Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Streszczenie

Neurony hipokampa i kory mózgu są szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), wzrostu aksonów i dendrytów oraz tworzenia i funkcjonowania synaps. Zaletą hodowli tych neuronów jest to, że ulegają one łatwej polaryzacji, tworząc wyraźne aksony i dendryty na podłożu dwuwymiarowym przy bardzo niskiej gęstości. Właściwość ta sprawiła, że są one niezwykle przydatne do określania wielu aspektów rozwoju neuronów. Ponadto, poprzez zapewnienie tym neuronom kondycjonowania glejowego, będą one nadal się rozwijać, tworząc funkcjonalne połączenia synaptyczne i przeżywając w hodowli przez kilka miesięcy. W niniejszym protokole opisujemy technikę izolacji, hodowli i transfekcji embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Transfekcja jest realizowana poprzez elektroporację DNA do neuronów przed wysiewem za pomocą nukleofekcji. Protokół ten ma tę zaletę, że pozwala na ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie we wczesnej fazie rozwoju (~4-8 h po wysiewie), co umożliwia badanie dynamiki i funkcji białek podczas polaryzacji, wzrostu aksonów i ich rozgałęziania. Odkryliśmy również, że ta jednorazowa transfekcja przed wysiewem utrzymuje ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie na poziomach odpowiednich do obrazowania przez cały okres życia neuronu (> 2 miesiące w hodowli). Zatem metodologia ta jest przydatna do badania lokalizacji i funkcji białek w trakcie rozwoju OUN przy niewielkim lub braku zaburzeń funkcji neuronalnych.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek podstawowych i komór

1. Przygotowanie czystych szkiełek nakrywkowych i komór jest niezbędne dla zdrowych kultur. Na żadnym z tych etapów nie należy stosować dróg na skróty.
2. Myć szkiełka nakrywkowe (okrągłe 12mm lub 22mm, szkło niemieckie - marka Carolina Assistant) przez noc w stężonym kwasie azotowym (HNO3) w dedykowanym słoiku szklanym lub zlewce.
3. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z kwasu azotowego i płukać intensywnie (5-7x) w wodzie dejonizowanej.
4. Rozdzielić szkiełka nakrywkowe i wysuszyć w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po wyschnięciu wysterylizować je światłem UV przez 30 minut. Wysterylizowane szkiełka nakrywkowe umieścić w sterylnych szalkach Petriego do przechowywania. W przypadku wysiewania neuronów bezpośrednio na szkiełkach 12mm, umieścić szkiełka w sterylnej szalce 35mm i przejść do Sekcji 2.
5. Komory do obrazowania konstruuje się poprzez wywiercenie otworu o średnicy 15mm w dnie szalek Petriego 35mm (należy usunąć wszystkie zadziory) i przymocowanie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych za pomocą mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1.
6. Roztopić mieszaninę parafiny i wazeliny w probówce stożkowej w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia. Za pomocą małego pędzla pokryć spód szalki wokół otworu 15mm. Należy stale mieszać mieszaninę parafiny i wazeliny, ponieważ ulega ona rozdzieleniu. Prowadzi to zazwyczaj do sklejenia komór z wyższą koncentracją wazeliny, która staje się lepka po umieszczeniu szalek w inkubatorze, co skutkuje odklejeniem się szkiełka nakrywkowego. Pozostałą mieszaninę parafiny i wazeliny można przechowywać w temperaturze pokojowej.
7. Umieścić szalkę do góry dnem na płaskiej tacy i położyć szkiełko nakrywkowe nad otworem. Podgrzewać w piecu w temperaturze 80°C, aż mieszanina parafiny się roztopi (~10 minut). Wyjąć szalki na płaską powierzchnię i pozostawić mieszaninę parafiny do zastygnięcia.
8. Odwrócić szalki i wysterylizować światłem UV zarówno wnętrza nakrywek, jak i dna komór.
9. Pokryć szkiełka nakrywkowe lub szklane obszary komór roztworem 1.0mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) w buforze boranowym (0.1M boran sodu, pH 8.5) przez jedną godzinę. Płukać 3-5 razy obfitymi ilościami dejonizowanej wody klasy do hodowli tkankowych. Należy upewnić się, że usunięto wszystkie ślady buforu boranowego. Wysuszyć i użyć natychmiast lub przechowywać komory/szkiełka nakrywkowe do późniejszego użycia. Zazwyczaj używamy oczyszczonych szkiełek nakrywkowych w ciągu jednego miesiąca od przygotowania.

2. Przygotowanie pożywki do mikrodysekcji i hodowli neuronów

1. Przygotować medium do sekcji (DM), dodając odpowiednie ilości 10x HBSS oraz 100X HEPES do wody jakości do hodowli tkankowych. Przechowywać w temperaturze 4°C. Podczas sekcji utrzymywać na lodzie.
2. Dzień przed sekcją przygotować medium do wysiewu (PM) oraz medium bezsurowicze (SFM). PM składa się z Neurobasal Medium, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy, 37,5 mM NaCl oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). SFM składa się z Neurobasal Medium, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy oraz 37,5 mM NaCl.
3. Przygotować ilość wystarczającą jedynie na potrzeby sekcji i przechowywać przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych z lekko uchylonym zakrętką, aby temperatura i zawartość CO₂ w medium uległy wyrównaniu. Dodajemy dodatkową glukozę i zwiększamy osmolalność do około 310mOsm za pomocą NaCl. Stwierdziliśmy, że kultury rozwijają się lepiej przy bardziej fizjologicznej osmolalności (osmolalność Neurobasal wynosi zazwyczaj 205-245mOsm).

3. Przygotowanie warstwy pokarmowej komórek glejowych kory do kultur długoterminowych

1. Jeśli planowane jest przygotowanie kultur długoterminowych, należy przeprowadzić tę część protokołu od dwóch do trzech tygodni przed przystąpieniem do wycinków kory mózgowej lub hipokampa.
2. Przygotować pożywkę glejową (GM) składającą się z MEM, 0,3% glukozy, penicyliny/streptomycyny oraz 10% surowicy konia.
3. Uśmiercić myszy w wieku P1-P3 poprzez chłodzenie na lodzie przez 5 minut. Wyjąć każde młode z lodu i spryskać 70% etanolem. Szybko odciąć głowę nożyczkami. Przenieść cały mózg do naczynia zawierającego zimne DM (krok 2.1).
4. Usunąć obie półkule mózgowe oraz opon mózgowo-rdzeniowe. Wyciąć neocortex i przenieść go do nowego naczynia bez pożywki. Przygotować korę z łącznie 4 mózgów.
5. Rozdrobić korę za pomocą czystego, sterylnego ostrza do golenia tak drobno, jak to możliwe, a następnie przenieść posiekaną tkankę plastikową pipetą do probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 12 mL zimnego DM. Dodać trypsynę i DNazę do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% (1,5 mL) i 0,1% (1,5 mL). Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawartość.
6. Wyjąć probówkę z tkanką korową i dokładnie oczyścić 70% etanolem przed wprowadzeniem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetować tkankę korową w górę i w dół pipetą 10 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia większości grudek.
7. Wrócić probówkę do łaźni wodnej w temperaturze 37°C na kolejne 10 minut, okresowo delikatnie mieszając.
8. Dokładnie oczyścić probówkę 70% etanolem i ponownie wprowadzić ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetować tkankę korową w górę i w dół pipetą 5 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia grudek.
9. Dodać 15 mL ciepłej pożywki GM i wirować przy 200xg (1000rpm) przez 10 minut.
10. Odlać nadsącz, resuspendować osad komórkowy w 20 mL świeżej pożywki GM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać 5-7,5x10⁶ komórek w 15 mL GM na kolbę 75cm².
11. Po jednym dniu oraz co kolejne 2-3 dni hodowli, usunąć luźne komórki poprzez uderzanie kolbą o dłoń. Odessać pożywkę wraz z usuniętymi komórkami i zastąpić ją 15 mL świeżej GM.
12. Glej można zebrać po 1-2 tygodniach wzrostu w kolbach, gdy osiągną około 70-100% konfluencji. Aby przygotować pojedyncze szkiełka podstawowe pokryte glejem, umieścić 6 oczyszczonych kwasem azotowym i wysterylizowanych okrągłych szkiełek o średnicy 25mm w naczyniu 10cm; za pomocą małego pędzla nanieść na każde szkiełko 3 kropki mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1 w układzie trójkąta. Naświetlać otwarte naczynia światłem UV przez 30 minut. Pokryć szkiełka 0,1 mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) w buforze boranowym przez jedną godzinę, następnie przemyć obficie (3-5x) sterylną dejonizowaną wodą klasy do hodowli tkankowych i pozostawić do wyschnięcia.
13. Wyjąć kolbę z glejem z inkubatora, odlać pożywkę i wypłukać 5 mL podgrzanej wcześniej roztworu trypsyny/EDTA. Usunąć roztwór trypsyny/EDTA z kolby i nalać do niej 3 mL świeżego, podgrzanego roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować kolbę przez 1 minutę w 37°C przed dodaniem 5 mL GM w celu zatrzymania trypsynizacji.
14. Zebrać glej z kolby poprzez kilkukrotne pipetowanie (10-15 razy), a następnie przenieść pożywkę do probówki stożkowej 15 mL. Wirować przy 200xg (1000rpm) przez 8 minut. Usunąć nadsącz i dodać 10 mL GM, policzyć komórki i wysiać 5x10⁵ komórek w 12,5 mL GM na naczynie 10cm zawierające szkiełka podstawowe.
15. Wymieniać pożywkę na świeżą, podgrzaną GM co 2-3 dni. Dzień przed wycinkiem neuronów usunąć GM i zastąpić ją SFM (sekcja 2.2). Tą kondycjonowaną przez glej pożywkę SFM należy wykorzystać w kroku 4.12 podczas zalewania kultur korowych lub hipokampa.

4. Wycięcie tkanek z kory i/lub hipokampa oraz elektroporacja

1. Odmierzyć odpowiednie ilości roztworów do nukleofekcji (Lonza), połączyć je i ogrzać do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem sekcji. Ponieważ po zmieszaniu roztwór do nukleofekcji ma ograniczony czas trwałości, łączymy tylko ilość niezbędną dla każdej preparacji (100 μL na transfekcję).
2. Uśmiercić ciężarną mysz w dniu E15.5 za pomocą CO₂ (dzień wystąpienia czopu to E0.5) i przenieść macicę do szalki Petriego o średnicy 10 cm. Wyjąć płody i oddzielić głowy, zanurzając je w zimnym medium DM (rozdział 2.1).
3. Wyjąć cały mózg do oddzielnej szalki z zimnym medium DM i za pomocą zgiętej igły wolframowej usunąć obie nowokory. Usunąć opony mózgowe mikro pęsetą i umieścić korę w nowej szalce z zimnym medium DM. Za pomocą małych nożyczek irydowych lub nożyczek Weckera wyciąć korę lub hipokamp i umieścić w probówce Eppendorf 1,5 mL wypełnionej 1,0 mL zimnego medium DM. Probówkę przechowywać w lodzie.
4. Po wysekcjonowaniu wszystkich kory lub hipokampów dodać 110 μL 2,5% trypsyny do probówki Eppendorf zawierającej tkankę i umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 20 minut.
5. Usunąć nadsącz i wypłukać korę lub hipokampy 1,0 mL medium PM (rozdział 2.2), delikatnie odwracając probówkę Eppendorf. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, pozostawiając w probówce 1 mL medium PM.
6. Rozbić grudki tkanki poprzez 15-krotne pipetowanie pipetą P1000, a następnie przenieść nadsącz z komórkami do nowej probówki stożkowej 15 mL zawierającej 4 mL medium PM, pozostawiając wszelkie nieprzepracowane grudki w probówce Eppendorf.
7. Wirować probówkę 15 mL przy 20xg (350rpm) przez 7 minut z wyłączonym hamulcem. Odrzucić nadsącz i dodać 100 μL wymieszanego, w temperaturze pokojowej roztworu do nukleofekcji (Lonza) na każdą transfekcję. Ujednorodnić mieszaninę poprzez 5-krotne, delikatne pipetowanie w górę i w dół pipetą P1000.
8. Przenieść 100 μL mieszaniny roztworu do nukleofekcji i komórek do każdej nowej probówki Eppendorf i dodać odpowiednią ilość DNA. W przypadku kultur długoterminowych zazwyczaj stosujemy 1-2 μg DNA na transfekcję, jednak pozwala to na oznakowanie jedynie niewielkiej (<10%) części neuronów w kulturze. W celu uzyskania wyższej wydajności transfekcji w kulturach krótkoterminowych stosujemy zazwyczaj 5-10 μg DNA na transfekcję. W przypadku transfekcji dwoma różnymi plazmidami stosowaliśmy łącznie do 40 μg DNA. Plazmidy są przechowywane w buforze TE w stężeniu 1 μg/μL.
9. Przenieść zawiesinę komórkową z DNA do kuwety (Lonza) i przeprowadzić elektroporację komórek w nukleofektorze (Lonza), stosując program O-005 (Mouse CNS neurons).
10. Szybko dodać 500 μL uprzednio ogrzanego i zrównoważonego medium PM do kuwety, a następnie przenieść roztwór z komórkami do nowej probówki Eppendorf 1,5 mL. Dodać odpowiednią ilość medium PM, aby objętość każdej transfekcji wyniosła 1,0 mL. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i wysiać w zagęszczeniu 3-5x10³ komórek/cm² dla kultur młodych lub 5-10x10³ komórek/cm² dla kultur długoterminowych.
11. Dla kultur krótkoterminowych, po godzinie od wysiania, wypełnić szalki hodowlane 35 mm 2,0 mL ogrzanego, zrównoważonego z CO₂ medium SFM. W przypadku użycia szkiełek podstawkowych usunąć połowę medium PM i zastąpić je medium SFM, a następnie powtórzyć tę czynność dwukrotnie. Zarówno zalanie komór obrazowania, jak i płukanie szkiełek podstawkowych prowadzi do uzyskania bardzo niskiej zawartości surowicy (<0,5%). Kultury krótkoterminowe nie wymagają hodowli z warstwą pokarmową gleju ani ponownego zasilania.
12. Dla kultur długoterminowych, godzinę po wstępnym wysianiu, wyjmujemy szkiełko podstawkowe pokryte glejem, zawierające trzy kropki parafiny/wazeliny, i odwracamy je nad otworem 15 mm w szalce 35 mm. Następnie do komory obrazowania dodaje się dwa mililitry kondycjonowanego medium SFM z szalki z glejem. Aby zasilać kultury długoterminowe, co 2-3 dni usuwamy jedną trzecią medium SFM i zastępujemy ją świeżym, uprzednio ogrzanym i zrównoważonym z CO₂ medium SFM.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Żywe neurony hipokampa w kolejnych etapach rozwoju. Przedstawiono pary obrazów reprezentatywnych żywych neuronów hipokampa w formie obrazu z kontrastem różnicowego interferencyjnego oraz odpowiadającego mu mikrografu fluorescencyjnego. Każda z tych komórek została transfektowana EGFP-Tubulin i DsRed2 w wektorach pCAX. Neurony obrazowano w następnych dniach in vitro (DIV): Etap 1 (1DIV), Etap 2 (1DIV), Etap 3 (2DIV), Etap 4 (11DIV) oraz Etap 5 (32DIV). Pasek skali wynosi 20μm.

Dyskusja

Niniejszy protokół hodowli embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy został opracowany jako modyfikacja protokołu Bankera, w którym wykorzystywano neurony szczura^1,2. Stosowaliśmy ten protokół również do hodowli neuronów myszy i chomika^3,4,5,6,7. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w przypadku neuronów hipokampa, jak i neuronów nowokory, i jest podobny do protokołu opublikowanego przez Meberga i Millera⁸. Zazwyczaj do hodowli długoterminowych wykorzystujemy neurony hipokampa, ponieważ są one dobrze scharakteryzowane i stanowią bardziej ugruntowany system modelowy. Co więcej, prawdopodobnie zawierają one bardziej jednorodną populację neuronów niż nowokora. Jednakże neurony nowokory hodowane według tego protokołu również przeżywają i różnicują się w podobny sposób (dane nieopublikowane). Rutynowo wykorzystujemy neurony hipokampa i nowokory do hodowli krótkoterminowych. Wypreparowanie nowokory pozwala również na uzyskanie znacznie większej liczby neuronów (1,5x10⁶ neuronów na parę kory) niż w przypadku hipokampa (2,5x10⁵ neuronów na parę hipokampów), co czyni ten materiał lepszym wyborem, na przykład do analizy Western blotting.

Podobnie jak w przypadku każdej hodowli pierwotnej, kluczowe jest zminimalizowanie czasu od śmierci zwierzęcia do wysiania komórek. Zazwyczaj potrzeba od 10 do 20 sekcji, aby osiągnąć stałą biegłość w przeprowadzaniu sekcji i wysiewania. Ponadto, podczas pracy z systemem Lonza Nucleofector, niezwykle ważne jest szybkie działanie podczas procedury elektroporacji, ponieważ żywotność neuronów gwałtownie spada, jeśli pozostaną one w buforze do nukleofekcji.

Większość naszych obrazowań przeprowadzana jest za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Ten rodzaj mikroskopii umożliwia obrazowanie jedynie obszaru o grubości kilkuset nanometrów poza szkiełkiem podstawowym. W związku z tym obszary neuronów, które najczęściej obrazujemy – stożki wzrostu aksonów i kolce dendrytyczne – muszą przylegać bezpośrednio do szkiełka. Stosujemy zatem hodowle o niskiej gęstości, które do długoterminowej hodowli wymagają obecności komórek glejowych jako warstwy odżywczej. W przypadku hodowli długoterminowych wykorzystywaliśmy również hodowle o wyższej gęstości (>2x10⁴ komórek/cm²) bez warstw odżywczych komórek glejowych i stwierdzono, że przeżywają one bardzo dobrze przy minimalnym dokarmianiu. Jednak kolce dendrytyczne tych neuronów często znajdują się zbyt daleko od podłoża, aby można je było obrazować w technice TIRFM, mimo że można je łatwo wykryć za pomocą mikroskopii szerokopolowej lub mikroskopii konfokalnej.

W większości naszych badań przeprowadzamy transfekcję neuronów przed wysianiem, a obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie prowadziliśmy przez okres do trzech miesięcy hodowli. Ta długotrwała ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie daje nam pewność, że stosując niskie stężenia DNA (1-2μg) nie wywołujemy artefaktów związanych z nadekspresją w neuronach. Procedura ta może być jednak wykorzystana również do badania nadekspresji białek, jeśli zastosowane zostaną duże ilości DNA (10-20μg). Plazmidy, których używamy do transfekcji neuronów, zazwyczaj zawierają białka fuzyjne EGFP lub mCherry, choć znakujemy również cytoplazmę neuronów samym DsRed2 lub EGFP. Ta technika elektroporacji działa dobrze z wieloma wektorami. Preferujemy plazmidy zawierające promotor β-aktyny z enhancerem CMV i ogonem poly-A β-globiny (plazmidy pCAGGs lub pCAX)⁹, ze względu na stosunkowo wysokie poziomy ekspresji oraz fakt, że są one dobrze tolerowane przez neurony zarówno w hodowlach krótkoterminowych, jak i długoterminowych. Zazwyczaj białka zaczynają się eksponować w ciągu około 4 godzin od wysiania i osiągają poziomy wystarczające do obrazowania w ciągu 10-24hrs¹⁰. Z powodzeniem stosowaliśmy plazmidy sterowane promotorem CMV w hodowlach krótkoterminowych, jednak stwierdziliśmy, że mogą one powodować wysoką nadekspresję, która prowadzi do śmierci neuronów w hodowli długoterminowej. Niemniej jednak zauważyliśmy, że kondycjonowanie glejowe kultur o niskiej gęstości wspomaga przeżywalność neuronów przetransfekowanych plazmidami sterowanymi promotorem CMV w porównaniu do kultur o większej gęstości (niewspomaganych glejem).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Boran sodu	Fisher Scientific	S93356	Przechowywać bufor boranowy w temperaturze pokojowej (RT).
Poli-d-lizyna	Sigma-Aldrich	P7886-100mg	Rozpuścić w 0.1M buforze boranowym. Przefiltrować sterylnie i przechowywać alikwoty w -80°C.
Trypsyna (10x)	Invitrogen	15090-046	Przechowywać alikwoty w -80°C.
DNaza (10x)	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Przechowywać alikwoty w -80°C.
MEM	Invitrogen	11095-080	Przechowywać w 4°C.
HBSS (10x)	Invitrogen	14185-052	Przechowywać w RT.
HEPES (100x)	Invitrogen	15630-080	Przechowywać w 4°C.
Penicylina/Streptomycyna (100x)	Invitrogen	15140-122	Przechowywać alikwoty w -80°C.
Surowica konia	Hyclone	SH3007403	Przechowywać alikwoty w -80°C.
Trypsyna/EDTA	Invitrogen	25200-056	Przechowywać w 4°C.
Neurobasal E (NB)	Invitrogen	21103-049	Przechowywać w 4°C.
Suplement B27 (50x)	Invitrogen	17504-044	Przechowywać alikwoty w -80°C.
Glutamina (100x)	Invitrogen	25030-081	Przechowywać alikwoty w -80°C
30% glukozy w NB (100X)	Fisher Scientific	BP350-500	Rozpuścić glukozę w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4°C.
3.75M NaCl w NB (100X)	Fisher Scientific	BP358-1	Rozpuścić NaCl w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4°C.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyclone	SH3007003	Przechowywać alikwoty w -80°C.
Parafina/Wazelina (3:1 m/m)	Fisher Scientific	Parafina – P31-500 Wazelina – P66-1	Połączyć w probówce stożkowej i roztopić w wrzącej wodzie.
Stężony kwas azotowy (HNO3)	Fisher Scientific	A509-212	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Można używać wielokrotnie. Wyrzucić w przypadku zażółcenia.
5mM chlorowodorek cytozyna –β-D-arabinofuranosydy (AraC) w NB (1000X)	Sigma-Aldrich	C6645	Rozpuścić AraC w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w -80°C
*Większość odczynników przechowywanych w -80°C można przechowywać również w -20°C. Przechowywanie ich w -80°C wydłuża ich okres trwałości i pozwala uzyskać nieco bardziej spójne kultury.