
2. Dla każdego stopnia napięcia w pomiarze oblicz szybką transformatę Fouriera (FFT) fragmentu pomiaru, w który wstawiono funkcję szumu. Połącz transformaty Fouriera dla każdego stopnia napięcia w macierz m x n, gdzie m to liczba częstotliwości w FFT, a n to liczba stopni napięcia. W tej konfiguracji każdy wiersz macierzy reprezentuje amplitudę pojedynczej częstotliwości dla wszystkich stopni napięcia w eksperymencie.
3. Dla każdej częstotliwości (tj. każdego wiersza w powyższej macierzy) oblicz korelację wiersza z krzywą IV wygenerowaną w punkcie 3.1 i zapisz współczynnik korelacji.
4. Przedstaw zależność współczynnika korelacji od częstotliwości na wykresie, aby zwizualizować częstotliwości, które silnie korelują z krzywą IV. Ponieważ składowa DC znajduje się w pierwszej częstotliwości FFT, współczynnik korelacji dla tej częstotliwości powinien zawsze wynosić > 0,99.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiono reprezentatywne pomiary metodą clampingu napięciowego dla komórki modelowej bez (Rysunek 1A) i z (Rysunek 1B) wprowadzoną funkcją szumu w protokole skoku napięcia. Obliczono również krzywą IV dla komórki modelowej (Rysunek 1C). Dla każdego przejścia w rejestracjach z Rysunku 1, FFT obliczono w ramach czasowych, w których wprowadzono funkcję szumu (patrz czerwona ramka na Rysunkach 1A, 1B). Rysunki 2A i 2B przedstawiają FFT obliczone odpowiednio dla rejestracji pokazanych na Rysunkach 1A i 1B. Po inspekcji wizualnej komponent stały DC (wyróżniony na czerwono) wydaje się naśladować kształt krzywej IV. Bez funkcji szumu wszystkie częstotliwości powyżej DC wydają się mieć amplitudy bliskie zeru (Rysunek 2A). Po wprowadzeniu funkcji szumu częstotliwości między 1 a 15 kHz mają wizualnie zauważalne amplitudy (Rysunek 2B). Rysunek 3 przedstawia wynik korelacji amplitud poszczególnych częstotliwości w zakresie skoków napięcia z krzywą IV. Rysunki 3A-C pokazują współczynniki korelacji w przypadku, gdy eksperyment przeprowadzono w warunkach kontrolnych (bez funkcji szumu) oraz z amplitudami szumu wynoszącymi odpowiednio 50 i 100 mV. Należy zauważyć, że we wszystkich przypadkach komponent DC wydaje się korelować niemal idealnie z krzywą IV. Rzeczywiście, dla wszystkich rejestracji współczynnik korelacji dla tej częstotliwości był większy niż 0.99 (R = 0.9996 ± 1E-5, średnia ± odchylenie standardowe). Analizując Rysunek 3A (warunki kontrolne), nie stwierdzono żadnych częstotliwości poza komponentem DC, których amplituda korelowałaby istotnie z krzywą IV. W szczególności żadna z tych częstotliwości nie posiada współczynnika korelacji większego niż 0.5. Po wprowadzeniu funkcji szumu o najniższej amplitudzie (50 mV), te same częstotliwości nadal miały współczynniki korelacji mniejsze niż 0.5. Współczynniki korelacji dla tych częstotliwości nie przekroczyły również wartości 0.5 po zwiększeniu amplitudy szumu do 100 mV.

Rysunek 1. Rejestracje z modelu komórki: Przedstawiono rejestracje metodą clampa napięciowego dla modelu komórki bez (1A) oraz z (1B) funkcją szumu włączoną do protokołu skoków napięcia. Przez pierwsze i ostatnie 20 ms każdego przejścia potencjał utrzymywano na poziomie potencjału trzymania (0 mV). Każdy skok napięcia trwał 80 ms, a funkcję szumu wprowadzono 40 ms po rozpoczęciu skoku. Funkcja szumu trwała 30 ms i zawierała częstotliwości od 1 do 15 kHz. Napięcie zmieniano skokowo od -150 do +50 mV w przyrostach 5 mV. Przedstawiono również krzywą IV dla modelu komórki (1C). Aby zwiększyć czytelność rejestracji, na rysunkach 1A i 1B uwzględniono tylko co piąte przejście, natomiast na rysunku 1C uwzględniono wszystkie przejścia.

Rysunek 2. FFT rejestracji: Obliczono FFT dla 30 ms fragmentu każdego przebiegu, w którym ma zostać wprowadzona funkcja szumu (obszar ograniczony czerwoną ramką na Rysunkach 1A i 1B). Rysunki 2A i 2B przedstawiają odpowiednio FFT obliczone bez i z funkcją szumu. Ponownie, dla przejrzystości, na rysunku uwzględniono FFT tylko z każdego piątego przebiegu, jednak w dalszych obliczeniach wykorzystano wszystkie przebiegi.

Rycina 3. Korelacje częstotliwości IV: Przedstawiono wyniki korelacji między krzywą IV pomiaru a amplitudą poszczególnych częstotliwości w zakresie skoków napięcia. Ryciny 1A - 1C pokazują współczynnik korelacji dla częstotliwości od 0 do 20 kHz odpowiednio w warunkach kontrolnych oraz w obecności funkcji szumu 50 lub 100 mV.

Rycina 4. Rekonstrukcja krzywej IV: Nałożono na siebie krzywą IV dla komórki modelowej (analogicznie do Ryciny 1C) oraz amplitudy dwóch częstotliwości. Pierwsza częstotliwość stanowiła składową DC (R = 0,995), a druga była losowo wybraną częstotliwością o niskiej korelacji (R = 0,3212). Amplitudy częstotliwości przeskalowano tak, aby były zbliżone do amplitudy krzywej IV.

Dyskusja

Istnieją przeszkody techniczne, które obecnie uniemożliwiają badaczom jednoczesny pomiar wielu typów kanałów jonowych w celu późniejszego określenia, jaka część prądu powinna być przypisana do każdego typu kanału. Z powodu tego ograniczenia kanały jonowe są zazwyczaj badane pojedynczo, z wykorzystaniem takich technik jak clamp napięciowy, prądowy i potencjału czynnościowego.¹ Do badania poszczególnych typów kanałów często stosuje się heterologiczne systemy ekspresji.² Podczas pracy z komórkami izolowanymi z tkanek, takimi jak kardiomiocyty, należy zastosować inne metody blokowania różnych kanałów jonowych. Na przykład kanały sodowe można dezaktywować za pomocą powolnej rampy napięcia depolaryzującego,³ kanały potasowe prostujące do wewnątrz można zablokować za pomocą zewnątrzkomórkowego BaCl2,⁴ a kanały wapniowe można zablokować przy użyciu werapamilu.⁵

Jedną z metod stosowanych w celu częściowego przezwyciężenia tego ograniczenia jest jednoczesny pomiar przepływu prądu przez dwa typy kanałów, a następnie powtórzenie pomiaru po selektywnym zablokowaniu jednego typu kanałów odpowiednim czynnikiem. Różnica między tymi dwoma pomiarami może posłużyć do oszacowania ilości prądu przypisanej do zablokowanego typu kanałów.⁶ Technika ta posiada jednak dwa główne ograniczenia. Po pierwsze, nie zidentyfikowano czynników chemicznych, które mogłyby selektywnie blokować każdy kanał jonowy, a niektóre powszechnie stosowane leki wykazują niespecyficzne interakcje z innymi typami kanałów.^5,7 Po drugie, za pomocą tej techniki nie można ustalić, czy jeden kanał jest modulowany przez inny kanał. Na przykład wykazano heterogenną ekspresję NaV 1.5 i Kir 2.1 w komorach serca świnki morskiej i zasugerowano istnienie synergistycznej relacji między tymi dwoma kanałami, tak że wyższa ekspresja Kir 2.1 w prawej komorze obniża prędkość przewodzenia.⁸ Obecnie nie można tego zweryfikować.

W niniejszym badaniu sugerujemy, że spektroskopia impedancyjna może być użytecznym narzędziem do badania wielu typów kanałów jonowych mierzonych jednocześnie. Chociaż zaprezentowana metoda nigdy nie była stosowana do rozróżniania prądów z dwóch typów kanałów mierzonych jednocześnie, spektroskopia impedancyjna była wykorzystywana do badania szeregu innych aspektów funkcji kanałów jonowych. Goodman i Art wykazali na przykładzie słuchowych komórek rzęsatych żółwia, że protokoły zacisku prądowego (current clamp) można modyfikować w celu dostrojenia komórki do różnych częstotliwości, a oscylacje potencjału błonowego wynikają z oddziaływania między wewnątrzprostującym kanałem K⁺ a kanałem Ca²⁺.⁹ Han i Frazier udowodnili, że impedancję można mierzyć w pojedynczej komórce w szerokim zakresie częstotliwości (od 100 hZ do 5 MhZ), a wzrost impedancji obserwowany po zablokowaniu kanałów K⁺ lub Ca²⁺ mógłby stanowić prosty sposób wykrywania blokady kanałów w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków.¹⁰ Hayashi i Fishman wykorzystali przewodność zespoloną do badania właściwości kinetycznych wewnątrzprostującego kanału K⁺.¹¹ Inne grupy wprowadzały pojedynczą częstotliwość do protokołu zacisku napięciowego (voltage clamp) dla różnych typów kanałów i wykazały, że obserwowana odpowiedź częstotliwościowa była zgodna z oczekiwaną odpowiedzią dla niektórych częstotliwości, ale nie dla innych.^12,13 Millonas i Hanck zasugerowali, że przyczyną braku oczekiwanej odpowiedzi dla niektórych częstotliwości jest obecność wielu stałych szybkości w modelu Markowa.¹² Badania tego typu, a także inne, wykazały, że zdarzają się przypadki, gdy prądy jonowe mierzone z kanałów jonowych przy użyciu spektroskopii impedancyjnej nie są zgodne z teoretyczną odpowiedzią częstotliwościową. Nie stanowi to problemu w niniejszym badaniu, ponieważ celem metody w tej pracy jest zidentyfikowanie częstotliwości korelujących z amplitudą prądu, niezależnie od podstawowych założeń dotyczących elektrycznego obwodu błony. Ponadto amplituda prądu jest obliczana z fragmentów zapisów, do których nie wprowadzono żadnych funkcji szumu. Liczne inne badania przedstawiają również modele wielu kanałów jonowych wykazujących liczne stany przewodzące i nieprzewodzące, z których każdy posiada własne stałe szybkości.^14,15,16 Thompson i wspólnicy wykazali, że filtr selektywności kanału KcsA posiada różne miejsca wiązania dla Na⁺, Li+ i K⁺, a koszty energetyczne przejścia z jednego miejsca wiązania do drugiego podczas przemieszczania się jonu przez filtr selektywności sprawiają, że kanał ten preferencyjnie przewodzi jony K⁺ przez swój por.¹⁷ W niniejszej pracy wprowadziliśmy zakres częstotliwości (funkcję szumu) do protokołu skokowego napięcia i poszukaliśmy częstotliwości, których amplituda silnie koreluje z całkowitą amplitudą prądu. Skoro przedstawiono silne dowody sugerujące, że wiele stałych szybkości odgrywa rolę w przewodzeniu jonów przez różne kanały, wprowadzenie częstotliwości powiązanych z tymi stałymi szybkości może spowodować, że określone częstotliwości wejdą w rezonans lub silnie skorelują z amplitudą prądu, co w przeciwnym razie by nie nastąpiło. Technika zaprezentowana w tym badaniu została wykonana na komórce modelowej, która jest równoległym obwodem RC, zazwyczaj używanym do testowania układów zacisku napięciowego oraz sprzętu akwizycyjnego. Nie oczekuje się, aby jakiekolwiek częstotliwości poza DC korelowały z wielkością prądu, co zostało wykazane w naszych danych. Wykazaliśmy również, że dodanie funkcji szumu nie spowodowało silnej korelacji żadnej z częstotliwości z amplitudą prądu. Te dwa ustalenia są kluczowe, ponieważ pokazują, że sprzęt pomiarowy i funkcja szumu same w sobie nie powodują korelacji częstotliwości z amplitudą prądu. W przyszłych badaniach, podczas pomiarów przy użyciu błon zawierających kanały jonowe, oczekuje się, że w zależności od zastosowanego kanału częstotliwości odpowiadające stałym szybkości w filtrze selektywności lub być może w porze będą wpływać na odpowiedź częstotliwościową kanału i determinować, które częstotliwości będą wykazywać wysoką lub niską korelację z amplitudą prądu.

Ponieważ metoda ta jest nową techniką badania kanałów jonowych, istnieje szereg kierunków, w których mogą zostać rozwinięte przyszłe badania. Po pierwsze, technikę tę należy wykorzystać do charakterystyki odpowiedzi częstotliwościowej poszczególnych izolowanych kanałów. Niezbędne są również dodatkowe prace w celu kalibracji amplitud częstotliwości względem amplitud prądu. Po przeprowadzeniu indywidualnej charakterystyki wielu kanałów, należy przystąpić do jednoczesnego pomiaru wielu typów kanałów. Technikę tę można również dostosować do zastosowania w badaniach z użyciem zacisku potencjału czynnościowego (action potential clamp), zacisku prądowego (current clamp) oraz stymulacji polowej. Choć jest to nowa metoda, wykazuje ona potencjał jako potężne narzędzie do wykonywania pomiarów elektrofizjologicznych, które wcześniej nie były możliwe, co może dostarczyć cennych nowych informacji na temat fizjologicznej roli kanałów jonowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matlab	Mathworks	n/a	Natick, MA
Clampex 8	Molecular Devices	Clampex 8	Sunnyvale, CA
Integrujący wzmacniacz do techniki patch clamp	Molecular Devices	Axopatch 200	Sunnyvale, CA
Przedwzmacniacz (headstage)	Molecular Devices	CV202	Sunnyvale, CA
16-bitowy system akwizycji danych	Molecular Devices	Digidata 1322A	Sunnyvale, CA
Komórka modelowa	Molecular Devices	Patch 1 Model Cell	Sunnyvale, CA