System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji u wektorów komarów

Summary

Opisano metody wykorzystania systemów transdukujących alfawirusy do ekspresji fluorescencyjnych reporterów in vitro i u dorosłych komarów. Technika ta może być dostosowana do wyrażania dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania zamiast lub oprócz białka reporterowego.

Abstract

Systemy transdukujące alfawirusa (ATS) są ważnymi narzędziami do wyrażania interesujących genów (GOI) podczas infekcji. ATS pochodzą z klonów cDNA wirusów RNA przenoszonych przez komary (rodzaj Alphavirus; rodzina Togaviridae). Rodzaj Alphavirus obejmuje około 30 różnych gatunków wirusów przenoszonych przez komary. Alfawirusy są wirusami otoczkowymi i zawierają jednoniciowe genomy RNA (~11,7 Kb). Alfawirusy transkrybują subgenomowe mRNA, które koduje białka strukturalne wirusa niezbędne do enkapsji genomu i dojrzewania wirusa. Alfawirusy są zwykle wysoce lityczne w komórkach kręgowców, ale uporczywie infekują wrażliwe komórki komarów przy minimalnej cytopatologii. Te cechy sprawiają, że są doskonałymi narzędziami do ekspresji genów w wektorach komarów. Najczęściej używane ATS-y pochodzą od wirusa Sindbis (SINV). Szeroki tropizm gatunkowy SINV pozwala na infekcję komórek owadów, ptaków i ssaków8. Jednak ATS-y pochodzą również z innych alfawirusów^9,10,20. Ekspresja obcych genów jest możliwa dzięki wprowadzeniu dodatkowego miejsca inicjacji lub promotora subgenomowego RNA wirusa. ATS, w których egzogenna sekwencja genów jest umieszczona 5' w stosunku do genów strukturalnych wirusa, jest stosowana do stabilnej ekspresji białek u owadów. ATS, w których sekwencja genu jest umieszczona 3' w stosunku do genów strukturalnych, służy do wyzwalania RNAi i wyciszania ekspresji tego genu u owada.

ATS okazały się cennymi narzędziami do zrozumienia interakcji wektor-patogen, molekularnych szczegółów replikacji wirusa i podtrzymujących cykli zakaźnych^3,4,11,19,21. W szczególności ekspresja reporterów fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych odegrała zasadniczą rolę w śledzeniu infekcji wirusowej w wektorze i transmisji wirusa^5,14-16,18. Ponadto opisano odpowiedź immunologiczną wektora przy użyciu dwóch szczepów SINV zaprojektowanych do ekspresji GFP^2,9.

Tutaj prezentujemy metodę produkcji SINV zawierającej fluorescencyjny reporter (GFP) z zakaźnego klonu cDNA. Zakaźne, pełnowymiarowe RNA jest transkrybowane ze zlinearyzowanego klonu cDNA. Zakaźne RNA jest wprowadzane do permisywnych komórek docelowych za pomocą elektroporacji. Transfekowane komórki wytwarzają zakaźne cząsteczki wirusa wykazujące ekspresję GOI. Zebrany wirus jest używany do zakażania komarów, jak opisano tutaj, lub innych gatunków żywicieli (niepokazanych w niniejszym dokumencie). Kompetencję wektora ocenia się poprzez wykrywanie fluorescencji poza jelitem środkowym lub monitorowanie transmisji wirusa⁷. Wykorzystanie reportera fluorescencyjnego jako rządu Indii pozwala na wygodne oszacowanie rozprzestrzeniania się wirusa w hodowli komórkowej, w celu określenia szybkości infekcji, rozprzestrzeniania się u narażonych komarów, przenoszenia wirusa z komara i zapewnia szybki wskaźnik kompetencji wektora.

Protocol

Następujący protokół jest napisany do produkcji i używania ATS opartego na wirusie Sindbis MRE16. ATS jest przeznaczony do ekspresji GFP w wektorze komara Aedes aegypti. Obecnie dostępne są zakaźne klony wielu alfawirusów (wirus Sindbis, wirus Chikungunya, wirus O'nyong-nyong, wirus zachodniego zapalenia mózgu koni), które zostały zaprojektowane jako ATS (Tabela 1). Aby uzyskać najlepsze wyniki, plazmidowe DNA jest amplifikowane w bakteriach, takich jak bakterie kompetentne SURE (Stratagene/Agilent Technologies), aby uniknąć niepożądanej rekombinacji i utraty wirusowego cDNA. Wszystkie zakaźne plazmidy klonów mają promotor bakteriofaga T7 lub SP6 na bezpośrednim końcu 5' wirusowego cDNA do transkrypcji pełnej długości genomowego RNA i unikalną endonukleazę restrykcyjną na końcu 3' do transkrypcji odpływowej. Dla każdego ATS użytkownicy muszą użyć odpowiedniej polimerazy RNA zależnej od DNA bakteriofaga i unikalnej endonukleazy restrykcyjnej do transkrypcji genomu RNA wirusa in vitro.

1. Generowanie zakaźnego RNA z klonu cDNA.

1. Linearyzować 5 μg zakaźnego plazmidu klonu (p5'dsMRE16/GFP) z 20 jednostkami enzymu restrykcyjnego XhoI w reakcji 100 μl. Inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze 37°C
2. Oczyść zlinearyzowane DNA za pomocą alternatywnego protokołu oczyszczania Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit, eluując DNA z kolumny wirowej przy użyciu 50 μl wody wolnej od RNazy. Stężenie plazmidu powinno wynosić około 1,0 μg/μL.
3. W probówce PCR o pojemności 0,2 ml bez RNaz należy przeprowadzić reakcję transkrypcyjną o pojemności 50 μl za pomocą zestawu Ambion MAXIscript Kit zgodnie z protokołem w następujący sposób.
   
   • 22,5 μl dH₂O bez RNaz
     • 5,0 μl Linearyzowana matryca DNA (1,0 μg/μL)
     • 2,5 μL 10 mM ATP
     • 2,5 μL 10mM CTP
     • 2,5 μL 10mM UTP
     • 2,5 μL 1mM GTP
     • 2,5 μL 10mM nasadka analogowa (m⁷G(5')ppp(5')G) G)
     • 5,0 μL 10-krotny bufor transkrypcyjny
     • 5,0 μl mieszaniny polimerazy T7 lub SP6
   • 50,0 μL ogółem
4. Inkubować reakcję transkrypcji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po inkubacji reakcję należy natychmiast wykorzystać do elektroporacji ogniw BHK-21. Przygotowanie komórek BHK-21 do elektroporacji należy rozpocząć w trakcie reakcji transkrypcji inkubacji.

2. Generowanie wirusa z zakaźnego RNA

1. Trypsynizuj dwie 70-80% zlewające się 150 cm² (T-150) komórki kolby BHK-21 na ATS.
2. Przenieś wszystkie komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Granulować komórki przez odwirowanie przy 2000 obr./min, 10 min, 4°C w konwencjonalnej wirówce stołowej.
4. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym PBS bez Mg++ i Ca++. Powtarzać kroki 2.3 i 2.4, aż komórki zostaną trzykrotnie przemyte PBS.
5. Ponownie zawiesić granulowane komórki 0,5 ml MEM zawierające 10% FBS.
6. Rozcieńczyć 10 μl komórek 90 μl MEM z 10% FBS i liczyć na hemacytometr. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki do 2,5-12,5 x 10⁷ komórek/ml MEM zawierającym 10% FBS.
7. Do lodowatej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,2 cm dodaj 400 μl zawiesiny komórek i 20 μl reakcji transkrypcji. Wytrzyj kondensację z kuwety.
8. Impulsuj kuwetę dwukrotnie: 450 V, 1200 Ω, 150 μF. Używamy manipulatora Electro Cell, Harvard Apparatus Model ECM630.
9. Umieścić całą zawartość kuwety w kolbie do hodowli tkankowej o średnicy 25^cm2 zawierającej 5 ml MEM z 10% FBS.
10. Inkubować kolbę(-y) w temperaturze 37°C z 5% CO₂ .
11. Codziennie monitoruj infekcję za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim zestawem filtrów (np. filtr GFP: długość fali wzbudzenia = 460-490 nm, długość fali emisji = 510-550 nm; lub filtr dsRed: długość fali wzbudzenia = 460-560 nm, długość fali emisji = >590 nm).
12. Gdy fluorescencja sugeruje, że infekcja zlewa się i/lub CPE jest widoczne w całej kolbie, należy zebrać zawartość kolby, dodać 30% FBS, w razie potrzeby podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80°C. W razie potrzeby lizaty komórkowe można oczyścić przez odwirowanie (2000 obr./min, 10 min, 4°C) przed dodaniem FBS.
13. Wirus musi przejść co najmniej raz przez nową kolbę komórkową w celu zwiększenia miana wirusa do kolejnych testów krwiopochodnych.

3. za os Zakażenie komarami

1. Wymieszać ze sobą krew (zwykle zakupioną defibrynowaną krew owczą) i zawiesinę wirusa pochodzącą z hodowli komórkowych z kroku 2.13. Końcowe miano wirusa w mączce z krwi zazwyczaj powinno wynosić ~1x10⁷ jednostek tworzących płytkę (pfu) / ml, aby zapewnić skuteczną infekcję komara w jelicie środkowym. Aby pobudzić komary do obrzęku, można dodać adenozyno5'-trifosforan (ATP) do końcowego stężenia 0,02M.
2. Być może komary będą musiały zostać pozbawione wody i cukru przed zakażeniem, aby pobudzić je do skutecznego odżywiania się krwią ze sztucznego karmnika. Czas trwania deprywacji powinien być wcześniej ustalony, aby zminimalizować śmiertelność. Czas będzie zależał od gatunku komarów, wilgotności owada itp. Jako punkt wyjścia usuń cukier i wodę 12 godzin przed karmieniem. W protokole tym wykorzystywane są szklane podajniki z płaszczem wodnym17 z krążącą wodą o temperaturze 37°C. Błonę jelitową świń (tj. dokładnie umytą osłonkę kiełbasy dostępną w większości sklepów spożywczych) umieszcza się nad otworem karmnika, a mączkę pipetuje się do komory. Dla różnych typów wektorów dostępne są różne konstrukcje, membrany i protokoły.
3. Komary są sortowane tak, aby wybierać tylko te komary, które są nabrzmiałe krwią. Nabrzmiałe komary przenosi się do kartonu z organdami na wierzchu, a komary są inkubowane w temperaturze 28°C, 75-80% wilgotności względnej, aż do przetworzenia w celu ekspresji GFP.

4. Inokulacja komarów doklatkowa

Inokulacja dopiersiowa jest alternatywną metodą zakażenia stawonoga. Metodę tę stosuje się, gdy rozsiew przez jelito środkowe nie jest wymagany. (Metoda opisana poniżej, ale technika nie jest pokazana w tym eksperymencie wizualnym).

1. Niewielka liczba komarów (5-10) jest zasysana z klatek do plastikowych rurek przytrzymujących. Szczelnie zamknięte rurki podtrzymujące zostaną umieszczone w temperaturze 4°C na 15 minut, aby schłodzić komary.
2. 2 5 komarów zostanie wylanych z rurki na szklaną szalkę Petriego spoczywającą na lodzie. Umieść pokrywkę na szalce Petriego, gdy nie jest używana lub jeśli komary zaczną się poruszać. Podczas obchodzenia się z komarami należy zwrócić uwagę na liczenie i śledzenie liczby komarów, którymi manipuluje się. Gdy komary zostaną wysypane na stół chłodzący, całkowita liczba zostanie zapisana na ladzie laboratoryjnej.
3. Igła jest przygotowywana przez stopienie rurki kapilarnej przy użyciu specjalnego szkła Nanoject i ściągacza do igieł.
4. Ustawić mikrowstrzykiwacz Nanoject II zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi dostarczania inokulum o pojemności 69 nL. Należy zachować ostrożność podczas wciągania inokulum do igły, aby igła nie została uszkodzona.
5. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wbij igłę w klatkę piersiową komara i aktywuj Nanoject do zaszczepienia. Podczas zaszczepiania komarów należy zachować ostrożność, aby igła nie wbiła się całkowicie w komara i nie opuściła drugiej strony, co spowodowało późniejszą śmierć komara. Sprawdź każdego komara, aby upewnić się, że inokulum dostało się do środka przed wyjęciem go z igły.
6. Po zaszczepieniu, gdy komar jest jeszcze nabity na igłę, umieść go w papierowym kartonie przez mały otwór z boku, który jest zatkany bawełnianym lub korkowym korkiem przez cały inny czas.
7. Gdy komary zostaną zaszczepione i umieszczone w kartonie (do około 50 sztuk w kartonie), ostrożnie przyklej korek taśmą, aby zapobiec przypadkowemu uwolnieniu komarów. Umieść kartony w bezpiecznym pojemniku przed dalszą inkubacją w insektariuszu w temperaturze 28°C i wilgotności względnej 80%.

5. Monitorowanie infekcji komarów

1. Umieść karton z papierem w temperaturze 4°C na około 15 minut, aby unieruchomić komary.
2. Przenieś niewielką liczbę komarów (5-10 na raz) na stół chłodzący przystosowany do użytku pod mikroskopem fluorescencyjnym.
3. Zbadaj i posortuj komary na podstawie obecności lub braku fluorescencji. Dodatkowo intensywność fluorescencji może być używana jako zastępczy pomiar ilościowy infekcji. Tkanki komarów, takie jak jelito środkowe, gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe, można wypreparować i monitorować pod kątem fluorescencji.
4. W razie potrzeby umieść wybrane komary z powrotem w papierowym kartonie, aby kontynuować inkubację zakażonych komarów.

6. Test transmisji (wymuszone wydzielanie śliny w celu wykazania transmisji wirusa)

1. Pozbawić komary źródła cukru na 24 godziny przed karmieniem.
2. Usuń nogi i skrzydła
3. Do rurki kapilarnej o pojemności 50 μl, która została podgrzana, pociągnięta i odcięta na jednym końcu, dodaj 3-5 μl olejku immersyjnego Cargille typu B lub 10% roztworu surowicy i sacharozy.
4. Włóż trąbkę do rurki. Jeśli używasz oleju, z trąbki będą wydobywać się kropelki śliny. Jeden μl 1% roztworu pilokarbiny w PBS i 0,1% Tween 80 można nałożyć na klatkę piersiową w celu stymulacji.
5. Po 60-90 minutach usuń komary i w razie potrzeby przechowuj w celu izolacji wirusa.
6. Usunąć roztwór z probówki przez odwirowanie w probówce zawierającej 100 μl 20% FBS-PBS.
7. Sterylnie przefiltruj inokulum przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, a następnie użyj przefiltrowanego inokulum do zakażenia hodowanych komórek.

BEZPIECZEŃSTWO BIOLOGICZNE UWAGA: Ten protokół opisuje metodę generowania, identyfikacji i monitorowania zakażonych komarów. W zależności od posiadanych urządzeń (np. stołu chłodzącego, obiektu przechowawczego itp.) oraz zatwierdzenia IBC, mogą Państwo być ograniczeni do ich sprawdzenia dopiero po usunięciu skrzydeł i nóg, aby zapobiec ucieczce. ATS oparte na SINV mogą być generowane i używane w środowisku BSL2. Stosowanie ATS opartych na innych alfawirusach, takich jak wirus Chikungunya lub wirusy zachodniego zapalenia mózgu koni, będzie wymagało urządzeń BSL3.

7. Reprezentatywne wyniki

Przegląd ekspresji genu markerowego (GFP) za pomocą ATS 5'dsMRE16/GFP jest pokazany na rysunku 1. Ekspresję GFP w komórkach BHK-21 i C6/36 (Aedes albopictus) pokazano na rycinie 2 w określonych momentach po zakażeniu komórek wirusem 5'dsMRE16/GFP przy 0,01 wielokrotności infekcji. Rycina 3 przedstawia przegląd zakażenia alfawirusem i wirusem ATS u komara, gdy wirus jest dostarczany przez zakaźny posiłek z krwi. Rycina 4 przedstawia przygotowanie posiłku z krwi z ~10⁷ pfu/ml wirusa ATS, a następnie doustne zakażenie Aedes aegypti. Widok całego ciała zakażonego komara i wybranych części ciała po 10 dniach od zakażenia przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego (ryc. 5). Wykrywanie GFP i dsRED w jelicie środkowym zakażonych komarów po zakażeniu wirusami ATS 5'dsMRE16 eksprymującymi każdy gen markera fluorescencyjnego (ryc. 6). Test transmisji przy użyciu komarów zakażonych wirusem ATS 5'dsMRE16/GFP (ryc. 7).

Tabela 1. ATS są obecnie modyfikowane pod kątem ekspresji genów u komarów.

 
Alphavirus Ats komar odniesienie Wirus Sindbis TE/3'2J oraz TE/5'2J Aedes aegypti 12     Ochlerotatus triseriatus 13   3'dsMRE16 i
5'dsMRE16 A. aegypti 5     Culex tritaeniorhynchus (Culex tritaeniorhynchus) 5   5'dsTR339 A. aeg ypti cyfra arabska         Wirus Chikungunya 3'dsCHIKV i
5'dsCHIKV A. aegypti/A. albopictus 20         Wirus O'nyong nyong 5'dsONNV Anopheles gambiae (Anopheles gambiae) 1,9         Wirus zachodniego zapalenia mózgu koni 5'dsWEEV. Mcmillan Culex tarsalis (Culex tarsalis) Stauft et al., niepublikowane

Tabela 2. Zalety/wady stosowania ATS do ekspresji genów u komarów.

Zalety: Szybka produkcja wirusa o wysokim mianie Szeroki zakres hostów (SINV) Wysoka szybkość replikacji RNA Wysoki poziom ekspresji transgenu Względna łatwość manipulowania genami Stabilna, trwała ekspresja genów u owadów Minimalna patologia u owadów   Wady: Tryb krótkotrwałej ekspresji w komórkach kręgowców Silne działanie cytopatyczne na komórki kręgowców Ograniczenia rozmiaru genów (najlepiej <1 Kb) Niektóre alfawirusy wymagają zabezpieczenia BSL3

Rysunek 1: Przegląd produkcji wirusa ATS w komórkach BHK-21 przy użyciu p5'dsMRE/GFP SINV eksprymującego GFP. Po transkrypcji in vitro, genomowe ATS RNA jest elektroporowowane do komórek BHK-21, gdzie wirus jest ratowany. Wirus ATS może być następnie wykorzystywany do zakażania komarów. SGP = promotor subgenomowy. W komórkach transkrybowane są trzy gatunki RNA ATS: genomowe, subgenomowe 1 i subgenomowe 2. Glikoproteiny C (kapsyd), E2 i E1 są łączone z genomem ATS w celu wytworzenia zakaźnego wirusa.

Rysunek 2: Ekspresja GFP w komórkach komara (C6/36) po zakażeniu wirusem SINV 5'dsMRE16/GFP.

Rysunek 3: Przegląd infekcji wirusem ATS u komarów prowadzącej do przenoszenia wirusa.

Rysunek 4: Zakażenie ATS SINV 5'dsMRE16 poprzez wystawienie komarów na zakaźny posiłek z krwi.

Rysunek 5: Zakażenie ATS SINV 5'dsMRE16/GFP po 10 dniach od zakażenia. Wykrywanie GFP w całym organizmie pokazuje, że wirus uciekł z jelita środkowego i rozprzestrzenił się do tkanek wtórnych. Rysunek przedstawia również ekspresję GFP w wybranych częściach ciała, która również wskazuje na rozsiane zakażenie.

Rysunek 6: Zakażenie ATS SINV 5'dsMRE16/GFP i 5'dsMRE16/dsRED jelita środkowego w określonych momentach po zakażeniu. Jelito środkowe zwykle ma wyraźne ogniska infekcji wcześnie po spożyciu posiłku z krwi zawierającego wirusa, który rozprzestrzenia się w tylnym jelicie środkowym w późniejszym czasie po zakażeniu.

Rysunek 7: Wykrywanie ATS 5'dsMRE16/GFP w ślinie komara już po 8 dniach od zakażenia. Test ma na celu wykazanie transmisji wirusa ATS i pokazuje, że wirus 5'dsMRE16/GFP może stabilnie wyrażać GFP przez cały okres inkubacji zewnętrznej u komara. Lewy panel pokazuje komara śliniącego się do rurki kapilarnej, środkowy panel pokazuje komórki C6 / 36 zakażone śliną po 1 dniu, a prawy panel 3 dni po zakażeniu.

Discussion

Przedstawione tu metody umożliwiają naukowcom śledzenie infekcji alfawirusem w hodowli komórek komarów i dorosłej samicy komara. Zalety i wady stosowania wirusów ATS podsumowano w Tabeli 2. Zakaźny klon ATS może być genetycznie manipulowany w celu ekspresji dowolnego GOI i był używany do ekspresji przeciwciał jednołańcuchowych, supresorów RNAi, antysensownych RNA ukierunkowanych na geny endogenne i białek proapoptotycznych. Jeśli reporter nie jest używany, część obrazowania tej metody nie jest istotna. Jednak wiele z tych samych protokołów jest niezbędnych do ratowania, rozprzestrzeniania się i infekcji komarami ATS. Istnieją ograniczenia co do maksymalnego rozmiaru transgenu po wprowadzeniu do systemu transdukującego alfawirusa. Ograniczenia wielkości różnią się w zależności od szczepu rodzicielskiego użytego do wytworzenia ATS, ale zwykle wynoszą około 1 kb, chociaż większe geny reporterowe, takie jak lucyferazy świetlika, zostały wykorzystane do budowy ATS do stosowania u komarów. Laboratoria badawcze ze skromnym zapleczem wirusologicznym powinny być w stanie korzystać z ATS zgodnie z tymi protokołami. Wiele laboratoriów badawczych już to zrobiło przy użyciu ATS opartych na SINV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
MAXIscript Kit	Ambion	AB1312	Upewnij się, że używasz zestawu zawierającego odpowiednią polimerazę do Twojej konstrukcji.
Czapka analogowa (m7G(5')ppp(5')G)	Ambion	AM8050
Nanoject II nanolitrowy wtryskiwacz	Drummond Scientific	3-000-204
Manipulator elektrokomórkowy	Aparat Harvard	ECM 630