Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Podsumowanie

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.

Streszczenie

Pierwsze etapy widzenia u kręgowców zachodzą, gdy światło stymuluje fotoreceptory pręcikowe i czopkowe siatkówki ¹. Informacje te są następnie rozdzielane na tak zwane szlaki ON i OFF. Fotoreceptory przekazują informacje o świetle do komórek bipolarnych (BC), które ulegają depolaryzacji w odpowiedzi na wzrost (On BC) lub spadek (Off BC) natężenia światła. Ta segregacja informacji świetlnej jest utrzymywana na poziomie komórek zwojowych siatkówki (RGC), których dendryty warstwują się albo w podwarstwie Off wewnętrznej warstwy splotowej (IPL), gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od Off BC, albo w podwarstwie On IPL, gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od On BC. Ta segregacja informacji dotyczących wzrostu lub spadku oświetlenia (szlaki On i Off) jest zachowana i przekazywana do mózgu równolegle.

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są komórkami wyjściowymi siatkówki, a zatem stanowią istotny obiekt badań w celu zrozumienia, w jaki sposób informacje świetlne są przesyłane do jąder wzrokowych w mózgu. Postępy w genetyce myszy w ostatnich dekadach doprowadziły do powstania wielu linii myszy z reporterami fluorescencyjnymi, w których konkretne populacje RGC są znakowane białkiem fluorescencyjnym, co umożliwia identyfikację podtypów RGC ^{2 3 4} oraz precyzyjne celowanie podczas rejestracji elektrofizjologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rejestracji odpowiedzi na światło z fluorescencyjnie znakowanych komórek zwojowych w nienaruszonej, izolowanej preparacji siatkówki. Taka izolowana preparacja siatkówki pozwala na rejestrację z RGC, w których drzewo dendrytyczne pozostaje nienaruszone, a wejścia sygnałów w całym obszarze dendrytów RGC są zachowane. Metoda ta ma zastosowanie do różnych podtypów komórek zwojowych i jest dostosowana do szerokiego zakresu fizjologicznych technik jednokomórkowych.

Protokół

Oświadczenie dotyczące wykorzystania zwierząt: Zwierzęta były utrzymywane zgodnie z wytycznymi opisanymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, przy zastosowaniu protokołów zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Minnesoty.

1) Przygotowanie roztworów

1. Przed przystąpieniem do rejestracji elektrofizjologicznej należy przygotować roztwory wewnątrzkomórkowe, zewnątrzkomórkowe oraz roztwory enzymatyczne.
2. Roztwór zewnątrzkomórkowy: wymieszać jedną butelkę (8,8 g) sproszkowanego medium Ames' (Sigma) z 1 l H₂O i 1,9 g wodorowęglanu sodu (23 mM). Na każdym etapie roztwór zewnątrzkomórkowy musi być nasycony mieszaniną gazów 95% O₂/5% CO₂. Przenieść 200 mL do zlewki w celu przechowywania siatkówki. Pozostały roztwór umieścić w zbiorniku systemu perfuzyjnego do perfuzji grawitacyjnej po zamocowaniu siatkówki.
3. Roztwór wewnątrzkomórkowy: roztwór wewnątrzkomórkowy powinien zostać przygotowany wcześniej, a następnie rozdzielony na aliquoty po 500-1000 μL i przechowywany w temperaturze -20 °C. Skład roztworu wewnątrzkomórkowego różni się w zależności od rodzaju prowadzonego eksperymentu; dla przedstawionych tutaj rejestracji w trybie current clamp stosujemy (w mM): 125 K-gluconate, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na₂-ATP, 0,5 mM NaGTP; pH ustawić na 7,2 za pomocą KOH ⁵. W celu wizualizacji dendrytów podczas eksperymentu można dodać marker fluorescencyjny, np. 10 μM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen), a do analizy anatomii komórki po rejestracji można dołączyć neurobiotynę (0,3%). Przed rozpoczęciem rejestracji rozmrozić roztwór wewnątrzkomórkowy.
4. Roztwór enzymatyczny: połączyć 10000 jednostek kolagenazy (Worthington Chemicals) z 83 mg hialuronidazy (Worthington Chemicals) w 4,150 mL roztworu zewnątrzkomórkowego. Przechowywać w aliquotach po 50 μL w temperaturze -20°C. Alikwoty można wykorzystywać przez kilka tygodni. Przed przystąpieniem do traktowania siatkówki rozcieńczyć alikwot w 500 μL napowietrzonego roztworu zewnątrzkomórkowego.
5. Roztwór buforu fosforanowego (PBS): do 800 mL H₂O dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄. pH ustawić na 7,4 za pomocą NaOH. Uzupełnić objętość do 1 L.
6. 0,2 M bufor fosforanowy: do 800 ml H₂O dodać 21,8 g Na₂HPO₄ oraz 6,4 g NaH₂PO₄. Uzupełnić objętość do 1 L.
7. 4% roztwór paraformaldehydu: podgrzać 50 ml H₂O do 60°C. Dodać 4 g paraformaldehydu i mieszać przez kilka minut. Dodać kilka kropli 1M NaOH (około 5 kropli) i mieszać do czasu uzyskania klarownego roztworu. Do zlewki dodać 50 ml 0,2 M buforu fosforanowego. Sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych (~7,4). Przefiltrować i schłodzić.
8. Roztwór blokujący (10% surowicy koziej, 0,5% TritonX100): do 1,8 ml PBS dodać 0,2 ml surowicy koziej oraz 10 μL Triton X-100. TritonX-100 służy do permeabilizacji tkanki.
9. Roztwór streptawidyny (5% surowicy koziej, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): do 1,9 ml PBS dodać 0,1 ml surowicy koziej, 10 μL Triton X-100 oraz 4 μL Streptavidin 594.

2) Izolacja siatkówki z myszy

Wymagane narzędzia do sekcji: 1 pęseta nr 2, 2 pęsety nr 5, nożyczki okulistyczne

1. Uśmierć mysz zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, w tym przypadku poprzez uduszenie CO₂, a następnie przeprowadź enukleację gałki ocznej, delikatnie wsuwając zakrzywioną pęsetę nr 2 za oko i wyjmując gałkę oczną.
2. Umieść gałkę oczną w szalce Petriego o średnicy 35 mm z roztworem zewnątrzkomórkowym. Przetnij nerw wzrokowy oraz wszelkie przytwierdzone mięśnie pozagałkowe lub tkankę łączną za pomocą nożyczek okulistycznych. Wycięcie rogówki wykonaj nożyczkami okulistycznymi, a następnie wyjmij soczewkę za pomocą pęsety nr 5. Rozdarzyj twardówkę pęsetą nr 5 i użyj jej do przecięcia nerwu wzrokowego w miejscu, gdzie siatkówka i twardówka łączą się w obrębie tarczy nerwu wzrokowego. Delikatnie oddziel siatkówkę od oczodołu. Wskazówka: Wykonuj każdy krok na obu siatkówkach przed przejściem do kolejnego etapu, aby zminimalizować czas operacji.
3. Za pomocą pęsety usuń ciało szkliste przylegające do siatkówki. Można to zrobić, „chwytając” pęsetą przezroczyste ciało szkliste znajdujące się nad siatkówką. Prawidłowo usunięte ciało szkliste powinno być widoczne na pęsecie jako przejrzysta, żelowa substancja. Wskazówka: Przecięcie siatkówek na pół po usunięciu ciała szklistego pozwoli zmaksymalizować ilość użytecznej tkanki i ułatwi montaż w komorze.
4. Przechowuj siatkówki w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej, w ciemnym środowisku z minimalnym światłem otoczenia, aż do momentu rozpoczęcia trawienia. Siatkówki można w ten sposób przechowywać przez ok. 6 godzin.

3) Traktowanie siatkówki mieszaniną enzymów i montaż w komorze rejestracyjnej

1. Rozcieńczyć alikwot kolagenazy/hialuronidazy w 500 μL roztworu zewnątrzkomórkowego, przelać roztwór do szalki Petriego o średnicy 35 mm i przenieść do niej siatkówkę.
2. Przechowywać przykrytą szalkę Petriego z siatkówką w ciemności, w środowisku 95% O2/5% CO₂, przez 15 min przy łagodnym mieszaniu. Krok ten wspomaga trawienie pozostałości ciała szklistego i ułatwia dostęp do warstwy komórek zwojowych. Wskazówka: w przypadku siatkówek od młodszych zwierząt z mniejszą ilością ciała szklistego lub w razie zaobserwowania niepożądanych efektów, czas ten można skrócić do ok. 5 minut.
3. Wyjąć siatkówkę z medium zawierającego enzymy i dokładnie wypłukać w roztworze zewnątrzkomórkowym.
4. Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej ⁶ warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Odessać pozostały płyn pipetą lub chłonnym papierem, a następnie rozprostować brzegi siatkówki, aby spłaszczyć tkankę, uważając, by dotykać jedynie krawędzi siatkówki i szczególnie unikając kontaktu z warstwą komórek zwojowych. Umieścić nad siatkówką pierścień platynowy z nylonową siatką w celu zakotwiczenia tkanki i natychmiast wypełnić komorę roztworem zewnątrzkomórkowym.
5. Zamontować komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu, podłączyć rurkę do perfuzji grawitacyjnej i ssania próżniowego oraz podłączyć przewód uziemiający.

4) Lokalizacja komórek zwojowych wykazujących ekspresję EGFP oraz stymulacja światłem

1. Przeprowadź perfuzję siatkówki grawitacyjnie przy użyciu roztworu zewnątrzkomórkowego z prędkością 1 mL/min lub szybciej. Wskazówka: Jeśli prędkość perfuzji będzie zbyt niska, tkanka nie zostanie wystarczająco dotleniona, co może zaburzyć sygnalizację synaptyczną.
2. Napełnij pipetę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść ją w uchwycie do pipet. Wskazówka: Najlepsze wyniki dają pipety o oporności w zakresie od 3 do 5MΩ.
3. Obrazuj siatkówkę w podczerwieni przy użyciu optyki kontrastu interferencyjnego (DIC) przy niskim powiększeniu (obiektyw 10X, NA 0.3), aby zlokalizować pipetę rejestrującą. Światło podczerwone jest stosowane w celu zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne i ograniczenia adaptacji świetlnej. Przejdź na wyższe powiększenie (obiektyw 40X, NA 0.8) i wprowadź elektrodę w pole widzenia tuż nad tkanką.
4. Przy wysokim powiększeniu (obiektyw 40X) oświetl siatkówkę światłem epifluorescencyjnym (480 nm dla EGFP), wybierz fluorescencyjną komórkę zwojową i zaznacz ją na monitorze komputera za pomocą taśmy (Rysunek 1A).
5. W oświetleniu DIC i podczerwieni ustaw elektrodę rejestrującą w pobliżu wybranej komórki zwojowej (Rysunek 1A). Oczyść obszar bezpośrednio nad komórką, przyłożąc delikatne dodatnie ciśnienie do elektrody rejestrującej za pomocą plastikowej strzykawki 12cc połączonej z uchwytem pipety rurką polietylenową. W wzmacniaczu wyzeruj wszelkie przesunięcia napięcia. Przyłóż elektrodę do wybranej komórki zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie.
6. Przy wzmacniaczu w trybie clamp napięciowego (voltage clamp) przyłóż impuls testowy i monitoruj prąd przepływający przez pipetę. Przyłóż ujemne ciśnienie, aby stworzyć uszczelnienie (seal) między elektrodą a komórką. Zwolnij ujemne ciśnienie, gdy komórka zacznie się uszczelniać i czekaj, aż prąd podtrzymujący będzie wskazywał na uszczelnienie elektryczne rzędu GΩ między błoną komórkową a pipetą. Przykładaj delikatne impulsy ujemnego ciśnienia, aż pojawią się przejściowe prądy pojemnościowe, a następnie całkowicie zwolnij ciśnienie. Wskazówka: jeśli oporność dostępu (szeregową) jest wysoka (>30MΩ), można to często poprawić za pomocą dodatkowych, bardzo delikatnych impulsów ujemnego ciśnienia.
7. Po uzyskaniu stabilnego uszczelnienia przyłóż impuls ujemnego ciśnienia. Po przejściu w tryb whole cell pozwól komórce na adaptację w ciemności przez 5 minut. Zarejestruj w trybie clamp prądowym (current clamp) odpowiedź na stymulację pełnopolową białym światłem (Rysunek 1B).
8. Po zakończeniu rejestracji Alexafluor-594 dyfunduje do dendrytów. Tracer można zwizualizować w epifluorescencji przy 594 nm i wykorzystać do określenia, czy komórka zwojowa jest typu On-, Off- lub Bi-stratified, przełączając się między optyką epifluorescencyjną a DIC w podczerwieni ⁵.
9. Jeśli w pipecie znajduje się neurobiotyna, a siatkówka ma zostać poddana obróbce do immunohistochemii, pipetę należy delikatnie wycofać, aby zminimalizować uszkodzenie błony.

5) Analiza anatomii zarejestrowanych komórek zwojowych

Wypełnianie neurobiotyną pozwala na bardziej szczegółową analizę morfologiczną komórek zwojowych po zakończeniu rejestracji. Wskazówka: Jeśli pożądane są konkretne korelacje między zarejestrowaną komórką zwojową a szczegółową morfologią, najlepiej może być rejestrować i wypełniać tylko jedną RGC na preparat.

1. Jeśli do roztworu wewnątrzkomórkowego dodano neurobiotynę, należy umieścić siatkówkę w roztworze paraformaldehydu i utrwalać przez noc w temperaturze 4°C.
2. Płukać w PBS przez co najmniej 2 godziny, wykonując minimum 6 wymian. Przenieść siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący. Pozostawić w roztworze blokującym na 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
3. Zastąpić roztwór blokujący roztworem streptawidyny. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 4°C na wytrząsarce. Płukać siatkówkę w PBS, wykonując 6 płukań po 20 min każde.
4. Zamontować siatkówkę na szkiełku przedmiotowym przy użyciu Vectashield. Siatkówkę należy umieścić komórkami zwojowymi do góry. Wykonać mikroskopię konfokalną (Rysunek 1C).

Reprezentatywne wyniki

Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja przebiegła pomyślnie, poszczególne komórki zwojowe powinny być widoczne w mikroskopii DIC przy dużym powiększeniu (Rycina 1A). Siatkówki niezdrowe będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone. Jeżeli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest zachowana, komórka powinna reagować potencjałami czynnościowymi w momencie włączenia lub wyłączenia światła, a w przypadku komórki zwojowej wewnętrznie światłoczułej (Rycina 1B) – trwałą depolaryzacją.

Rycina 1. Lokalizacja, rejestracja i barwienie fluorescencyjnie znakowanej komórki zwojowej siatkówki. (A) Komórka RGC dodatnia pod kątem GFP zwizualizowana przy oświetleniu epifluorescencyjnym z powiększeniem 40X (panel lewy) oraz przy oświetleniu DIC (panel prawy). (B) Synaptyczna odpowiedź świetlna wewnętrznie światłoczułej komórki zwojowej siatkówki typu M2, zarejestrowana w trybie current clamp z całej komórki (whole-cell) z fluorescencyjnie znakowanej RGC. (C) Wewnętrznie światłoczuła komórka zwojowa siatkówki typu M1, która została zidentyfikowana w epifluorescencji, wytypowana do rejestracji whole-cell, wypełniona neurobiotyną, a następnie poddana Immunohistochemii.

Dyskusja

Technikę tę można zastosować do rejestracji z dowolnych komórek zwojowych siatkówki z wyizolowanej siatkówki. Chociaż w linii myszy użytej powyżej wewnętrznie światłoczułe, wykazujące ekspresję melanopsyny RGC są znakowane EGFP^{2, 5}, protokół ten można łatwo przenieść na inne fluorescencyjnie znakowane linie RGC lub uogólnić w celu rejestracji z losowo wybranych RGC. Technika ta jest szczególnie cenna, ponieważ drzewo dendrytyczne każdej komórki RGC oraz odpowiadające im neurony wejściowe pozostają całkowicie n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Ames’	Sigma-Aldrich	A1420
Kolagenaza	Worthington Biochemical	LS005273
Hialuronidaza	Worthington Biochemical	LS002592
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Hydrazyd AlexaFluor 594	Invitrogen	A10442
Neurobiotyna	Vector Laboratories	SP1120
Elektrody	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Pinceta	Fine Science Tools	11252-30
Nożyczki okulistyczne	Fine Science Tools	15000-00
Streptawidyna 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Surowica kozia	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	19210