Stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusów w celu stabilnej modyfikacji genetycznej w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Porlan, E., et al. Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek u dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje stabilną modyfikację genetyczną nerwowych komórek macierzystych (NSC) w strefie komorowo-podkomorowej (V-SVZ) poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie genu terapeutycznego przenoszącego wirusa w modelu mysim. Wirus wnika do NSC, ulega odwrotnej transkrypcji, integruje się z genomem i umożliwia stabilną i wydajną modyfikację genetyczną do zastosowań neuroterapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Stereotaktyczne wstrzyknięcie komory bocznej (LV) do strefy komorowo-podkomorowej (V-SVZ)/granicy prążkowia lub do

1. mikroiniekcji LV LV
   1. Wybierz i wysterylizuj narzędzia potrzebne do operacji (skalpel, wiertło i mała pęseta).
   2. Znieczulenie 6-8 tygodniowej myszy poprzez dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie nadzorowanej przez weterynarza mieszaniny ketaminy i medetomidyny. Zważyć każde zwierzę i dozować każdemu z nich 50-75 mg ketaminy i 0,5-1 mg medetomidyny na kg masy ciała myszy (około 100-125 μl roztworu roboczego ketamina/medetomidyna na mysz).
   3. Oceń płaszczyznę znieczulenia, szczypiąc palce u stóp, ogon lub ucho i upewniając się, że zwierzę nie wykazuje żadnej reakcji.
   4. Po znieczuleniu myszy wstrzyknąć butorfanol podskórnie w końcowej dawce 0,4-0,5 mg na kg masy myszy, aby zminimalizować ból pooperacyjny.
   5. Ogol obszar między uszami i zdezynfekuj skórę za pomocą jodoforu, takiego jak jodopowidon lub 70% etanol. Oczyszczaj za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Uważaj, aby nie zmoczyć nadmiernie zwierzęcia, ponieważ może to nasilić hipotermię.
   6. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na ramie stereotaktycznej i ostrożnie przymocuj głowę za pomocą nauszników i podparcia podniebienia aparatu. Trzymaj mysz z poduszką grzewczą ustawioną na 37 °C i nałóż lubrykant okulistyczny na oczy.
   7. Wykonaj nacięcie o długości 1 cm na skórze głowy wzdłużnie za pomocą skalpela i delikatnie cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę za pomocą cienkiej pęsety.
   8. Ostrożnie oczyść powierzchnię kości sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką. Oczyść odsłoniętą kość czaszki z wszelkich pozostałych tkanek.
   9. Zamontuj wysterylizowaną strzykawkę na urządzeniu stereotaktycznym za pomocą uchwytu strzykawki.
   10. Przesuwaj uchwyt strzykawki wzdłuż osi x, y i z, aż końcówka igły strzykawki znajdzie się na bregmie, punkcie połączenia, w którym szew strzałkowy (podłużny i przyśrodkowy) jest prostopadłie przecięty przez szew koronalny (ryc. 1b). Upewnij się, że pozycja "zero" osi grzbietowo-brzusznej (DV) znajduje się na powierzchni czaszki w bregmie.
   11. Przesunąć strzykawkę do współrzędnych miejsca docelowego x i y (patrz Tabela 1 i Rysunek 1b).
   12. Opisz współrzędne miejsca docelowego x, y i z na skali noniusza, aby móc później wrócić do miejsca wstrzyknięcia. Zaznacz kość na współrzędnych x i y za pomocą markera chirurgicznego.
   13. Odsunąć strzykawkę od obszaru roboczego.
   14. Za pomocą wiertarki elektrycznej ostrożnie wykonaj otwór w czaszce, aby nie uszkodzić mózgu. Nie należy wiercić powierzchni mózgu, ponieważ może to spowodować uszkodzenie powierzchni mózgu.
   15. Załadować do strzykawki 1 μl 10⁶ TU/μl (jednostek indukcyjnych na mikrolitr) roztworu wirusa. Użyj ostrej, skośnej igły o rozmiarze 33, której końcówka ma kąt 10-12°. Ustawić igłę strzykawki pod kątem 90° w stosunku do powierzchni mózgu.
   16. Przesunąć strzykawkę z powrotem do miejsca wstrzyknięcia i przesunąć ją w dół, aż końcówka dotknie powierzchni strzykawki.
   17. Przeniknąć strzykawką do mózgu do współrzędnej z w osi DV.
   18. Zawiesinę wirusa należy powoli uwalniać z szybkością 0,2 μl/min, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki mózgowej spowodowane nadmiernym ciśnieniem płynu.
   19. Odczekaj 5-10 minut, aby zminimalizować cofanie się zawiesiny wirusa, a następnie bardzo powoli wycofaj strzykawkę.

Region wstrzyknięcia	Współrzędne
	Przednio-tylne (AP)	Przyśrodkowo-boczne (ML)	Grzbietowo-brzuszne (DV)
SEZ/granica prążkowia	+ 0,6 mm	+ 1,2	mm-3,0 mm
Komora boczna	- 0,3 mm	+ 1,0 mm	- 2,6 mm

< br / >

Tabela 1: Współrzędne stereotaktyczne dla wstrzyknięć. Dla osi przednio-tylnej (AP) i środkowo-bocznej (ML) współrzędne x i y są podane jako odległość (w mm) od bregmy. "-" oznacza "w kierunku tylnym". Dla współrzędnych DV "zero" to powierzchnia czaszki w punkcie bregma, a współrzędne DV wskazują odległość (w mm) w dół od tego punktu.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie różnych części procedury. a) Wytwarzanie lewej dawki do badań znakowania in vivo, począwszy od transfekcji ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T (HEK293T) odpowiednimi plazmidami w celu wytworzenia komórek LV, aż...

Materiały