Artykuł metodologiczny

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

35.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2373

⸱

24 stycznia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Streszczenie

Neurony hipokampa i kory mózgu są szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), wzrostu aksonów i dendrytów oraz tworzenia i funkcjonowania synaps. Zaletą hodowli tych neuronów jest to, że ulegają one łatwej polaryzacji, tworząc wyraźne aksony i dendryty na podłożu dwuwymiarowym przy bardzo niskiej gęstości. Właściwość ta sprawiła, że są one niezwykle przydatne do określania wielu aspektów rozwoju neuronów. Ponadto, poprzez zapewnienie tym neuronom kondycjonowania glejowego, będą one nadal się rozwijać, tworząc funkcjonalne połączenia synaptyczne i przeżywając w hodowli przez kilka miesięcy. W niniejszym protokole opisujemy technikę izolacji, hodowli i transfekcji embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Transfekcja jest realizowana poprzez elektroporację DNA do neuronów przed wysiewem za pomocą nukleofekcji. Protokół ten ma tę zaletę, że pozwala na ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie we wczesnej fazie rozwoju (~4-8 h po wysiewie), co umożliwia badanie dynamiki i funkcji białek podczas polaryzacji, wzrostu aksonów i ich rozgałęziania. Odkryliśmy również, że ta jednorazowa transfekcja przed wysiewem utrzymuje ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie na poziomach odpowiednich do obrazowania przez cały okres życia neuronu (> 2 miesiące w hodowli). Zatem metodologia ta jest przydatna do badania lokalizacji i funkcji białek w trakcie rozwoju OUN przy niewielkim lub braku zaburzeń funkcji neuronalnych.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i komór

  1. Przygotowanie czystych szkiełek nakrywkowych i komór jest niezbędne dla zachowania zdrowych kultur. Na żadnym z tych etapów nie należy stosować dróg na skróty.
  2. Myć szkiełka nakrywkowe (okrągłe 12mm lub 22mm, szkło niemieckie - marka Carolina Assistant) przez noc w stężonym kwasie azotowym (HNO3) w dedykowanym słoiku szklanym lub zlewce.
  3. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z kwasu azotowego i wielokrotnie (5-7x) przepłukać wodą dejonizowaną.
  4. Rozdzielić szkiełka nakrywkowe i wysuszyć w laminarnym dygestorium lub komorze biosafety. Po wysuszeniu sterylizować je światłem UV przez 30 minut. Sterylne szkiełka nakrywkowe umieścić w sterylnych szalkach Petriego do przechowywania. W przypadku wysiewania neuronów bezpośrednio na szkiełka 12mm, umieścić szkiełka w sterylnej szalce 35mm i przejść do Sekcji 2.
  5. Komory obrazujące konstruuje się poprzez wywiercenie otworu o średnicy 15mm w dnie szalek Petriego 35mm (należy usunąć wszystkie zadziory) i przytwierdzenie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych za pomocą mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1.
  6. Roztopić mieszaninę parafiny i wazeliny w probówce stożkowej w łaźni wodnej. Za pomocą małego pędzla pokryć spód szalki wokół otworu 15mm. Należy pamiętać o ciągłym mieszaniu parafiny i wazeliny, ponieważ ulegają one rozwarstwieniu. Zazwyczaj prowadzi to do sklejenia komór z wyższą koncentracją wazeliny, która staje się lepka po umieszczeniu szalek w inkubatorze, co skutkuje odklejeniem szkiełka nakrywkowego. Pozostałą mieszaninę parafiny i wazeliny można przechowywać w temperaturze pokojowej.
  7. Umieścić szalkę dnem do góry na płaskiej tacy i położyć szkiełko nakrywkowe nad otworem. Podgrzewać w piekarniku w temperaturze 80°C, aż mieszanina parafiny się roztopi (~10 minut). Wyjąć szalki na płaską powierzchnię i pozwolić mieszaninie parafiny zastygnąć.
  8. Odwrócić szalki i wysterylizować światłem UV zarówno wnętrza nakrywek, jak i dna komór.
  9. Pokryć szkiełka nakrywkowe lub szklane obszary komór roztworem 1.0mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) w buforze boranowym (0.1M boran sodu, pH 8.5) przez jedną godzinę. Przepłukać 3-5 razy obfitą ilością wody dejonizowanej klasy do hodowli tkankowych. Należy upewnić się, że usunięto wszystkie ślady buforu boranowego. Wysuszyć i użyć natychmiast lub przechowywać komory/szkiełka do późniejszego użycia. Zwykle używamy oczyszczonych szkiełek nakrywkowych w ciągu jednego miesiąca od przygotowania.

2. Przygotowanie medium do dyssekcji i hodowli neuronów

  1. Przygotować medium do sekcji (DM), dodając odpowiednie ilości 10x HBSS oraz 100X HEPES do wody jakości do hodowli tkankowych. Przechowywać w temperaturze 4°C. Podczas sekcji utrzymywać medium w lodzie.
  2. Dzień przed sekcją przygotować medium do wysiewu (PM) oraz medium bezsurowicze (SFM). PM składa się z medium Neurobasal, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy, 37,5 mM NaCl i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). SFM składa się z medium Neurobasal, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy i 37,5 mM NaCl.
  3. Przygotować jedynie ilość niezbędną do przeprowadzenia sekcji i przechowywać przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych z lekko uchylonym korkiem, aby temperatura i zawartość CO2 w medium uległy wyrównaniu. Dodajemy dodatkową glukozę i zwiększamy osmolalność do około 310mOsm za pomocą NaCl. Zaobserwowaliśmy, że kultury rozwijają się lepiej przy bardziej fizjologicznej osmolalności (osmolalność medium Neurobasal wynosi zazwyczaj 205-245mOsm).

3. Przygotowanie warstwy wspomagającej z gleju korowego do kultur długoterminowych

  1. W przypadku przygotowania kultur długoterminowych należy przeprowadzić tę część protokołu od dwóch do trzech tygodni przed przystąpieniem do wycinania kory mózgu lub hipokampa.
  2. Przygotować medium glejowe (GM) składające się z MEM, 0,3% glukozy, penicyliny/streptomycyny oraz 10% surowicy konia.
  3. Uśmiercić myszy w wieku P1-P3 poprzez chłodzenie na lodzie przez 5 minut. Wyjąć każdą mysz z lodu i spryskać 70% etanolem. Szybko odciąć głowę za pomocą nożyczek. Przenieść cały mózg do naczynia zawierającego zimne DM (krok 2.1).
  4. Usunąć obie półkule mózgowia oraz opony mózgowe. Wyciąć neocortex i przenieść go do nowego naczynia bez pożywki. Przygotować korę z łącznie 4 mózgów.
  5. Rozdrobnić korę za pomocą czystego, sterylnego ostrza do golenia tak drobno, jak to możliwe, a następnie przenieść poszatkowaną tkankę plastikową pipetą do probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 12 mL zimnego DM. Dodać trypsynę i DNazę do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% (1,5 mL) i 0,1% (1,5 mL). Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawartość.
  6. Wyjąć probówkę z tkanką korową i dokładnie oczyścić 70% etanolem przed wprowadzeniem do komory z laminarem. Pipetować tkankę korową w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia większości grudek.
  7. Ponownie umieścić probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37°C na kolejne 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawartość.
  8. Dokładnie oczyścić probówkę 70% etanolem i ponownie wprowadzić ją do komory z laminarem. Pipetować tkankę korową w górę i w dół za pomocą pipety 5 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia grudek.
  9. Dodać 15 mL ciepłego GM i wirować przy 200xg (1000rpm) przez 10 minut.
  10. Odlać nadsącz, zawiesić osad komórkowy w 20 mL świeżego GM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać 5-7,5x106 komórek w 15 mL GM na kolbę o powierzchni 75cm2.
  11. Po jednym dniu oraz co kolejne 2-3 dni hodowli usunąć luźne komórki, uderzając kolbą o dłoń. Odlać pożywkę wraz z usuniętymi komórkami i zastąpić ją 15 mL świeżego GM.
  12. Glej można zebrać po 1-2 tygodniach wzrostu w kolbach, gdy osiągną konfluencję na poziomie około 70-100%. Aby przygotować pojedyncze szkiełka podstawowe pokryte glejem, umieścić 6 oczyszczonych kwasem azotowym i wysterylizowanych okrągłych szkiełek 25mm w naczyniu 10cm i za pomocą małego pędzelka nanieść na każde szkiełko 3 kropki mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1 w układzie trójkąta. Naświetlać otwarte naczynia światłem UV przez 30 minut. Pokryć szkiełka roztworem 0,1 mg/mL poli-D-lizyny (30kDa) w buforze boranowym przez jedną godzinę, a następnie przemyć dokładnie (3-5x) sterylną dejonizowaną wodą klasy do hodowli tkankowych i pozostawić do wyschnięcia.
  13. Wyjąć z inkubatora kolbę z glejem, odlać pożywkę i wypłukać 5 mL uprzednio ogrzanego roztworu trypsyny/EDTA. Usunąć roztwór trypsyny/EDTA z kolby i pipetować do niej 3 mL świeżego, uprzednio ogrzanego roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować kolbę przez 1 minutę w 37°C, a następnie dodać 5 mL GM, aby zatrzymać proces trypsynizacji.
  14. Zebrać glej z kolby poprzez wielokrotne pipetowanie (10-15 razy), a następnie przenieść zawiesinę do probówki stożkowej 15 mL. Wirować przy 200xg (1000rpm) przez 8 minut. Usunąć nadsącz i dodać 10 mL GM, policzyć komórki i wysiać 5x105 komórek w 12,5 mL GM na naczynie 10cm zawierające szkiełka podstawowe.
  15. Wymieniać pożywkę na świeże, uprzednio ogrzane GM co 2-3 dni. Dzień przed wycinaniem neuronów usunąć GM i zastąpić go SFM (sekcja 2.2). Użyć tego SFM kondycjonowanego przez glej w kroku 4.12 podczas zalewania kultur korowych lub hipokampalnych.

4. Wycinanie i elektroporacja kory i/lub hipokampa

  1. Odmierz odpowiednie ilości roztworów do nukleofekcji (Lonza), połącz je i ogrzej do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem sekcji. Ponieważ roztwór do nukleofekcji ma ograniczoną trwałość po zmieszaniu, łączymy tylko ilość niezbędną dla każdego przygotowania (100 μL na transfekcję).
  2. Uśmierć ciężarną mysz w dniu E15.5 za pomocą CO2 (dzień wystąpienia czopu to E0.5) i przenieś macicę do szalki Petriego o średnicy 10 cm. Wyjmij płody i dokonaj dekapitacji w zimnym DM (sekcja 2.1).
  3. Przenieś cały mózg do osobnej szalki z zimnym DM i za pomocą zgiętej igły wolframowej wyjmij obie nowokory. Usuń oponami mózgowe za pomocą mikropincety i umieść korę w nowej szalce z zimnym DM. Za pomocą małych nożyczek irydowych lub Weckera wytnij korę lub hipokamp i umieść w probówce Eppendorf 1,5 mL wypełnionej 1,0 mL zimnego DM. Przechowuj probówkę w lodzie.
  4. Po wycięciu wszystkich kory lub hipokampów dodaj 110 μL 2,5% trypsyny do probówki Eppendorf zawierającej tkankę i umieść probówkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 20 minut.
  5. Odsącz nadsącz i wypłucz korę lub hipokampy 1,0 mL PM (sekcja 2.2), delikatnie odwracając probówkę Eppendorf. Powtórz płukanie dwukrotnie, pozostawiając w probówce 1 mL PM.
  6. Rozbij grudki tkanki poprzez 15-krotne pipetowanie pipetą P1000, a następnie przenieś nadsącz z komórkami do nowej probówki stożkowej 15 mL zawierającej 4 mL PM, pozostawiając w probówce Eppendorf wszelkie nie rozbite grudki.
  7. Wiruj probówkę 15 mL przy 20xg (350rpm) przez 7 minut z wyłączonym hamulcem. Odlej nadsącz i dodaj 100 μL wymieszanego roztworu do nukleofekcji (Lonza) w temperaturze pokojowej na każdą transfekcję. Rozprowadź roztwór poprzez 5-krotne delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety P1000.
  8. Przenieś 100 μL mieszaniny roztworu do nukleofekcji z komórkami do każdej nowej probówki Eppendorf i dodaj odpowiednią ilość DNA. Dla kultur długoterminowych stosujemy zazwyczaj 1-2 μg DNA na transfekcję. Jednak w ten sposób znakowana jest tylko niewielka proporcja neuronów w kulturze (<10%). W przypadku kultur krótkoterminowych, jeśli wymagana jest wyższa wydajność transfekcji, stosujemy zazwyczaj 5-10 μg DNA na transfekcję. W przypadku transfekcji dwoma różnymi plazmidami stosowaliśmy łącznie do 40 μg DNA. Plazmidy są przechowywane w buforze TE w stężeniu 1 μg/μL.
  9. Przenieś zawiesinę komórek z DNA do kuwety (Lonza) i przeprowadź elektroporację komórek w nukleofektorze (Lonza), stosując program O-005 (neurony OUN myszy).
  10. Szybko dodaj 500 μL uprzednio ogrzanego i zrównoważonego PM do kuwety, a następnie przenieś roztwór z komórkami do nowej probówki Eppendorf 1,5 mL. Dodaj odpowiednią ilość PM, aby objętość każdej transfekcji wyniosła 1,0 mL. Policz komórki za pomocą hemocytometru i wysiej w zagęszczeniu 3-5x103 komórek/cm2 dla kultur młodych lub 5-10x103 komórek/cm2 dla kultur długoterminowych.
  11. W przypadku kultur krótkoterminowych, po godzinie od wysiania, wypełnij szalki hodowlane 35 mm 2,0 mL ogrzanego i zrównoważonego z CO2 SFM. Jeśli używa się szkiełek podstawowych, usuwamy połowę PM i zastępujemy ją SFM, a następnie powtarzamy tę czynność jeszcze dwukrotnie. Zarówno zalewanie komór obrazowych, jak i płukanie szkiełek podstawowych skutkuje bardzo niską zawartością surowicy (<0,5%). Kultury krótkoterminowe nie wymagają hodowli z warstwą wspierającą z glejem ani ponownego zasilania pożywką.
  12. W przypadku kultur długoterminowych, godzinę po wstępnym wysianiu, wyjmujemy szkiełko podstawowe pokryte glejem, zawierające trzy kropki parafiny/wazeliny, i odwracamy je nad otworem 15 mm w szalce 35 mm. Następnie do komory obrazowej dodaje się dwa mililitry kondycjonowanego SFM z naczynia z glejem. Aby zasilać kultury długoterminowe, co 2-3 dni usuwamy jedną trzecią SFM i zastępujemy ją świeżym, uprzednio ogrzanym i zrównoważonym z CO2 SFM.

5. Reprezentatywne wyniki:

figure-protocol-1
Rysunek 1. Żywe neurony hipokampa w kolejnych stadiach rozwoju. Przedstawiono pary reprezentatywnych obrazów żywych neuronów hipokampa w formie obrazu z kontrastem interferencyjnym oraz odpowiadającego mu mikrozdjęcia fluorescencyjnego. Każda z tych komórek została przetransfekowana EGFP-Tubulin i DsRed2 w wektorach pCAX. Obrazowanie neuronów przeprowadzono w następnych dniach in vitro (DIV): Stadium 1 (1DIV), Stadium 2 (1DIV), Stadium 3 (2DIV), Stadium 4 (11DIV) oraz Stadium 5 (32DIV). Pasek skali wynosi 20μm.

Dyskusja

Niniejszy protokół hodowli embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy został opracowany jako modyfikacja protokołu Bankera, w którym wykorzystywano neurony szczura1,2. Stosowaliśmy ten protokół również do hodowli neuronów myszy i chomika3,4,5,6,7. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w przypadku neuronów hipokampa, jak i neuronów nowokory, i jest podobny do protokołu opublikowanego przez Meberga i Millera8. Zazwyczaj do hodowli długoterminowych wykorzystujemy neurony hipokampa, ponieważ są one dobrze scharakteryzowane i stanowią bardziej ugruntowany system modelowy. Co więcej, prawdopodobnie zawierają one bardziej jednorodną populację neuronów niż nowokora. Jednakże neurony nowokory hodowane według tego protokołu również przeżywają i różnicują się w podobny sposób (dane nieopublikowane). Rutynowo wykorzystujemy neurony hipokampa i nowokory do hodowli krótkoterminowych. Wypreparowanie nowokory pozwala również na uzyskanie znacznie większej liczby neuronów (1,5x106 neuronów na parę kory) niż w przypadku hipokampa (2,5x105 neuronów na parę hipokampów), co czyni ten materiał lepszym wyborem, na przykład do analizy Western blotting.

Podobnie jak w przypadku każdej hodowli pierwotnej, kluczowe jest zminimalizowanie czasu od śmierci zwierzęcia do wysiania komórek. Zazwyczaj potrzeba od 10 do 20 sekcji, aby osiągnąć stałą biegłość w przeprowadzaniu sekcji i wysiewania. Ponadto, podczas pracy z systemem Lonza Nucleofector, niezwykle ważne jest szybkie działanie podczas procedury elektroporacji, ponieważ żywotność neuronów gwałtownie spada, jeśli pozostaną one w buforze do nukleofekcji.

Większość naszych obrazowań przeprowadzana jest za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Ten rodzaj mikroskopii umożliwia obrazowanie jedynie obszaru o grubości kilkuset nanometrów poza szkiełkiem podstawowym. W związku z tym obszary neuronów, które najczęściej obrazujemy – stożki wzrostu aksonów i kolce dendrytyczne – muszą przylegać bezpośrednio do szkiełka. Stosujemy zatem hodowle o niskiej gęstości, które do długoterminowej hodowli wymagają obecności komórek glejowych jako warstwy odżywczej. W przypadku hodowli długoterminowych wykorzystywaliśmy również hodowle o wyższej gęstości (>2x104 komórek/cm2) bez warstw odżywczych komórek glejowych i stwierdzono, że przeżywają one bardzo dobrze przy minimalnym dokarmianiu. Jednak kolce dendrytyczne tych neuronów często znajdują się zbyt daleko od podłoża, aby można je było obrazować w technice TIRFM, mimo że można je łatwo wykryć za pomocą mikroskopii szerokopolowej lub mikroskopii konfokalnej.

W większości naszych badań przeprowadzamy transfekcję neuronów przed wysianiem, a obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie prowadziliśmy przez okres do trzech miesięcy hodowli. Ta długotrwała ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie daje nam pewność, że stosując niskie stężenia DNA (1-2μg) nie wywołujemy artefaktów związanych z nadekspresją w neuronach. Procedura ta może być jednak wykorzystana również do badania nadekspresji białek, jeśli zastosowane zostaną duże ilości DNA (10-20μg). Plazmidy, których używamy do transfekcji neuronów, zazwyczaj zawierają białka fuzyjne EGFP lub mCherry, choć znakujemy również cytoplazmę neuronów samym DsRed2 lub EGFP. Ta technika elektroporacji działa dobrze z wieloma wektorami. Preferujemy plazmidy zawierające promotor β-aktyny z enhancerem CMV i ogonem poly-A β-globiny (plazmidy pCAGGs lub pCAX)9, ze względu na stosunkowo wysokie poziomy ekspresji oraz fakt, że są one dobrze tolerowane przez neurony zarówno w hodowlach krótkoterminowych, jak i długoterminowych. Zazwyczaj białka zaczynają się eksponować w ciągu około 4 godzin od wysiania i osiągają poziomy wystarczające do obrazowania w ciągu 10-24hrs10. Z powodzeniem stosowaliśmy plazmidy sterowane promotorem CMV w hodowlach krótkoterminowych, jednak stwierdziliśmy, że mogą one powodować wysoką nadekspresję, która prowadzi do śmierci neuronów w hodowli długoterminowej. Niemniej jednak zauważyliśmy, że kondycjonowanie glejowe kultur o niskiej gęstości wspomaga przeżywalność neuronów przetransfekowanych plazmidami sterowanymi promotorem CMV w porównaniu do kultur o większej gęstości (niewspomaganych glejem).

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Wisconsin i były zgodne z wytycznymi NIH. Dziękujemy dr Katherine Kalil za udostępnienie urządzenia Nucleofector. Dziękujemy również członkom laboratorium Dent za uwagi do protokołu. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-NS064014, Dana Foundation oraz Whitehall Foundation przyznane E.W.D.

Christopher Viesselmann, Jason Ballweg i Derek Lumbard wnieśli równy wkład w przygotowanie tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Boran soduFisher ScientificS93356Przechowywać bufor boranowy w temperaturze pokojowej (RT).
Poli-d-lizynaSigma-AldrichP7886-100mgRozpuścić w 0.1M buforze boranowym. Przefiltrować sterylnie i przechowywać alikwoty w -80°C.
Trypsyna (10x)Invitrogen15090-046Przechowywać alikwoty w -80°C.
DNaza (10x)Sigma-AldrichDN25-1GPrzechowywać alikwoty w -80°C.
MEMInvitrogen11095-080Przechowywać w 4°C.
HBSS (10x)Invitrogen14185-052Przechowywać w RT.
HEPES (100x)Invitrogen15630-080Przechowywać w 4°C.
Penicylina/Streptomycyna (100x)Invitrogen15140-122Przechowywać alikwoty w -80°C.
Surowica koniaHycloneSH3007403Przechowywać alikwoty w -80°C.
Trypsyna/EDTAInvitrogen25200-056Przechowywać w 4°C.
Neurobasal E (NB)Invitrogen21103-049Przechowywać w 4°C.
Suplement B27 (50x)Invitrogen17504-044Przechowywać alikwoty w -80°C.
Glutamina (100x)Invitrogen25030-081Przechowywać alikwoty w -80°C
30% glukozy w NB (100X)Fisher ScientificBP350-500Rozpuścić glukozę w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4°C.
3.75M NaCl w NB (100X)Fisher ScientificBP358-1Rozpuścić NaCl w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4°C.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HycloneSH3007003Przechowywać alikwoty w -80°C.
Parafina/Wazelina (3:1 m/m)Fisher ScientificParafina – P31-500 Wazelina – P66-1Połączyć w probówce stożkowej i roztopić w wrzącej wodzie.
Stężony kwas azotowy (HNO3)Fisher ScientificA509-212Przechowywać w temperaturze pokojowej. Można używać wielokrotnie. Wyrzucić w przypadku zażółcenia.
5mM chlorowodorek cytozyna –β-D-arabinofuranosydy (AraC) w NB (1000X)Sigma-AldrichC6645Rozpuścić AraC w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w -80°C

*Większość odczynników przechowywanych w -80°C można przechowywać również w -20°C. Przechowywanie ich w -80°C wydłuża ich okres trwałości i pozwala uzyskać nieco bardziej spójne kultury.

Bibliografia

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. Culturing Nerve Cells. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  4. Dent, E. W., Kalil, K. Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton. Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).
  5. Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).
  6. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).
  7. Lebrand, C. Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1. Neuron. 42, 37-49 (2004).
  8. Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).
  9. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  10. Zeitelhofer, M. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony embrionalne myszyneurony hipokampalnepolaryzacja neuronalnawzrost akson w i dendryt wwarstwa od ywcza glejowafluorescencyjne bia ka fuzyjneobrazowanie ywych kom rek

Powiązane artykuły