Głęboka stymulacja mózgu jako metoda leczenia uzależnienia od narkotyków w modelu szczurzym

Streszczenie

Źródło: Batra, V., et al. Ogólna metoda oceny wpływu głębokiej stymulacji mózgu na samodzielne podawanie metamfetaminy dożylnie. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje szczurzy model uzależnienia od narkotyków, w którym zwierzę samo podaje dożylnie metamfetaminę, naciskając dźwignię, co prowadzi do kompulsywnych zachowań związanych z poszukiwaniem narkotyków napędzanych uwalnianiem dopaminy w jądrze półleżącym. Aby temu przeciwdziałać, szczur jest poddawany głębokiej stymulacji mózgu (DBS) za pomocą wszczepionej elektrody bipolarnej, dostarczając impulsy o wysokiej częstotliwości w celu zahamowania nadpobudliwych neuronów w jądrze półleżącym. Efekty DBS są następnie oceniane poprzez obserwację zmian w zachowaniach związanych z poszukiwaniem narkotyków, ujawniając ich potencjał do zmniejszania reakcji związanych z uzależnieniem.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Aklimatyzacja gryzoni i ograniczenie pokarmu

1. Użyj dorosłych szczurów Wistar, które na początku eksperymentu mają 3 miesiące. Szczury domowe pojedynczo w klatkach wyposażonych w jednostkę przepływu laminarnego i filtr powietrza w placówce opieki nad zwierzętami akredytowanej przez American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w odwróconym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności (światła wyłączają się o godzinie 0600).
2. Dostarczaj swobodnie wodę i standardową karmę dla gryzoni, aż masa ciała osiągnie około 380 – 400 g. Następnie, szczury ograniczają pokarm i utrzymują 85 do 90% swojej masy ciała podczas sesji eksperymentalnych, aby ułatwić nabycie i utrzymanie odpowiedzi na metamfetaminę.
3. Utrzymuj gryzonie w klatce domowej codziennie od przybycia podczas sesji eksperymentalnych, aby rejestrować masę ciała i dostosowywać dzienny przydział pokarmu.
4. Po osiągnięciu docelowej masy należy przygotować się do chirurgicznego wszczepienia każdemu szczurowi przewlekłego cewnika szyjnego i wewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących.

2. Przygotowanie cewnika do cewnikowania żył szyjnych

1. 1. Przygotuj rurkę silastyczną o długości 13 cm i średnicy wewnętrznej 0,012 x 0,025', utwórz kulkę silikonową 4 cm od jednego końca rurki za pomocą dodatkowej rurki silikonowej i elektrokoagulacji i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Zanurz drugi koniec rurki w rozpuszczalniku na bazie limonenu pochodzącym z cytrusów na kilka minut i pozwól mu się rozszerzyć. Podłącz rozszerzoną rurkę do kaniuli prowadzącej ze stali nierdzewnej wygiętej pod kątem prostym.
   3. Zakotwicz wygiętą podstawę kaniuli prowadzącej ze stali nierdzewnej do 1-calowego kwadratu biokompatybilnej siatki za pomocą dentystycznego cementu akrylowego.
   4. Przepłucz cewnik wewnątrz i na zewnątrz etanolem i wodą destylowaną. Wstrzyknij powietrze przez rurkę, aby wyeliminować resztki kropelek cieczy. Pozostawić do wyschnięcia na noc (O/N).
2. Sterile Technique
   1. Wykonuj wszystkie operacje w dedykowanym gabinecie chirurgicznym dla zwierząt, stosując aseptyczne techniki chirurgiczne. Wysterylizuj narzędzia i implanty za pomocą autoklawu i przygotuj sterylne miejsce, kładąc wodoodporny papier na stole operacyjnym (OR) pokrytym sterylnym ręcznikiem (ręcznikami).
   2. Podczas zabiegu należy nosić sterylne rękawiczki i trzymać wszystkie narzędzia, implanty i gazę chirurgiczną na sterylnym obszarze. Przetrzyj każdy instrument wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie 20 sekund w sterylizatorze kulkowym między zabiegami, gdy wykonywanych jest wiele operacji.
3. Anesthesia
   1. Szczury należy potraktować atropiną (siarczanem) (0,04 mg/kg, s.q.), a następnie pentobarbitalem (20 - 50 mg/kg, ip) w celu uzyskania znieczulenia.
   2. Bezpośrednio przed zabiegiem chirurgicznym należy wstrzyknąć zwierzętom sterylną zawiesinę prokainy penicyliny G (75 000 jednostek, domięśniowo [i.m.]) i środek przeciwbólowy (karprofen, 5 - 10 mg / kg, sc lub ketoprofen, 2 - 5 mg / kg, sc) w celu zmniejszenia infekcji okołooperacyjnych i bólu.
   3. Sprawdź, czy znieczulenie jest odpowiednie, przytrzymując zwierzę w umiarkowany sposób i jeśli nie wystąpi żadna reakcja, kontynuuj. Nałóż smar do oczu na obie oczy.
4. Przygotowanie miejsca operowanego
   1. Ogol łatę grzbietową o wymiarach 2 x 2 cm na grzbiecie szczura tuż za linią łączącą łopatki. Ogolić plaster brzuszny o wymiarach 1 x 1 cm w prawej okolicy szyi między kością szczęki a mostkiem.
   2. Przetrzyj ogolone miejsca wacikami nasączonymi alkoholem, a następnie roztworem betadyny. Umieść szczura na sterylnym ręczniku i pozwól betadynie wyschnąć przed kontynuowaniem.
5. Implantacja cewnika
   1. Wykonaj nacięcie równoległe do linii łączącej łopatki w środkowej części łopatki na plecach za pomocą noża o 10 ostrzach. Użyj hemostatu, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki łącznej, aby utworzyć płaszczyznę podstawy cewnika siatkowego. Przepłukać obszar sterylną solą fizjologiczną i przykryć go sterylną gazą przed obróceniem szczura na plecy.
   2. Wykonaj ukośne nacięcie między prawą kością szczęki a mostkiem za pomocą noża o 10 ostrzach. Użyj hemostatu, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki łącznej, aby zlokalizować żyłę szyjną.
      Uwaga: Żyła szyjna wydaje się biała/srebrna i błyszcząca i jest większa u samców szczurów niż u samic.
   3. Umieść szpatułkę pod żyłą, delikatnie zawiąż jedwabny szew 4-0 wokół górnej (bliższej części) odsłoniętej żyły i wepchnij żyłę z powrotem do szyi.
   4. Oddziel tkanki łączne, aby utworzyć powierzchowną kieszeń pod dolno-boczną skórą szyi, ale powyżej mięśnia. Wepchnij wysterylizowany trokar od nacięcia szyi do nacięcia środkowego łopatki, drążąc tunel z powrotem za ramieniem i w górę. Poprowadź cewnik od tyłu do szyi, wprowadzając sztywny drut prowadzący przez trokar od końca szyi i do dystalnego cewnika. Przeciągnij drut doprowadzający z powrotem do nacięcia szyi, a dołączony cewnik dystalny podąży za nim.
   5. Odizoluj prawą żyłę szyjną nad szpatułką, pociągając do góry wcześniej założony szew proksymalny. Użyj nożyczek kulkowych, aby wykonać małe częściowe nacięcie na górnej stronie żyły.
   6. Włóż zakrzywione kleszcze do nacięcia żyły, aby je otworzyć. Trzymając kleszcze osobno, ale na miejscu, przełóż końcówkę cewnika między końcówki kleszczy i do żyły około 2-3 cm, gdzie zakończy się na zewnątrz prawego przedsionka.
   7. Zabezpiecz cewnik, zawiązując jedwabny szew 4-0 wokół dystalnej żyły. Zwiąż ze sobą szwy proksymalne i dystalne w węzeł "pudełkowy", aby zapewnić dodatkową stabilność.
   8. Przepłukać cewnik sterylnym roztworem soli fizjologicznej podgrzanej heparyną i pobrać krew, aby potwierdzić pomyślną implantację. Przyciąć szwy 1 - 2 mm powyżej węzłów i wsunąć pozostały cewnik proksymalny pod skórę szyi. Zamknij odpowiednim szwem/metodą według własnego wyboru. Jeśli używane są niewchłanialne szwy lub zszywki, należy je usunąć w ciągu 10-14 dni w znieczuleniu ogólnym. Przykryj nacięcie maścią z antybiotykiem za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
   9. Zakotwiczyć dystalny cewnik/kaniulę prowadzącą/siatkę do podskórnej tkanki tylnej za pomocą wchłanialnych szwów w dwóch przeciwległych rogach podstawy siatki. Zamknij tylne nacięcie wokół kaniuli prowadzącej za pomocą przerwanych, nieodwróconych szwów wchłanialnych. Przykryj nacięcie maścią z antybiotykiem za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
6. Postoperative Care
   1. Przepłucz cewnik heparynizowanym 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i umieść obturator w kaniuli prowadzącej, aby zapobiec zatkaniu.
   2. Codziennie przepłukuj cewnik każdego szczura, aby utrzymać drożność.
   3. Bezpośrednio po zabiegu umieść szczura w jego domowej klatce nad poduszką grzewczą na sali operacyjnej i obserwuj, aż powróci przytomność i spontaniczne ruchy.
   4. Wróć do zdrowia szczura do pokoju kolonijnego i odczekaj od pięciu do siedmiu dni przed operacją wewnątrzczaszkową. Codziennie waż, dotykaj i oceniaj ich ogólny stan, w tym sprawdzanie infekcji i ocenę zachowania, wyglądu i poziomu aktywności zwierząt.
   5. Skonsultuj się z weterynarzem ds. zasobów zwierzęcych, jeśli pojawią się jakiekolwiek problemy i postępuj zgodnie z zalecanymi schematami leczenia. W razie potrzeby należy wstrzyknąć zwierzętom środek przeciwbólowy (karprofen, 5 - 10 mg/kg, sc lub ketoprofen, 2 - 5 mg/kg, sc) w celu leczenia bólu okołooperacyjnego.

3. Przygotowanie chirurgiczne do umieszczania

1. elektrod wewnątrzczaszkowych
   1. Wszystkie operacje należy wykonywać w sterylnych warunkach, jak opisano w sekcji 2.2.
2. Anesthesia
   1. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej znieczulenia i zapewnij przepływ izofluranu do komory z prędkością 1,000 - 2,000 ml/min przy parowniku ustawionym na 5%.
   2. Gdy zwierzę znajdzie się w pozycji leżącej, wyjmij je z komory i umieść w stożku nosowym na wyściełanej stereotaktycznej platformie operacyjnej. Przełącz przepływ gazu z komory na stożek nosowy i uruchom gaz z parownikiem ustawionym na 2 - 3%.
   3. Dostosuj waporyzator w razie potrzeby, aby utrzymać stabilny oddech i brak reakcji na stymulację podczas operacji.
   4. Bezpośrednio przed zabiegiem należy wstrzyknąć szczurowi sterylną zawiesinę prokainy penicyliny G (75 000 jednostek domięśniowo) i środek przeciwbólowy (buprenorfina 0,05 do 0,5 mg / kg mc. sc) w celu zmniejszenia infekcji okołooperacyjnych i bólu.
   5. Sprawdź, czy znieczulenie jest odpowiednie, przytrzymując zwierzę w umiarkowany sposób i jeśli nie wystąpi żadna reakcja, kontynuuj. Nałóż smar do oczu na obie oczy.
3. Przygotowanie miejsca operowanego
   1. Ogol czubek głowy szczura i umieść go w nausznikach, aby utrzymać głowę nieruchomo podczas zabiegu. Przetrzyj ogolony obszar wacikami nasączonymi alkoholem, a następnie roztworem betadyny. Poczekaj, aż betadyna wyschnie, zanim przejdziesz dalej.
4. Implantacja elektrody
   1. Chwyć kleszczami skórę głowy między uszami i nieco przed nimi i użyj nożyczek, aby przeciąć podstawę. Ten manewr usunie obszar skóry o wymiarach 1,5 x 1 cm nad środkową częścią czaszki.
   2. Użyj 10 ostrzy, aby wykonać obwodowe nacięcie przez okołoczaszkę aż do czaszki, oraz zakrzywionych kleszczy, aby zeskrobać i usunąć pericranium. Przepłukać obszar sterylną solą fizjologiczną, przetrzeć nadmiar krwi i soli fizjologicznej gazą i pozostawić czaszkę do całkowitego wyschnięcia, aby można było wyraźnie zobaczyć kostne punkty orientacyjne, w tym bregmę.
   3. W przypadku chirurgii obustronnej zamontuj dwie bipolarne elektrody platynowo-irydowe, po jednej w każdym uchwycie elektrody po obu stronach stereotaktycznej platformy operacyjnej. Przesuń pierwszą elektrodę w pozycję ~1 mm nad bregmą i zapisz współrzędne stereotaktyczne dla pozycji przednio-tylnej (AP) i przyśrodkowo-bocznej (ML), które zostaną pokazane na wyświetlaczu cyfrowym. NIE dotykaj końcówki elektrody do czaszki, ponieważ elektroda nie będzie już działać. Powtórz tę procedurę dla drugiej elektrody.
   4. Oblicz końcowe współrzędne AP i ML na podstawie interesującej Cię struktury docelowej. Przesuń elektrodę do tej pozycji z końcówką tuż nad czaszką, aby uzyskać początkową współrzędną grzbietowo-brzuszną (DV) na wyświetlaczu cyfrowym. Oblicz końcową głębokość DV na podstawie docelowej struktury będącej przedmiotem zainteresowania.
      Uwaga: W tym przykładzie celem była powłoka jądra półleżącego, biorąc pod uwagę jej znany udział w zachowaniach konsumpcyjnych związanych z narkotykiem, przy użyciu następujących współrzędnych stereotaktycznych względem bregmy:Współrzędna wejściowa AP = [Współrzędna wyświetlana cyfrowo w bregma] + Współrzędna wejściowa 1,6 ML = [Współrzędna wyświetlana cyfrowo w bregma] ± 2,4 dla głębokości prawej/lewejDV = [Cyfrowo wyświetlana współrzędna na powierzchni czaszki przy wejściu AP/ML] - 8.5
   5. Zaznacz rzutowaną pozycję wejściową każdej elektrody na powierzchni czaszki za pomocą trwałego markera. Podczas tego manewru nie uderzaj ani nie dotykaj końcówki elektrody.
   6. Użyj okrągłego zadzioru z powłoką diamentową, aby wywiercić otwór o średnicy 1.4 mm w każdym znaku. Uważaj, aby nie zanurzyć czaszki w sklepieniu wewnątrzczaszkowym za pomocą wiertła o dużej prędkości. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby nakłuć oponę twardą po wywierceniu czaszki.
   7. Użyj okrągłego zadzioru z diamentem, aby wywiercić otwory o średnicy 0,7 mm w dodatkowych czterech miejscach za wlotami elektrod w celu umieszczenia czaszkowych. Użyj ręcznego śrubokręta, aby umieścić cztery ze stali nierdzewnej o wymiarach 0.8 (średnica) x 3.2 (długość) mm w czaszce, po dwie z każdej strony linii środkowej. Mocno przymocuj te do około połowy ich długości w czaszce, ponieważ są one główną infrastrukturą, która utrzyma pokrywę czaszki na miejscu przez nadchodzące tygodnie i miesiące.
   8. Ostrożnie włóż pierwszą elektrodę przez otwór w mózgu do obliczonej głębokości DV, ręcznie obracając pokrętło zarządzające współrzędną Z uchwytu elektrody. Obracaj pokrętło z prędkością mniej więcej równą 1/2 obrotu na sekundę, aby zapobiec niepożądanemu uszkodzeniu końcówki elektrody. Upewnij się, że końcówka elektrody nie dotyka kostnej krawędzi otworu podczas wchodzenia do mózgu.
   9. Zabezpiecz pierwszą elektrodę za pomocą super kleju nałożonego na otwór i tylne, a następnie za pomocą cementu dentystycznego. Gdy ta konstrukcja całkowicie wyschnie, wyjmij elektrodę z uchwytu. Powtórz proces wprowadzania i cementowania dla drugiej elektrody. Nakładaj cement dentystyczny aż do krawędzi skóry, ale nie nachodź na skórę, ponieważ powoduje to długotrwałe poluzowanie cementowej czapeczki czaszki.
5. Postoperative Care
   1. Umieść dwie nasadki przeciwpyłowe na cokołach elektrod, aby zapobiec zatykaniu.
   2. Bezpośrednio po zabiegu umieść szczura w jego domowej klatce nad poduszką grzewczą na sali operacyjnej i obserwuj, aż powróci przytomność i spontaniczne ruchy.
   3. Zwróć odzyskanego szczura do pokoju kolonijnego i odczekaj pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu. Codziennie waż, dotykaj i oceniaj ogólny stan szczurów, w tym sprawdzanie infekcji i ocenę zachowania, wyglądu i poziomu aktywności zwierząt.
   4. Skonsultuj się z weterynarzem ds. zasobów zwierzęcych, jeśli pojawią się jakiekolwiek problemy i postępuj zgodnie z zalecanymi schematami leczenia. W razie potrzeby należy wstrzyknąć zwierzętom środek przeciwbólowy (buprenorfina w dawce od 0,05 do 1 mg/kg mc. sc) w celu leczenia bólu okołooperacyjnego. Krwawienie śródczaszkowe może być bardziej rozpowszechnione przy stosowaniu niesteroidowych leków przeciwbólowych (karprofen, 5 - 10 mg/kg, sc lub ketoprofen, 2 - 5 mg/kg, sc), dlatego buprenorfinę należy stosować okołooperacyjnie do chirurgii wewnątrzczaszkowej.

4. Aparatura operacyjna

1. Do przeprowadzania eksperymentów behawioralnych należy używać komór kondycjonowania z tworzywa sztucznego i stali nierdzewnej zawartych w obudowach tłumiących dźwięk
.
2. Wyposaż każdą obudowę w wentylator wyciągowy, który zapewnia wentylację, oraz biały szum, który maskuje obce dźwięki.
3. Użyj komputera osobistego i behawioralnego systemu interfejsu oprogramowania, aby zaprogramować procedury i zebrać dane eksperymentalne.
4. General Set-Up
   1. Wyposaż każdą komorę eksperymentalną w dwie dźwignie reakcji zamontowane na jednej ścianie komory, z lampką stymulacyjną umieszczoną nad każdą dźwignią. Oznacz jedną z dźwigni jako dźwignię "aktywną", tak aby po naciśnięciu powodowała zaprogramowaną konsekwencję.
   2. Zaprogramuj lampkę stymulacyjną umieszczoną bezpośrednio nad dźwignią aktywnej reakcji, aby świeciła podczas każdej sesji operacyjnej, wskazując dostępność leku.
   3. Reakcja na aktywną dźwignię powoduje podanie wlewu metamfetaminy (0,05 mg/kg/infuzję w 100 μl 0,9% NaCl) w ciągu 2,8 sekundy, czemu towarzyszy zapalenie światła w domu na przeciwległej ścianie na 5 sekund i wyłączenie lampki bodźca na 30-sekundowy limit czasu.
   4. Zliczaj odpowiedzi na aktywnej dźwigni, ale nie powinny one mieć żadnych zaplanowanych konsekwencji podczas 30-sekundowego limitu czasu. Po zakończeniu zapisuj odpowiedzi na nieaktywnej dźwigni, ale nie powinny one mieć zaplanowanych konsekwencji.

5. Dożylne (IV) samodzielne podawanie metamfetaminy Przygotowania

1. ogólne
   1. Załaduj szczury do komór operacyjnych tak szybko i spokojnie, jak to możliwe, aby zminimalizować artefakty behawioralne. Przymocuj smycz sprężynową ze stali nierdzewnej do kaniuli prowadzącej na grzbiecie gryzonia oraz do szczelnego krętlika na płyn zawieszonego nad komorą operacyjną.
   2. Upewnić się, że przewód połączeniowy od krętlika do strzykawki z lekiem o pojemności 20 ml jest szczelny w pompie napędzanej silnikiem umieszczonej na zewnątrz obudowy tłumiącej dźwięk. Aby to zrobić, wciśnij plastikową rurkę łączącą co najmniej 1/4 cala na metalową końcówkę obrotową i końcówkę igły strzykawki z lekiem, aż nie zsunie się z umiarkowanym ciągnięciem. Przeciwwaga między krętlikiem a smyczą, aby umożliwić zwierzę w miarę swobodne poruszanie się.
   3. Przeprowadzaj sesje operacyjne mniej więcej o tej samej porze każdego dnia, od poniedziałku do piątku.
2. Acquisition
   1. Aby ułatwić szybkie przyswojenie metamfetaminy dożylnie, przeprowadzaj szczury na codziennych 6-godzinnych sesjach przez cztery do pięciu kolejnych dni.
   2. Przeprowadź te sesje zgodnie ze stałym stosunkiem FR-1 + 30 sekund harmonogramu wzmacniania, podczas którego szczury otrzymują jeden wlew metamfetaminy dożylnie za każde naciśnięcie aktywnej dźwigni, po czym następuje 30-sekundowa przerwa (np. po naciśnięciu którejkolwiek dźwigni nie występują żadne konsekwencje dla wskazówki lub nagrody).
      Uwaga: Ten początkowy przedłużony i "łatwy" dostęp spowoduje, że większość gryzoni nabierze znaczących zachowań związanych z przyjmowaniem narkotyków w czasie mniejszym lub równym jednego tygodnia (ryc. 3).
3. Maintenance
   1. Podczas drugiego tygodnia treningu, biegaj na szczurach na codziennych 2-godzinnych sesjach od poniedziałku do piątku, aby utrzymać i udoskonalić samodzielne podawanie metamfetaminy dożylnie.
   2. Przeprowadzaj sesje na stałym współczynniku FR-1 + 30-sekundowy harmonogram zbrojenia.
   3. Udokumentuj stabilną, intensywną reakcję, gdy całkowita liczba prezentacji metamfetaminy podczas każdej sesji waha się o mniej niż 10% przez trzy kolejne sesje (Ryc. 4), a łączna liczba wlewów w ciągu pierwszych 30 minut jest większa niż skumulowana liczba wlewów w ciągu drugich 30 minut (Ryc. 5).
      Uwaga: Kryterium to gwarantuje, że szczury rozwijają wzorzec ładowania narkotykami na początku sesji, który wskazuje na zachowania uzależniające19, a nie tylko na przypadkowe zażywanie.
4. Post-Session
   1. Na koniec każdej sesji odłącz smycz od grzbietu gryzonia. Przepłukać cewnik 0,1 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej zawierającego 800 j.m. streptokinazy, aby zapobiec powstawaniu zakrzepów krwi. Włóż zasłonę do każdej kaniuli prowadzącej, aby zapobiec zatkaniu przed powrotem szczurów do klatek domowych.
   2. Badaj drożność cewników natychmiast po zakończeniu każdej sesji eksperymentalnej w środy przez cały czas trwania eksperymentu.
      1. Przygotuj strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą 22 G, zawierającą heparynizowaną bakteriostatyczną sól fizjologiczną do badania drożności cewnika. Przymocuj jeden koniec plastikowego kawałka rurki o długości od 4 do 6 cali do igły, a drugi koniec do metalowego wkładu zespołu cewnik-kaniula na grzbiecie zwierzęcia.
      2. Wlać w infuzji 0,1 do 0,2 ml soli fizjologicznej, aby zapewnić klarowny przepływ, a następnie wciągnąć tłok strzykawki z powrotem. Jeśli cewnik jest opatentowany, powinien zarówno łatwo się spłukiwać, jak i cofać krew, która będzie widoczna w rurce. Zwolnij tłok i wlej kolejne 0,2 ml, aby przepłukać całą krew z powrotem przez cewnik.
      3. Jeśli nie można pobrać krwi, wyjmij strzykawkę o pojemności 3 ml i rurkę z metalowego wkładu.
      4. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 22 G, zawierającą metoheksytal sodu, szybko działający środek znieczulający, w celu dalszego zbadania drożności cewnika. Przymocuj jeden koniec plastikowego kawałka rurki o długości od 4 do 6 cali do igły, a drugi koniec do metalowego wkładu zespołu cewnik-kaniula na grzbiecie zwierzęcia.
      5. Podać w infuzji 1,5 mg i szybko wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml i rurkę z metalowego pręta na grzbiecie zwierzęcia. Ponownie podłączyć strzykawkę o pojemności 3 cm3 wypełnioną heparynizowaną bakteriostatyczną solą fizjologiczną i zaparzyć 0,1 - 0,2 ml. Jeśli zwierzę straci napięcie mięśniowe w ciągu 3 sekund, oznacza to, że cewnik jest opatentowany i funkcjonalny.
5. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym "Typowe pułapki", aby zapoznać się z sekcją dotyczącą pułapek, która dotyczy niepożądanych reakcji na metamfetaminę, niepowodzenia w samodzielnym podawaniu metamfetaminy i trudności z ekstrakcją szczurów.

6. Aparat do stymulacji mózgu

1. Użyj od 10 do 12 pudełek z pleksiglasu (12 x 18 x 18 cali) (szer. x wys. x gł.) do przeprowadzenia eksperymentów DBS. Przykryj każde pudełko na zewnątrz sztywnym, nieprzezroczystym papierem, który zakrywa tył i boki pudełka, aby zapobiec oglądaniu lub interakcji ze sobą przez szczury. Pozostaw przezroczysty panel przedni odsłonięty, aby egzaminator mógł oglądać zwierzęta podczas sesji stymulacji.
2. Przykryj górną część pudełek półprzepuszczalnym panelem, który zapobiega ucieczce szczurów, jednocześnie umożliwiając przepływ powietrza. Użyj tego panelu, aby podeprzeć komutatory, które znajdują się nad każdym pudełkiem, aby ułatwić połączenie elektryczne między nasadką głowy gryzonia a systemem stymulacji.
3. Użyj systemu stymulacji, który może dostarczać stały prąd do wielu jednoczesnych zwierząt do eksperymentów DBS. Użyj systemu, który składa się z programowalnego przez użytkownika cyfrowego procesora sygnałowego/interfejsu komunikacyjnego, stymulatora, zestawu baterii stymulatora, rozdzielacza kanałów i dołączonego oprogramowania (patrz karta materiałów).
4. Użyj o niestandardowej długości, aby połączyć porty kanału stymulatora z nadrzędnym elektronicznym cokołem każdego komutatora.
   Uwaga: Wymagana długość będzie zależeć od indywidualnego laboratorium. te znajdują się poza obszarem zwierząt i nie muszą być pokryte sprężyną ze stali nierdzewnej.
5. Podłącz dolny elektroniczny cokół komutatora do wszczepionego cokołu elektrody na nasadce głowy gryzonia za pomocą 16-calowych pokrytych sprężyną ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że są wystarczająco długie, aby umożliwić swobodny ruch w każdym obszarze obudowy bez znacznego naprężenia nasadki głowicy.
   Uwaga: Zwykle wystarcza, który kończy się mniej więcej w miejscu, w którym znajdowałaby się głowa szczura, stojącego na wszystkich czterech nogach.
6. Programowanie stymulacji mózgu
   1. Użyj komputera osobistego i oprogramowania do programowania, aby zaprogramować parametry stymulacji (np. kształt fali, częstotliwość, szerokość impulsu, opóźnienie między bodźcami, amplituda prądu) i zebrać dane eksperymentalne.
   2. Korzystając z wizualnego języka programowania, określ, jakie funkcje będzie wykonywać każde urządzenie, aby spełnić eksperymentalne punkty końcowe oraz które dane będą przechowywane i/lub rzutowane do przeglądania w czasie rzeczywistym. Polecenia, które uruchamiają ten konkretny projekt, pokazano na rysunku 1.
   3. Określ żądaną częstotliwość, szerokość impulsu i amplitudę w wizualnym panelu sterowania (rysunek 2) przed rozpoczęciem eksperymentu. Typowe parametry stymulacji wysokiej częstotliwości u szczurów są podobne do tych stosowanych w klinicznej głębokiej stymulacji mózgu człowieka: częstotliwość od 130 do 180 Hz, szerokość impulsu od 60 do 90 ms i amplituda prądu od 100 do 250 μA4,8-10.
      Uwaga: U gryzonia stosuje się niższy prąd ze względu na jego mniejszy rozmiar w porównaniu z naczelnymi.

7. Procedura głębokiej stymulacji mózgu

1. Aby załadować szczury do pudełek, przymocuj linkę sprężynową ze stali nierdzewnej z komutatora do każdego cokołu elektrody na nasadce głowicy. Przetestuj impedancję każdej elektrody, uruchamiając prąd o wartości 5 μA z częstotliwością 1 000 Hz przez 2 sekundy.
   1. Jeśli impedancja jest równa lub mniejsza niż 125 KOhm, kontynuuj eksperyment, ponieważ elektroda jest w stanie dostarczyć stymulację terapeutyczną. Jeśli impedancja jest większa niż 125 kOhm, rozważ usunięcie zwierzęcia z eksperymentu, ponieważ wysoka rezystancja elektrody może obciąć prąd do potencjalnie subterapeutycznych poziomów.
2. Przeprowadź szczury przez jedną lub dwie próbne sesje w celu przyzwyczajenia, podczas których zostaną podłączone do () elektrody, ale nie otrzymają żadnej aktywnej terapii. Testy próbne wyeliminują wszelkie niespecyficzne efekty behawioralne. Natychmiast po każdej próbnej sesji przetransportuj szczury do boksów operacyjnych na codzienną 2-godzinną sesję samodzielnego podawania metamfetaminy dożylnie.
3. Przeciwwaga dla szczurów w dwóch grupach, kohorcie aktywnej stymulacji i kohorcie pozorowanej stymulacji, tak aby wyjściowe spożycie leku nie różniło się znacząco między grupami.
4. Wykonuj codzienne sesje DBS na kohorcie gryzoni przez 5 dni, podczas których otrzymują one aktywną elektryczną stymulację mózgu lub brak stymulacji przez 3 godziny, w zależności od przypisania do grupy. Bezpośrednio po każdej sesji DBS przetransportuj szczury do boksów operacyjnych na codzienną 2-godzinną sesję samodzielnego podawania metamfetaminy dożylnie.
   1. Uważnie obserwuj zwierzęta podczas przynajmniej części każdej sesji DBS, aby upewnić się, że stymulacja nie powoduje wyraźnych zmian w zachowaniu zwierząt. Jeśli w trakcie/po stymulacji wystąpią jakiekolwiek nietypowe zachowania, należy udokumentować te obserwacje. Uwaga: Autorzy nie zauważyli znaczących zmian w zachowaniu lub zmian w spożyciu pokarmu/wody podczas eksperymentu opisanego w tym artykule.
5. W zależności od hipotezy zmień długość leczenia DBS, parametry elektryczne i czas między sesją DBS a sesją operantową, w zależności od hipotezy.

Wyniki

Rysunek 1. Wizualny język programowania. Badacz używa wizualnego języka programowania, takiego jak w przykładzie pokazanym tutaj, aby zaprojektować program, który może dostarczać stymulację mózgu wielu zwierzętom jednocześnie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule Nazwa Firma Numer katalogowy Komentarze Komory operacyjne gryzoniMed Associates, IncENV-008CTMed Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA Telefon: (802) 527-2343Kopf Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt z konsolą wyświetlacza cyfrowegoKopf InstrumentsModel 940Kopf Telefon: 1-877-352-3275 Faks: 1-818-352-3275 E-mail: sales@kopfinstruments.netProcesor Bioamp 3-DSP serii ZTucker Davis TechnologiesRZ5DTucker-Davis Technologies 11930 Koło Badawcze Alachua, FL 32615 USA Tel: 386-462-9622 www.tdt.com32-kanałowy stymulator serii ZTucker Davis TechnologiesIZ2-32Do oprogramowania dołączona jest instrukcja, która omawia sposób programowania eksperymentów za pomocą platformy OpenEx, do której można uzyskać dostęp tutaj: http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdfAkumulator litowo-jonowy 48 V do stymulatora IZ2Tucker Davis TechnologiesLZ48-200 32-kanałowy rozdzielacz do PZ5Tucker Davis TechnologiesS-BOX_PZ5 Pakiet oprogramowania OpenEx Ext do wielokanałowego zapisu neuronowego TuckerDavis TechnologiesOpenEx Platynowo-irydowe elektrody stymulującePlastics One IncMS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005"Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, PH 540-772-79502-kanałowe między stymulatorem a komutatoremPlastics One Inc305-441/2 W/ Sprężyna Przewody 2-kanałowe pomiędzy komutatorem a cokołem elektrodyPlastics One Inc305-305 W/ Sprężynowe komutatory 4-kanałowePlastics One IncSL2+2C i SL2+SC/SB