Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Podsumowanie

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Streszczenie

Nadwrażliwość opóźniona (DTH) to reakcja zapalna pośredniczona przez limfocyty T pamięci efektorowej wykazujące ekspresję CCR7, które infiltrują miejsce wstrzyknięcia antygenu, przeciwko któremu układ odpornościowy został uprzednio uwrażliwiony. Reakcja zapalna charakteryzuje się zaczerwienieniem i obrzękiem w miejscu podania antygenu. Jest to wygodny model do określania skuteczności in vivo leków immunosupresyjnych. skórną reakcję DTH można wywołać albo poprzez adoptywny transfer antygenowo swoistych limfocytów T, albo poprzez aktywne uodpornienie antygenem, a następnie wewnątrzskórne podanie tego antygenu w celu wywołania reakcji zapalnej w określonym obszarze skóry. Odpowiedzi DTH można indukować w stosunku do różnych antygenów, np. owalbuminy, tuberkuliny, toksoidu tężcowego lub hemocyjaniny z małża klucznika (KLH).

W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wywołać aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis. W pierwszej kolejności przygotujemy emulsję woda-w-oleju z KLH, będącego badanym antygenem, w pełnym adjuwancie Freunda, a następnie wstrzykniemy tę emulsję podskórnie szczurom. Pozwoli to uwrażliwić układ odpornościowy na wytworzenie komórek T pamięci skierowanych przeciwko KLH. Siedem dni później wykonamy próbę prowokacyjną poprzez wstrzyknięcie w skórę grzbietu szczurów KLH po jednej stronie oraz owalbuminy, będącej antygenem nieistotnym, po drugiej stronie. Reakcja zapalna będzie widoczna po 16–72 godzinach, a obszar zaczerwienienia i obrzęku zostanie zmierzony jako wskaźnik nasilenia reakcji DTH.

Protokół

1. Przygotowanie emulsji

1. Emulsja jest mieszaniną w stosunku 1:1 antygenu (DTH można indukować za pomocą różnych antygenów: owalbuminy, toksoidu tężcowego, hemocjaniny z małży kluczowatego...) w roztworze wodnym dodanego do pełnego adiuwantu Freunda. Bardzo ważne jest, aby dodawać antygen do adiuwantu, a nie odwrotnie!!!
   
   
2. Przy przygotowywaniu i wstrzykiwaniu emulsji powstaje dużo odpadów, dlatego należy zawsze przygotować 1,5 lub 2 razy więcej niż jest potrzeba.
   
   
3. Rozpuścić antygen w soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór o stężeniu 2 mg/ml. Nie filtrować, aby nie utracić agregatów!!!
   
   
4. Umieścić pełny adiuwant Freunda H37Ra (Difco, katalog nr 231131) w probówce i wymieszać na wortexie z dużą prędkością. Dodawać antygen kropla po kropli podczas wortexowania. Po dodaniu całego antygenu mieszać na wortexie przez kolejne 5 minut. Mieszanina powinna stać się biała.
   
   
5. Przenieść emulsję do szklanej strzykawki i połączyć ją z drugą szklaną strzykawką za pomocą łącznika 18G (katalog Fisher nr 14-825-17L). Przepompowywać emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aż stanie się gęsta (5-10 min). Najlepiej użyć dwóch strzykawek o pojemności 5 ml. Jeśli wymagane jest więcej niż 5 ml emulsji, należy użyć kilku zestawów strzykawek 5 ml.
   
   
6. Emulsję można przechowywać w strzykawkach w temperaturze 4°C przez 3 tygodnie.

2. Immunizacja szczurów

1. Mieszać emulsję w strzykawkach przez kilka minut, a następnie przenieść ją do strzykawki przeznaczonej do iniekcji. Wstrzyknąć 200 ml podskórnie w 1-2 miejscach u nasady ogona, używając igieł 23G i strzykawki 3 ml z końcówką Luer-Lok.

3. Podanie antygenu w okolicy grzbietowej

1. Siedem dni po immunizacji należy ogolić dwa miejsca na grzbietach szczurów i wstrzyknąć śródskórnie 20 ml roztworu antygenu o stężeniu 1 mg/ml w jedno miejsce oraz sól fizjologiczną (lub nieistotny antygen) w drugie miejsce. NIE należy filtrować roztworu antygenu, ponieważ może to spowodować utratę agregatów nasilających reakcję zapalną.
   
   
2. Szczury powinny zostać poddane znieczuleniu, aby uniknąć ruchów. Roztwór należy wstrzyknąć śródskórnie, używając igieł 27G ½ i strzykawek 1 ml. Należy wymieniać igły pomiędzy iniekcjami.
   
   Uwaga: w celu uzyskania bardziej precyzyjnych pomiarów wyzwanie można przeprowadzić w małżowinie usznej zamiast na grzbiecie. Zobacz wideo pod adresem https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Pomiar DTH

1. Miejsce wstrzyknięcia zacznie czerwienieć i puchnąć, co jest oznaką stanu zapalnego. Należy zmierzyć średnicę stanu zapalnego za pomocą linijki lub, najlepiej, suwmiarki. Maksymalny obrzęk powinien wystąpić między 24 a 72 godziną.

Dyskusja

Aby uzyskać dokładniejszy pomiar reakcji DTH, zaleca się podanie antygenu szczurom do małżowiny usznej. Reakcję można następnie zmierzyć jako różnicę w obrzęku ucha między uchem poddanym działaniu odpowiedniego antygenu a uchem poddanym działaniu samego soli fizjologicznej lub nieistotnego antygenu. Demonstracja podania antygenu do ucha została przedstawiona w 1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kompletny adiuwant Freunda ’ H37Ra	Odczynnik	Difco Laboratories	231131	Dystrybuowane przez Fisher pod numerem katalogowym DF 311-360-5
Hemocyjanina z Keyhole Limpet	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H-5654
Owalbumina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A-5503
Szklane strzykawki 5 ml	Narzędzie	Fisher Scientific	14-823-10 B	Wymagane dwie strzykawki 5 ml dla każdej partii 5 ml emulsji
Metalny łącznik 18G	Narzędzie	Fisher Scientific	14-825-17L
Szczury rasy Lewis	Zwierzę	Harlan Laboratories		Samice szczurów w wieku 7-9 tygodni
Igły 23G 1"	Narzędzie	Fisher Scientific	14-826 AA	Zaleca się wymianę igieł między szczurami
Strzykawki 3 ml Luer Lock	Narzędzie	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
Strzykawki z końcówką standardową 1 ml	Narzędzie	Fisher Scientific	22-257-154
Igły 27G 1/2"	Narzędzie	Fisher Scientific	14-826-48
Elektryczna bezprzewodowa maszynka do strzyżenia	Narzędzie	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	Do golenia grzbietów szczurów przed podaniem antygenu.
Należy stosować sterylne roztwory, odczynniki i strzykawki. Szklane strzykawki i łączniki 18G można autoklawować. Przed pierwszym użyciem odczynnika należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału i założyć odpowiedni sprzęt ochronny.