Implantacja elastycznej biokompatybilnej sondy w mysim modelu glejaka

Streszczenie

Źródło: Lefevre, M. C., et al., Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje wszczepienie elastycznej, biokompatybilnej sondy w mysim modelu glejaka w celu zapewnienia ukierunkowanej terapii pulsacyjnym polem elektrycznym do zastosowań neuroterapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Model in vivo
   UWAGA: Dorosłe wielokolorowe fluorescencyjne myszy AMU-Neuroinflam (B6. Zastosowano Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); myszy te wykazują znakowanie subpopulacji neuronów Thy1 ⁺ przez transgeniczną ekspresję ECFP, znakowanie obwodowych komórek zapalnych LyzM ⁺ przez transgeniczną ekspresję EGFP i znakowanie podtypu mikrogleju wyrażającego EYFP pod kontrolą Cd11c ⁺. Krótko mówiąc, zwierzęta są lekko uspokajane 1,5% izofluranem przez 2 minuty przed jakimkolwiek leczeniem lub wstrzyknięciem. Przed zabiegiem zwierzęta są znieczulane ketaminą (120 mg/kg; IP) i ksylazyna (12 mg/kg; Adres IP). Następnie 3% żel lidokainy nakłada się miejscowo, aby złagodzić ból uszu związany z utrwaleniem wsparcia stereotaktycznego. Następnie 0,25% roztwór bupiwakainy podaje się do miejsca operowanego w celu złagodzenia bólu spowodowanego kraniotomią. Po przygotowaniu myszy do operacji wykonano kraniotomię o średnicy 4 mm. Za pomocą igły o sile 26 G wykonano otwór w oponie twardej w środku kraniotomii, a sferoid guza wstrzyknięto za pomocą systemu iniekcyjnego. Dodatkowo, jak opisano tutaj, elastyczna elektroda została umieszczona na sferoidzie guza wyrażającej GCamp6 lub DsRed przed uszczelnieniem kraniotomii szklanym okienkiem.
   1. Umieść kroplę soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) Dulbecco tak, aby pokryła kraniotomię. Umieść elastyczną elektrodę na kropli DPBS i delikatnie umieść tylną część sondy z podkładkami kontaktowymi na grzbiecie myszy (Rysunek 1B).
      UWAGA: Używaj sterylnych rękawiczek i techniki "tylko końcówka". Zmień rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z niesterylną powierzchnią. Zapewnij wsparcie termiczne podczas tej procedury.
   2. Dotknij kropli DPBS małym kawałkiem papieru, aby wchłonąć DPBS, aż sonda będzie mogła położyć się płasko na oponie twardej i podążać za krzywizną mózgu. Upewnij się, że niewielka warstwa DPBS pozostaje pod elektrodami bez ucieczki z boku elektrody. Zapewnia to barierę przed rozlaniem się kleju podczas kolejnych kroków.
      UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem.
   3. Umieść małą kroplę kleju silikonowego na sondzie i przykryj ją okrągłą szklaną pokrywą o średnicy 5 mm. Dociśnij szklankę nakrywkową w dół, aż silikon zostanie równomiernie rozłożony, a odległość między szkłem nakrywkowym a sondą będzie minimalna. Dociśnij szklankę nakrywkową na kolejne 30 sekund, aby silikon mógł stwardnieć.
   4. Aby zabezpieczyć szkło nakrywkowe, szybko nałóż superglue na jego boki i dociśnij go, aż klej utwardzi się na stałe.
   5. Za pomocą wykałaczki nałóż superglue na szyjkę sondy, uważając, aby superglue został wciągnięty pod szyję, aby zapewnić jej stabilne podparcie.
   6. Przykryj czaszkę cementem dentystycznym, aby zbudować przewlekłą czapkę. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zakryć tylko krawędzie szkła nakrywkowego.
   7. Podnieś tylną część sondy i nałóż cement pod jej szyjkę. Oprzyj sondę na cemencie przed utwardzeniem. Delikatnie dociśnij szyjkę sondy kleszczami, tak aby jej powierzchnia znajdowała się na tym samym poziomie co szkło nakrywkowe i nie przeszkadzała obiektywowi mikroskopu podczas eksperymentu.
   8. Przykryj górną część szyjki sondy nie więcej niż 1.5 mm warstwą cementu dentystycznego, aby uzyskać mocne trzymanie sondy. Zbuduj studzienkę cementową z grzbietem 1,5 mm w odległości 1-2 mm wokół szkła nakrywkowego, aby utworzyć miskę na płyn zanurzeniowy do obrazowania dwufotonowego (ryc. 1C).
   9. Po utwardzeniu cementu należy zastosować pooperacyjne leki przeciwbólowe z buprenorfiną (0,05 mg/kg, 0,1 ml na 10 g masy ciała podskórnie) i utrzymywać zwierzę w ciepłej atmosferze aż do przebudzenia. Obejmuje to bliskość żarówki na podczerwień, a także owinięcie zwierzęcia w ręcznik papierowy.
      UWAGA: Umieść termometr na poziomie myszy, aby monitorować temperaturę.
   10. Scharakteryzować impedancję w zakresie 1-10 kHz za pomocą potencjostatu.
   11. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po operacji przez co najmniej 10 dni. Natychmiast po operacji należy podać leki przeciwzapalne i kontynuować monitorowanie stanu zwierzęcia w celu zapewnienia odpowiedniej analgezji pooperacyjnej.

Wyniki

Rysunek 1: Aplikacja in vivo. (A) Schemat eksperymentów in vivo. (B) Umieszczenie sondy przed nałożeniem szkła nakrywkowego i żywicy akrylowej. (C) Zakończono implantację sondy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Żywica akrylowa	Fischer scientific	NC1455685
Buprenorphine	Axience
Lab generator impulsów
Penicylina / Streptomycyna	Gibco	15140-122
Bufor fosforanowy Roztwór soli	fizjologicznej Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Okrągła szklana osłona o średnicy 5 mm	Fischer scientific	50-949-439
Klej silikonowy Kwik-Sil	World Precision Instruments
Super klej	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14	Ludzkie komórki glejaka