Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Podsumowanie

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.

Streszczenie

Pierwsze etapy widzenia u kręgowców zachodzą, gdy światło stymuluje fotoreceptory pręcikowe i czopkowe siatkówki ¹. Informacje te są następnie rozdzielane na tak zwane szlaki ON i OFF. Fotoreceptory przekazują informacje o świetle do komórek bipolarnych (BC), które ulegają depolaryzacji w odpowiedzi na wzrost (On BC) lub spadek (Off BC) natężenia światła. Ta segregacja informacji świetlnej jest utrzymywana na poziomie komórek zwojowych siatkówki (RGC), których dendryty warstwują się albo w podwarstwie Off wewnętrznej warstwy splotowej (IPL), gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od Off BC, albo w podwarstwie On IPL, gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od On BC. Ta segregacja informacji dotyczących wzrostu lub spadku oświetlenia (szlaki On i Off) jest zachowana i przekazywana do mózgu równolegle.

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są komórkami wyjściowymi siatkówki, a zatem stanowią istotny obiekt badań w celu zrozumienia, w jaki sposób informacje świetlne są przesyłane do jąder wzrokowych w mózgu. Postępy w genetyce myszy w ostatnich dekadach doprowadziły do powstania wielu linii myszy z reporterami fluorescencyjnymi, w których konkretne populacje RGC są znakowane białkiem fluorescencyjnym, co umożliwia identyfikację podtypów RGC ^{2 3 4} oraz precyzyjne celowanie podczas rejestracji elektrofizjologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rejestracji odpowiedzi na światło z fluorescencyjnie znakowanych komórek zwojowych w nienaruszonej, izolowanej preparacji siatkówki. Taka izolowana preparacja siatkówki pozwala na rejestrację z RGC, w których drzewo dendrytyczne pozostaje nienaruszone, a wejścia sygnałów w całym obszarze dendrytów RGC są zachowane. Metoda ta ma zastosowanie do różnych podtypów komórek zwojowych i jest dostosowana do szerokiego zakresu fizjologicznych technik jednokomórkowych.

Protokół

Oświadczenie dotyczące wykorzystania zwierząt: Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi opisanymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Minnesoty.

1) Przygotowanie roztworów

1. Przed przystąpieniem do rejestracji elektrofizjologicznej należy przygotować roztwory wewnątrzkomórkowe, zewnątrzkomórkowe oraz roztwory enzymatyczne.
2. Roztwór zewnątrzkomórkowy: wymieszać jedną butelkę (8,8 g) proszkowego medium Ames' (Sigma) z 1 l H₂O i 1,9 g wodorowęglanu sodu (23 mM). Na każdym etapie roztwór zewnątrzkomórkowy musi być nasycony mieszaniną gazów 95% O₂/5% CO₂. Przenieść 200 mL do zlewki do przechowywania siatkówki. Pozostały roztwór przelać do pojemnika systemu perfuzyjnego w celu perfuzji grawitacyjnej po zamontowaniu siatkówki.
3. Roztwór wewnątrzkomórkowy: roztwór wewnątrzkomórkowy powinien zostać przygotowany wcześniej, a następnie podzielony na aliquoty po 500-1000 μL i przechowywany w temperaturze -20 °C. Skład roztworu wewnątrzkomórkowego zależy od rodzaju planowanego eksperymentu; dla przedstawionych tutaj rejestracji w trybie clamp prądowy stosujemy (w mM): 125 K-glukonianu, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na₂-ATP, 0,5 mM NaGTP; pH dostosować do 7,2 za pomocą KOH ⁵. W celu wizualizacji dendrytów podczas eksperymentu można dodać znacznik fluorescencyjny, taki jak 10 μM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen), a do analizy anatomii komórki po rejestracji można dołączyć neurobiotynę (0,3%). Przed rozpoczęciem rejestracji odfreeze roztwór wewnątrzkomórkowy.
4. Roztwór enzymatyczny: połączyć 10000 jednostek kolagenazy (Worthington Chemicals) z 83 mg hialuronidazy (Worthington Chemicals) w 4,150 mL roztworu zewnątrzkomórkowego. Przechowywać w aliquotach po 50 μL w temperaturze -20°C. Alikwoty można wykorzystywać przez kilka tygodni. Przed rozpoczęciem traktowania siatkówki rozcieńczyć aliquot w 500 μL napowietrzanego roztworu zewnątrzkomórkowego.
5. Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS): do 800 mL H₂O dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Uzupełnić objętość do 1 L.
6. 0,2 M bufor fosforanowy: do 800 ml H₂O dodać 21,8 g Na₂HPO₄ oraz 6,4 g NaH₂PO₄. Uzupełnić objętość do 1 L.
7. 4% roztwór paraformaldehydu: podgrzać 50 ml H₂O do 60°C. Dodać 4 g paraformaldehydu i mieszać przez kilka minut. Dodać kilka kropli 1M NaOH (około 5 kropli), mieszać do uzyskania klarownego roztworu. Dodać 50 ml 0,2 M buforu fosforanowego do zlewki. Sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych (~7,4). Przefiltrować i schłodzić.
8. Roztwór blokujący (10% surowicy koziej, 0,5% TritonX100): do 1,8 ml PBS dodać 0,2 ml surowicy koziej i 10 μL Triton X-100. TritonX-100 służy do permeabilizacji tkanki.
9. Roztwór streptawidyny (5% surowicy koziej, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): do 1,9 ml PBS dodać 0,1 ml surowicy koziej, 10 μL Triton X-100 oraz 4 μL Streptavidin 594.

2) Izolacja siatkówki myszy

Wymagane narzędzia do sekcji: 1 pęseta nr 2, 2 pęsety nr 5, nożyczki okulistyczne

1. Uśmierć mysz zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, w tym przypadku poprzez uduszenie CO₂, a następnie przeprowadź enukleację gałki ocznej, delikatnie wprowadzając zakrzywioną pęsetę nr 2 za oko i wyjmując gałkę oczną.
2. Umieść gałkę oczną w 35 mm czalce Petriego z roztworem pozakomórkowym. Przetnij nerw wzrokowy oraz wszelkie przyczepione mięśnie pozagałkowe lub tkankę łączną za pomocą nożyczek oftalmologicznych. Wycięcie rogówki wykonaj nożyczkami oftalmologicznymi, a soczewkę wyjmij pęsetą nr 5. Rozdar się twardówkę za pomocą pęsety nr 5 i użyj jej do przecięcia nerwu wzrokowego w miejscu, gdzie siatkówka i twardówka łączą się w obrębie tarczy nerwu wzrokowego. Delikatnie oddziel siatkówkę od skrzypca gałki ocznej. Wskazówka: Wykonaj każdy krok na obu siatkówkach przed przejściem do następnego etapu, aby zminimalizować czas.
3. Użyj pęsety, aby usunąć ciało szkliste przylegające do siatkówki. Można to zrobić, „chwytając” przezroczyste ciało szkliste nad siatkówką za pomocą pęsety. Prawidłowo usunięte ciało szkliste powinno być widoczne jako przejrzysta, galaretowata substancja na pęsecie. Wskazówka: Przecięcie siatkówek na pół po usunięciu ciała szklistego pozwoli maksymalnie wykorzystać ilość tkanki i ułatwi montaż w komorze.
4. Przechowuj siatkówki w natlenionym roztworze pozakomórkowym w temperaturze pokojowej, w ciemnym środowisku z minimalnym oświetleniem zewnętrznym, aż do momentu rozpoczęcia trawienia. Siatkówki mogą być w ten sposób przechowywane przez około 6 godzin.

3) Obróbka siatkówki mieszaniną enzymów i montaż w komorze rejestracyjnej

1. Rozcieńczyć alikwot kolagenazy/hialuronidazy w 500 μL roztworu zewnątrzkomórkowego, przelać roztwór do szalki Petriego o średnicy 35 mm i przenieść siatkówkę.
2. Przechowywać przykrytą szalkę Petriego z siatkówką w ciemności, w środowisku 95% O2/5% CO₂ przez 15 min przy delikatnym mieszaniu. Krok ten wspomaga trawienie pozostałości ciała szklistego i ułatwia dostęp do warstwy komórek zwojowych. Wskazówka: w przypadku siatkówek od młodszych zwierząt z mniejszą ilością ciała szklistego lub w razie zaobserwowania działań niepożądanych, czas ten można skrócić do ok. 5 minut.
3. Wyjąć siatkówkę z medium zawierającego enzymy i dokładnie przemyć roztworem zewnątrzkomórkowym.
4. Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej ⁶ warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Odessać pozostały płyn za pomocą pipety lub chusteczki i rozprostować brzegi siatkówki, aby spłaszczyć tkankę, uważając, by dotykać jedynie krawędzi siatkówki i szczególnie unikając kontaktu z warstwą komórek zwojowych. Nałożyć na siatkówkę pierścień platynowy z nylonową siatką w celu zakotwiczenia tkanki i natychmiast wypełnić komorę roztworem zewnątrzkomórkowym.
5. Zamocować komorę rejestracyjną na stole mikroskopu, podłączyć rurkę do perfuzji grawitacyjnej i ssania próżniowego oraz podłączyć przewód uziemiający.

4) Lokalizacja komórek zwojowych wykazujących ekspresję EGFP oraz stymulacja światłem

1. Przepłucz siatkówkę grawitacyjnie roztworem zewnątrzkomórkowym z prędkością 1 mL/min lub szybciej. Wskazówka: Jeśli szybkość perfuzji będzie zbyt niska, tkanka nie zostanie wystarczająco utleniona, co może zakłócić sygnalizację synaptyczną.
2. Napełnij pipetę rejestracyjną roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść ją w uchwycie pipety. Wskazówka: Najlepsze wyniki dają pipety o oporności w zakresie od 3 do 5 MΩ.
3. Zwizualizuj siatkówkę przy użyciu podczerwonego kontrastu interferencyjnego (DIC) przy niskim powiększeniu (obiektyw 10X, NA 0,3), aby zlokalizować pipetę rejestracyjną. Światło podczerwone stosuje się w celu zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne i ograniczenia adaptacji świetlnej. Przejdź na wyższe powiększenie (obiektyw 40X, NA 0,8) i wprowadź elektrodę w pole widzenia bezpośrednio nad tkanką.
4. Przy dużym powiększeniu (obiektyw 40X) oświetl siatkówkę światłem epifluorescencyjnym (480 nm dla EGFP), wybierz fluorescencyjną komórkę zwojową i zaznacz ją na monitorze komputera za pomocą taśmy (Rysunek 1A).
5. W warunkach oświetlenia DIC i podczerwonego ustaw elektrodę rejestracyjną w pobliżu wybranej komórki zwojowej (Rysunek 1A). Oczyść obszar bezpośrednio nad komórką, przykładając delikatne dodatnie ciśnienie do elektrody rejestracyjnej za pomocą plastikowej strzykawki 12 cc połączonej z uchwytem pipety rurką polietylenową. Wzmacniaczu wyzeruj wszelkie przesunięcia napięcia. Przystaw elektrodę do wybranej komórki zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie.
6. Przy ustawieniu wzmacniacza w trybie clamp napięciowy (voltage clamp) zastosuj impuls testowy i monitoruj prąd przepływający przez pipetę. Zastosuj ciśnienie ujemne, aby stworzyć uszczelnienie (seal) między elektrodą a komórką. Zwolnij ciśnienie ujemne, gdy komórka zacznie się uszczelniać, i czekaj, aż prąd podtrzymujący wskaże uszczelnienie elektryczne rzędu GΩ między błoną komórkową a pipetą. Stosuj delikatne impulsy ciśnienia ujemnego, aż pojawią się przejściowe prądy pojemnościowe, a następnie przestań aplikować ciśnienie. Wskazówka: jeśli oporność dostępu (szeregową) jest wysoka (>30 MΩ), można to często poprawić poprzez dodatkowe, bardzo delikatne impulsy ciśnienia ujemnego.
7. Po uzyskaniu stabilnego uszczelnienia zastosuj impuls ciśnienia ujemnego. Po przejściu w tryb whole cell pozwól komórce na adaptację w ciemności przez 5 minut. Zarejestruj w trybie clamp prądowy (current clamp) odpowiedź na stymulację pełnym polem białym światła (Rysunek 1B).
8. Po zakończeniu rejestracji Alexafluor-594 dyfunduje do dendrytów. Marker można zwizualizować w epifluorescencji przy 594 nm i wykorzystać do określenia, czy komórka zwojowa jest typu On, Off lub bistratyfikowana, przełączając się między epifluorescencją a optyką podczerwoną DIC ⁵.
9. Jeśli w pipecie zastosowano neurobiotynę, a siatkówka ma zostać poddana immunohistochemii, pipetę należy delikatnie wycofać, aby zminimalizować uszkodzenie błony.

5) Analiza anatomii zarejestrowanych komórek zwojowych

Wypełnianie neurobiotyną umożliwia bardziej szczegółową analizę morfologiczną komórek zwojowych po zakończeniu rejestracji. Wskazówka: Jeśli pożądane są konkretne korelacje między rejestrowaną komórką zwojową a jej szczegółową morfologią, najlepiej może być rejestrowanie i wypełnianie tylko jednej RGC na preparat.

1. Jeśli do roztworu wewnątrzkomórkowego dodano neurobiotynę, należy umieścić siatkówkę w roztworze paraformaldehydu i utrwalać przez noc w temperaturze 4°C.
2. Płukać w PBS przez co najmniej 2 godziny, wymieniając roztwór co najmniej 6 razy. Przenieść siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący. Pozostawić w roztworze blokującym na 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
3. Zastąpić roztwór blokujący roztworem streptawidyny. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 4°C na wytrząsarce. Płukać siatkówkę w PBS (6 płukań, każde po 20 min).
4. Zamontować siatkówkę na szkiełku przedmiotowym przy użyciu Vectashield. Siatkówkę należy umieścić komórkami zwojowymi do góry. Wykonać mikroskopię konfokalną (Rysunek 1C).

Reprezentatywne wyniki

Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja przebiegła pomyślnie, poszczególne komórki zwojowe powinny być widoczne w mikroskopii DIC przy dużym powiększeniu (Rysunek 1A). Siatkówki niezdrowe będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone. Jeśli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest zachowana, komórka powinna reagować na włączenie lub wyłączenie światła potencjałami czynnościowymi, a w przypadku wewnątrzpochłonnych komórek zwojowych światłoczułych (Rysunek 1B) – trwałą depolaryzacją.

Rysunek 1. Lokalizacja, rejestracja i barwienie fluorescencyjnie znakowanej komórki zwojowej siatkówki. (A) RGC dodatnia pod kątem GFP wizualizowana przy oświetleniu epifluorescencyjnym z powiększeniem 40X (panel lewy) oraz przy oświetleniu DIC (panel prawy). (B) Synaptyczna odpowiedź świetlna wewnątrzicznie światłoczułej komórki zwojowej siatkówki typu M2, zarejestrowana w trybie clamp prądowy całej komórki (whole-cell current clamp) z fluorescencyjnie znakowanej RGC. (C) Wewnątrzicznie światłoczuła komórka zwojowa siatkówki typu M1, która została zidentyfikowana w epifluorescencji, wytypowana do rejestracji whole-cell, wypełniona neurobiotyną, a następnie poddana obróbce immunohistochemicznej.

Dyskusja

Technikę tę można zastosować do rejestracji z dowolnych komórek zwojowych siatkówki z wyizolowanej siatkówki. Chociaż w linii myszy użytej powyżej wewnętrznie światłoczułe, wykazujące ekspresję melanopsyny RGC są znakowane EGFP^{2, 5}, protokół ten można łatwo przenieść na inne fluorescencyjnie znakowane linie RGC lub uogólnić w celu rejestracji z losowo wybranych RGC. Technika ta jest szczególnie cenna, ponieważ drzewo dendrytyczne każdej komórki RGC oraz odpowiadające im neurony wejściowe pozostają całkowicie n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Ames’	Sigma-Aldrich	A1420
Kolagenaza	Worthington Biochemical	LS005273
Hialuronidaza	Worthington Biochemical	LS002592
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Hydrazyd AlexaFluor 594	Invitrogen	A10442
Neurobiotyna	Vector Laboratories	SP1120
Elektrody	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Pinceta	Fine Science Tools	11252-30
Nożyczki okulistyczne	Fine Science Tools	15000-00
Streptawidyna 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Surowica kozia	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	19210