Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Streszczenie

Źródło: Palma-Tortosa, S., et.al. Hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje przeszczep neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych do wycinków ludzkiej tkanki korowej. Procedura polega na wyizolowaniu i ponownym zawieszeniu komórek progenitorowych w macierzy błony podstawnej, a następnie wstrzyknięciu ich do wycinka korowego umieszczonego na zespole transwell. Po inkubacji, aby umożliwić zestalenie macierzy i różnicowanie neuronów, przeszczepiona tkanka jest przygotowywana do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Proliferacja i różnicowanie komórek lt-NES

UWAGA: Długoterminowe samoodnawiające się neuronabłonkowe komórki macierzyste (lt-NES) pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (lt-NES) są generowane i transdukowane wektorem lentiwirusowym przenoszącym białko zielonej fluorescencji (GFP) pod konstytutywnym promotorem (komórki GFP-lt-NES). Fiolki zawierające 3 x 10⁶ komórek są przechowywane w temperaturze -150 °C do momentu użycia.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych i mediów

1. Rozcieńczyć 100 μg podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) w 10 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS)-0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać stężenie podstawowe 10 μg/ml. Przygotować 100 μl porcji.

2. Rozcieńczyć 100 μg naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) w 10 ml PBS-0,1% BSA, aby uzyskać stężenie wyjściowe 10 μg/ml. Przygotować 100 μl porcji.

3. Podwielokrotność 50x suplementu B27 w objętości 100 μL na podwielokrotność.

4. Rozcieńczyć 10 mg poli-L-ornityny w 100 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie wyjściowe 100 μg/ml. Przygotować 1 ml porcji.

5. Przygotuj 30 μl porcji 1,20 mg/ml mysiej lamininy.

6. Rozcieńczyć 10 ml kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,25%) w 90 ml PBS do stężenia podstawowego 0,025%. Przygotować 1 ml porcji.

7. Rozcieńczyć 0,025 g inhibitora trypsyny w 50 ml PBS do stężenia podstawowego 0,5 mg/ml. Przygotować 1 ml porcji.

8. Rozcieńczyć 10 μg Wnt3a (członek rodziny 3A. integracji MMTV typu bezskrzydłego) w 1 ml PBS-0,1% BSA, aby uzyskać stężenie wyjściowe 10 μg/ml. Przygotuj BMP4 (białko morfogenetyczne kości 4) w ten sam sposób. Podwielokrotność na objętość 100 μl.

9. Rozcieńczyć 1 mg cyklopaminy w 2,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 400 μg/ml i zrobić 100 μL porcji.

10. Przygotuj podłoże podstawowe (Tabela 1) i podłoże zdefiniowane różnicowo (DDM, Tabela 2) i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

2. Powlekanie naczyń hodowlanych

1. Aby wstępnie pokryć szalki w celu hodowli komórek GFP-It-NES podczas proliferacji lub różnicowania, rozcieńczyć poli-L-ornitynę w stosunku 1:100 w wodzie dejonizowanej i dodać 5 ml roztworu do kolby T25. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (RT).

2. Umyj płytki pokryte poli-L-ornityną 1x wodą dejonizowaną i 1x PBS.

3. W przypadku komórek GFP-It-NES w trakcie proliferacji, rozcieńczyć mysią lamininę w stosunku 1:500 w PBS i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C. W przypadku różnicowania komórek GFP-It-NES należy rozcieńczyć mysią lamininę w stosunku 1:100 w PBS i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.

3. Proliferacja komórek GFP-lt-NES

1. Ciepłe 5 ml (do mycia) i 5 ml (do wysiewu) podłoża zasadowego w dwóch różnych probówkach o pojemności 15 ml.

2. Szybko rozmrozić jedną fiolkę z komórkami GFP-lt-NES w temperaturze 37 °C, przenieść je do probówki myjącej i odwirować przy 300 x g przez 5 min.

3. Ostrożnie zassać pożywkę, nie dotykając osadu i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża podstawowego. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wysiewającej zawierającej podłoże podstawowe uzupełnione czynnikami proliferacji: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) i B27 (10 ng/ml). Wysiać komórki w kolbie T25 pokrytej poli-L-ornityną/lamininą.

4. Codziennie karmij komórki czynnikami proliferacji. Wymień pożywkę, jeśli zmieni kolor na żółty. Komórki należy przechodzić co trzeci lub czwarty dzień (1 dzień po osiągnięciu 100% zbieżności).

4. Dzielenie komórek GFP-lt-NES w celu proliferacji i różnicowania

1. Wstępnie podgrzej 5 ml pożywki zasadowej na kolbę (w celu zebrania komórek) plus całkowitą objętość potrzebną do ich ponownego zasiania.
UWAGA: Pasaż odbywa się w rozcieńczeniu 1:3, aby utrzymać komórki w proliferacji, wymagając 15 ml pożywki zasadowej i rozcieńczeniu 1:6, aby rozpocząć różnicowanie, wymagając 30 ml pożywki zasadowej.

2. Wyjmij pożywkę z kolby do hodowli komórkowej przez aspirację i dodaj 500 μL wstępnie podgrzanej 0,025% trypsyny. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Oderwanie komórek można potwierdzić pod standardowym mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu.

3. Dodaj równą objętość inhibitora trypsyny (0,5 mg/ml stężenia końcowego), a następnie 5 ml ciepłej pożywki zasadowej. Odłącz i zbierz komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.

4. Aby utrzymać komórki w stanie proliferacji, przeplate w rozcieńczeniu 1:3 na świeżej pożywce podstawowej uzupełnionej czynnikami proliferacji i powtórz krok 1.3.4.

5. Różnicowanie korowe komórek GFP-lt-NES

1. W dniu 0 ponownie zawiesić komórki (do wykorzystania do różnicowania) w 30 ml pożywki zasadowej uzupełnionej czynnikami proliferacji i umieścić je w sześciu kolbach T25 pokrytych różnicowaniem (podzielonych 1:6).

2. W dniu 1 zmień połowę pożywki na DDM i dodaj czynniki proliferacji w połowie ich stężenia.

3. W dniu 2 całkowicie zmień pożywkę na DDM uzupełnioną o czynniki różnicujące: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) i cyklopaminę (400 ng/ml).

4. W dniu 4 dodaj same czynniki różnicujące. Wymień pożywkę, jeśli zmieni kolor na żółty.

5. W dniu 6 zmień medium na DDM uzupełnione o BMP4 i Wnt3a. Na tym etapie usuwa się cyklopaminę.

6. W dniu 7 odłącz komórki, jak opisano w kroku 1.4.2 i kroku 1.4.3.

2. Przeszczepienie komórek GFP-lt-NES do organotypowych plastrów hACtx

UWAGA: Dorosła ludzka tkanka korowa (hACtx) powinna być hodowana przez 1 tydzień przed przeszczepem komórki. Aby ułatwić procedurę przeszczepu, konieczne jest usunięcie 2 ml pożywki hACtx z górnej części wkładki, aby zapobiec unoszeniu się tkanki.

1. Zawiesić zagruntowane korowo komórki GFP-lt-NES (od kroku 1.5.6) w zimnej, czystej macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) w stężeniu 1 x 105 komórek/μl i przenieść roztwór do mniejszej sterylnej probówki.

UWAGA: Podczas procedury przeszczepu wszystkie materiały (końcówki pipet, rurki, kapilary itp.) powinny być wstępnie schłodzone, aby uniknąć zestalenia żelu. Rozmrozić żel matrycy błony podstawnej na lodzie przez 30 minut przed jego użyciem.

2. Zbierz zawiesinę komórek do zimnej szklanej kapilary połączonej z gumowym smoczkiem w celu odsysania. Zawiesinę komórkową należy wstrzykiwać w postaci małych kropel (po ok. 1 μl każda), wbijając półsuchy wycinek tkanki w różne miejsca.

3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby żel zestalił się. Przenieś płytkę z inkubatora z powrotem do kaptura i ostrożnie dodaj 2 ml pożywki hACtx do górnej części wkładu, aby całkowicie zanurzyć tkankę.

4. Raz w tygodniu należy wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę hACtx.

Wyniki

Tabela 1: Skład pożywki proliferacyjnej komórek lt-NES (pożywka zasadowa).

Podstawowe średnie	stężenie zapasu		Stężenie końcowe Na 100 ml
DMEM/F12 z L-Glutaminą	1x		98,7 ml...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
UTRZYMANIE I HODOWLA LUDZKIEJ TKANKI KORY NOWEJ
6-dołkowa płytka	ThermoFisher Scientific	140675
Rusztowanie Alvetex 6-dołkowe wkładki	Reinnervate Ltd	AVP004-96
Suplement B27 (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys bez technologii Phenol Red	StemCell	#05791	Określany jako pożywka neuronalna w tekście
Jednostki filtrujące 250 ml lub 500 ml	Kleszcze Corning Sigma	CLS431096/97
	Dowolna odpowiednia
gentamycyna (50 mg/mL)	Suplement ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Określany jako L-glutamina w tekście
Smoczek gumowy + szklana pipeta	Dowolny odpowiedni
GENERACJA komórek lt-NES
2-merkaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Scientific
Bezzwierzęcy rekombinowany EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyklopamina, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Roztwór glukozy (45%)	Sigma	G8769
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Bufor fosforanowy Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Bez wapnia i magnezu
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Roztwory aminokwasów endogennych (100x)	Suplement ThermoFisher	Scientific 11140050
N-2 (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poli-L-Ornityna	Merk	P3655
Rekombinowane	systemy badawczo-rozwojowe	314-BP-010
systemy badawczo-rozwojowe	białek ludzkich Wnt-3a	5036-WN
Pirogronian sodu (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Inhibitor trypsyny sojowej, proszek	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterylna woda	dejonizowanaSystem	filtracyjny MilliQ
MilliQ Trypsyna EDTA (0,25%)	Sigma	T4049-500ML
SPRZĘT DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH
Pipety o regulowanej objętości 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	Various
Matryca membranowa podstawowa, z certyfikatem ESC (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Wirówka	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Inkubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Narzędzie do cięcia komórek macierzystych 0,190-0,210 mm	Vitrolife	14601
Sterylne probówki	Sarstedt	Różne
sterylne jednorazowe szklane pipety Pasteura 150 mm	VWR	612-1701
Sterylne końcówki do pipet 0,1-1000 μL	Biotix VWR	Różne
sterylne pipety serologiczne 5, 10, 25, 50 ml	Costar	Różne
kolby T25 Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

31350010 białek ludzkich BMP-4 Rekombinowane