W niniejszym materiale opisujemy wydajną strategię usuwania gruczołów jedwabniczych z odwłoka samic czarnej wdowy. Procedura ta umożliwia szybką izolację siedmiu odrębnych gruczołów jedwabniczych w sposób wysoce oczyszczony, co stanowi istotny proces dla badaczy zajmujących się produkcją jedwabiu pająków oraz montażem włókien.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Współczesne pająki przędą wysokowydajne włókna jedwabiu o szerokim zakresie funkcji biologicznych, w tym służące do poruszania się, chwytania ofiar oraz ochrony rozwijającego się potomstwa 1,2. Pająki realizują te zadania poprzez przędzenie kilku odrębnych typów włókien o zróżnicowanych właściwościach mechanicznych. Taka specjalizacja typów włókien wynika z ewolucji różnych gruczołów jedwabnych, które funkcjonują jako niewielkie biofabryki. Biofabryki te wytwarzają i magazynują duże ilości białek jedwabiu niezbędnych do produkcji włókien. Poprzez złożoną serię zdarzeń biochemicznych białka jedwabiu te są przekształcane z postaci ciekłej w materiał stały podczas ekstruzji.
Badania mechaniczne wykazały, że pajęcza sieć jest wytrzymalsza niż stal wysokowytrzymała 3. Analizy mające na celu zrozumienie zależności między strukturą a funkcją nici pajęczej ujawniły, że składa się ona głównie z białek, czyli fibroin, które posiadają powtórzenia blokowe w swoich sekwencjach białkowych 4. Wspólne sygnatury molekularne, które przyczyniają się do niesamowitej wytrzymałości na rozciąganie i rozciągliwości pajęczej sieci, są odkrywane poprzez analizy przetłumaczonych cDNA jedwabiu. Biorąc pod uwagę niezwykłe właściwości materiałowe pajęczej sieci, laboratoria badawcze na całym świecie ścigają się, aby zrozumieć i naśladować proces przędzenia w celu produkcji syntetycznych włókien jedwabnych do zastosowań komercyjnych, wojskowych i przemysłowych. Jednym z głównych wyzwań w przędzeniu sztucznego jedwabiu pajęczego w laboratorium badawczym jest pełne zrozumienie procesów biochemicznych zachodzących podczas ekstruzji włókien z gruczołów produkujących jedwab.
Przedstawiamy tutaj metodę izolacji siedmiu różnych gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowy czarnej, obejmującą gruczoły ampulary główne i pomocnicze [produkują jedwab linii ciągu i rusztowania] 5,6, tubulary [syntetyzują jedwab kokonu jaj] 7,8, flagelary [funkcja nieznana u pająków sieciowych], agregatowe [produkują jedwab klejący], aciniformy [syntetyzują nici do owijania ofiar i kokonu jaj] 9 oraz piriformy [produkują jedwab dysków mocujących] 10. Podejście to opiera się na znieczuleniu pająka dwutlenkiem węgla, następującym oddzieleniu cephalothorax od odwłoka oraz mikrodysekcji odwłoka w celu uzyskania gruczołów produkujących jedwab. Po wyizolowaniu poszczególnych gruczołów produkujących jedwab, tkanki te mogą zostać wykorzystane do pozyskania różnych makrocząsteczek do odrębnych analiz biochemicznych, w tym ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, northern- i western blottingu, analiz spektrometrii mas (MS lub MS/MS) w celu identyfikacji nowych sekwencji białek jedwabiu, poszukiwania białek uczestniczących w szlaku montażu jedwabiu lub wykorzystania nienaruszonej tkanki do hodowli komórkowych bądź eksperymentów histologicznych.
Protokół
1. Znieczulenie pająka i izolacja odwłoka
- Przenieś pająka ze szklanego słoika do kartonowego pudełka wyłożonego plastikiem (Rycina 1A). Zazwyczaj zbieramy pająki ze stosów drewna, garaży lub krzewów i trzymamy je w laboratorium w szklanych słoikach. Ponieważ pająk nie może wspiąć się po plastikowej wyściółce, stanowi to skuteczną metodę przeniesienia pająka ze szklanego słoika lub puszki po kawie do mniejszej probówki w celu znieczulenia. Podczas manipulowania pająkiem na tym etapie, ze względów bezpieczeństwa należy nosić dwie pary rękawiczek lateksowych lub rękawice ogrodowe.
- Gdy pająk znajduje się w pudełku wyłożonym plastikiem, podejdź do niego od tyłu i pozwól mu wślizgnąć się do plastikowej probówki hodowlanej. Po wejściu pająka do probówki natychmiast zamknij ją korkiem (Rycina 1B). Zalecamy użycie probówki o wymiarach około 101,6 mm x 31,75 mm (D x śr). Minimalizuje to ilość gazowego dwutlenku węgla potrzebną do etapu znieczulania.
- Znieczul pająka, wprowadzając gazowy dwutlenek węgla pod ciśnieniem 5-10 pounds per square inch przez 10 min (Rycina 1C). Taka ilość gazu uśpi pająka tylko na około 5 min, dlatego po znieczuleniu należy niezwłocznie przejść do kroków 1.4-1.5.
- Umieść znieczulonego pająka w małej szalce sekcyjnej i za pomocą pęsety ustaw go grzbietem do góry (czerwona klepsydra skierowana w dół).
- Odciśnij szypułkę (wąski łącznik między cefalotoraksem a odwłokiem), aby oddzielić odwłok od reszty ciała pająka (Rycina 1D). Przechowuj cefalotoraks w zamrażarce przez noc w szalce Petriego i wyrzuć go następnego dnia po zamrożeniu. Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia cefalotoraksu, ponieważ na tym segmencie znajdują się kły pająka.
- Przymocuj odwłok do materiału Sylgard w małej szalce sekcyjnej za pomocą jednej szpilki entomologicznej. Wbij szpilkę w otwór powstały po odcięciu szypułki (Rycina 1E). Miejsce to można łatwo zidentyfikować jako punkt, z którego wypływa płyn po przecięciu szypułki. Upewnij się, że prząślnice (przeciwny koniec szypułki) są skierowane w dół (najbliżej Ciebie).
2. Usunięcie egzoszkieletu
- Wykonać pierwsze nacięcie przez egzoszkielet za pomocą mikronożyczek, zaczynając od otworu powstałego po odcięciu pedycelu. Ciąć bocznie, aż do osiągnięcia strony grzbietowej po obu stronach (Rysunek 1F). Używając pęsety, odsunąć przedni segment egzoszkieletu i w tym miejscu wbić drugą szpilkę. Po wbiciu drugiej szpilki obrócić kuwetę do sekcji w kierunku ogonowym (pod kątem 90°) względem początkowych nacięć bocznych i kontynuować cięcie, aż do osiągnięcia prządek (Rysunek 1G). Nacięcie to będzie prostopadłe lub pionowe w stosunku do początkowego cięcia bocznego. Podczas wykonywania pionowego nacięcia nie należy przeciąć prządek (znajdują się one tylnie względem kształtu klepsydry i mają okrągły wygląd). Nie wbicie drugiej szpilki spowoduje obracanie się odwłoka podczas wykonywania nacięć pionowych.
- Zanurzyć odwłok w roztworze buforu do sekcji (0.1 M NaCl, 0.015 M cytrynian sodu, 0.1% pirowęglanu diethylu).
- Odsunąć pozostałą część egzoszkieletu, zaczynając od początkowego nacięcia bocznego. Po zakończeniu tej czynności tkanka tłuszczowa powinna być wyraźnie widoczna (Rysunek 1H).
3. Izolacja gruczołów jedwabniczych
- Za pomocą pęsety rozpocząć delikatne oddzielanie warstwy tłuszczu (Rycina 1H). Tłuszcz będzie miał barwę od białej do żółtawej. Kontynuować czynność, aż większość tłuszczu zostanie usunięta, a gruczoły jedwabnicze staną się wyraźnie widoczne. Gruczoł rurkowaty (tubuliform) składa się z trzech par bardzo długich, cylindrycznych rurek, które są liczne w jamie brzusznej. Gruczoł główny ampullarny (major ampullate), występujący w parach, jest dużą, półksiężycowatą ampułką z długim, skręconym ogonem dystalnym i przewodem proksymalnym, który zwęża się w miarę zbliżania się do przządek pająka. Gruczoł poboczny ampullarny (minor ampullate) jest bardzo podobny morfologicznie do gruczołu głównego ampularnego, lecz jest znacznie mniejszy. Gruczoł biczowaty (flagelliform), również występujący w parach, jest okrągły i wieloklapowy z małym, cylindrycznym, zygzakowatym przewodem, który biegnie w dół w kierunku przządek. Gruczoł zbiorczy (aggregate), występujący w parach, jest bardzo dużym, wieloklapowym gruczołem z bardzo dużym przewodem wydzielniczym, który posiada duże, nieregularne klapy. Gruczoły pęcherzykowe (aciniform) występują w dużych liczbach i przypominają krótkie, małe wypustki przypominające palce. Gruczoł gruszkowaty (pyriform) jest najmniejszym gruczołem w odwłoku i posiada wiele zbitych, cylindrycznych przewodów przypominających wachlarz z wieloma małymi przewodami wydzielniczymi, które biegną w dół do przządek.
- Zalecamy usuwanie gruczołów w następującej kolejności: rurkowatych, głównych ampularnych, biczowatych, pobocznych ampularnych, zbiorczych, pęcherzykowych, a na końcu gruszkowatych (Rycina 2A-B).
- Zaczynając od gruczołów rurkowatych, delikatnie oddzielić je od pozostałych gruczołów – powinny one znajdować się na wierzchu innych gruczołów (Rycina 2A). U jednego pająka znajduje się trzy pary gruczołów rurkowatych. Pozostawić je w stanie swobodnego unoszenia, ale tak, aby pozostały przytwierdzone do przządek za pomocą przewodów.
- Następnie oddzielić gruczoły główne ampularne. U jednego pająka znajdują się dwa gruczoły główne ampularne. Podczas procedury usuwania należy upewnić się, że przewody pozostają przytwierdzone do gruczołów (Rycina 2A).
- Kontynuować oddzielanie pozostałych gruczołów od siebie, pracując ostrożnie, aby uniknąć przebicia któregokolwiek z gruczołów, zwłaszcza gruczołów zbiorczych i biczowatych. Każdy gruczoł powinien swobodnie unosić się aż do punktu wyjścia w egzoszkielecie prowadzącego do przządek. Gruczoły te również występują w parach. Usunąć każdy gruczoł, ściskając przewód pęsetą i ostrożnie pociągając, aż oddzieli się on od punktu wyjścia. Gruczoły główne ampularne, biczowate, poboczne ampularne i zbiorcze występują w parach. Gruczoły pęcherzykowe i gruszkowate występują w znacznie większej liczbie par.
- Usunąć każdy gruczoł, ściskając przewód pęsetą i ostrożnie pociągając, aż oddzieli się on od punktu wyjścia przy przządce. Zazwyczaj przechowujemy gruczoły w stanie wilgotnym, jednak nie dodajemy dodatkowego buforu.
- W miarę usuwania gruczołów umieszczać je w sterylnych, wcześniej oznakowanych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml. Pojedyncze gruczoły przedstawiono na Rycinie 3A-G. Przechowywać gruczoły na lodzie, a następnie szybko zamrozić je w ciekłym azocie. Po szybkim mrożeniu w ciekłym azocie umieścić je w temperaturze -80°C do przechowywania.
4. Reprezentatywne wyniki
Podczas usuwania poszczególnych gruczołów należy zachować szczególną ostrożność w obchodzeniu się z gruczołami flagelliform i aggregate, ponieważ dwie te struktury mogą zostać łatwo przebite i uszkodzone pęsetą. Ponadto warto zauważyć, że pod względem morfologicznym gruczoły flagelliform i aggregate wyglądają bardzo podobnie przed ich usunięciem i często są ze sobą splecione. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu tych tkanek podczas usuwania, preparator powinien ostrożnie je od siebie oddzielić. Dodatkowo, po wstępnym odsłonięciu gruczołów produkujących jedwab, najtrudniej będzie natychmiast zlokalizować gruczoły aciniform i pyriform ze względu na ich mniejszy rozmiar i położenie anatomiczne. Często obecna jest duża liczba jaj. Co więcej, dodatkową ostrożność należy zachować przy usuwaniu gruczołu pyriform, ponieważ tkanka ta jest niezwykle lepka i często przykleja się do pęsety. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, możliwe jest uzyskanie wszystkich siedmiu gruczołów produkujących jedwab od jednego pająka w sposób wysokiego stopnia oczyszczenia. Zazwyczaj z sekcji jednego pająka można odzyskać mikrogramowe ilości całkowitego RNA i białka. Przedstawiono przykład wykorzystania całkowitego RNA do qPCR w celu zbadania poziomów mRNA genu fibroiny ograniczonego do gruczołów tubuliform, TuSp1 (Rycina 4). Przedstawiono również reprezentatywne eksperymenty z wykorzystaniem lizatów białkowych pobranych z gruczołów, np. trawienie trypsyną w roztworze z następującą po nim analizą MS (może być również stosowane do analizy MS/MS) lub analizę składu aminokwasowego (odpowiednio Rycina 5-6).
Rycina 1. Obsługa, znieczulanie i usuwanie egzoszkieletu z odwłoka samicy czarnej wdowy. A) Przenoszenie pająka do kartonowego pudełka wyłożonego folią plastikową w celu ułatwienia przesunięcia pająka do mniejszej plastikowej fiolki. B) Pająk umieszczony w plastikowej fiolce z korkiem. C) Znieczulanie pająka gazowym dwutlenkiem węgla. D) Oddzielenie cephalothorax od odwłoka za pomocą mikronozyczek. E) Unieruchomienie odwłoka w kuwecie sekcyjnej za pomocą szpilek entomologicznych. F) Widok po wykonaniu bocznego nacięcia nożyczkami i odchyleniu części egzoszkieletu pęsetą. G) Wykonywanie nacięć prostopadle do początkowego cięcia bocznego. H) Usunięcie egzoszkieletu i odsłonięcie warstwy tłuszczowej.
Rysunek 2. Wizualizacja siedmiu różnych gruczołów produkujących jedwab w nienaruszonym stanie w odwłoku pająka oraz otaczających je tkanek. A) Obrazy tkanek tubuliform, głównych ampullate, flagelliform i aggregate przy powiększeniu 12X. B) Obraz gruczołów aciniform i pyriform przy powiększeniu 12X.
Rysunek 3. Fotografie siedmiu gruczołów produkujących jedwab po ich usunięciu z odwłoka. Wszystkie obrazy zostały wykonane przy powiększeniu 20X z wyjątkiem gruczołów aciniform i pyriform, które wykonano przy powiększeniu 40X. A) gruczoł ampullate główny; B) gruczoły ampullate główny i poboczny (prawa strona) w celu porównania wielkości; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregate; F) aciniform; G) pyriform.
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki wzorca ekspresji genu jedwabiu, TuSp1, po zbadaniu poziomów mRNA TuSp1 w różnych gruczołach produkujących jedwab (z wyłączeniem gruczołu gruszkowatego) przy użyciu ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) po izolacji całkowitego RNA z gruczołów.
Rycina 5. Przykład analizy MS ekstraktów białkowych otrzymanych z gruczołu gruszkowatego po trawieniu trypsyną w roztworze. Uwaga: x2 oznacza 2-krotne powiększenie intensywności widma. Masy jonów peptydowych widma odpowiadające regionom fibroiny PySp1 są oznaczone symbolem #.
Rysunek 6. Typowy wynik profilu składu aminokwasowego białek wyekstrahowanych z gruczołu rurkowatego. Uwaga: ASX = Asp i Asn; GLX = Glu i Gln. Kolor niebieski oznacza aminokwasy z polarnymi grupami łańcucha bocznego, natomiast kolor czerwony reprezentuje reszty aminokwasowe z niepolarnymi grupami łańcucha bocznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasza metodologia mikrodysekcji gruczołów jedwabniczych u wdowy czarnej stanowi efektywny sposób na uzyskanie wysoko oczyszczonych gruczołów jedwabniczych. Dysekcje mogą zostać przeprowadzone w czasie od 1,5 do 3 h, co pozwala na uzyskanie pełnego zestawu siedmiu różnych gruczołów jedwabniczych u pająków z rodziny Theridiidae. Pozyskanie wysoko oczyszczonych próbek gruczołów jedwabniczych umożliwia badaczom przeprowadzenie szerokiego zakresu badań biochemicznych, w tym identyfikację nowych białek jedwabiu lub białek opie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NSF RUI MCB-0950372 zatytułowany Molecular Characterization of Black Widow Spider Silks.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0.1 M w wodzie |
| Pirowęglan dietylu | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| Cytrynian sodu | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0.015 M w wodzie |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Cyfrowa kamera do mikroskopu | Leica Microsystems | DFC320 | Oprogramowanie - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Nożyczki Vannasa | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Pinceta ze stali nierdzewnej | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Szpilki entomologiczne | Indigo Instruments | 33414-2 | Szpilki entomologiczne #2 |
| Małe lub duże szalki do sekcji | Living Systems Instrumentation | DD-50-S lub DD-90-S | Średnica 52 mm x wys. 18 mm (głębokość Sylgard ~6mm) lub 93 mm x 22 mm |
| Fiolki do hodowli Drosophila | Carolina Biological | FR-17-3076 | Rozmiar: średnica 31.75 mm x 101.6 mm |
Bibliografia
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
