Manipulacja komórkami płytki nerwowej poprzez nanoiniekcję in utero w embrionalnym modelu myszy

Streszczenie

Źródło: Mangold, K., H el. al., Mysia płytka nerwowa celowana przez nanoiniekcję in utero (NEPTUNE) w 7.5. dniu embrionalnym. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje metodę nanoiniekcji in utero do celowania w płytkę nerwową w embrionalnym modelu myszy. Roztwór lentiwirusowy o wysokim mianie jest wstrzykiwany do jamy owodniowej, gdzie integruje się z komórkami płytki nerwowej, umożliwiając stabilną manipulację genami na potrzeby badań neurorozwojowych i zastosowań terapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Iniekcje

UWAGA: Wszystkie narzędzia używane w tej procedurze są sterylizowane przed zabiegiem i między każdą myszką.

1. Znieczulij pierwszą samicę z ubytkami o idealnej wielkości.
2. Umieść i unieruchomij samicę na stole.
3. Nałóż żel pod oczy na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i wstrzyknij podskórnie środki przeciwbólowe.
   UWAGA: Zalecane leki przeciwbólowe: Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg masy ciała) lub fluniksyna (2,5 mg/kg) lub podobne zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Multimodalna analgezja okołooperacyjna jest utrzymywana za pomocą wstrzykiwanych leków przeciwbólowych i izofluranu.
4. Aseptycznie przygotuj dolną część brzucha, wycierając szmatką nasączoną 0,5 mg/ml roztworu chlorheksydyny (lub podobnego) i osusz skórę. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe nacięcie skóry w linii środkowej w dolnej części brzucha o długości 1,5-2,0 cm.
   UWAGA: Przygotuj obszar operacyjny zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami dezynfekcji.
5. Delikatnie unieś skórę i uwolnij skórę z leżącej poniżej warstwy mięśniowej, około 1 cm wokół miejsca nacięcia, aby ułatwić szycie po zabiegu.
6. Wykonaj pionowe nacięcie linii środkowej o długości 1 cm w warstwie mięśni.
7. Za pomocą kleszczy podnieś jedną stronę skóry i warstwy mięśni, a drugą parą poszukaj rogów macicy.
   UWAGA: Decyduy są ułożone jak koraliki na naszyjniku, podczas gdy jelito jest jedną długą, ciągłą rurką (ryc. 1A).
8. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyciągnij oba rogi macicy z brzucha. Trzymaj tkankę między zarodkami; nie ściskaj ich bezpośrednio (ryc. 1B).
   UWAGA: Macica jest przymocowana do ciała w szyjce macicy, a dwa jajniki/jajowody są połączone za pomocą więzadeł. Nie ciągnij/odłączaj macicy od tych punktów kotwiczenia.
9. Policz i zanotuj liczbę zarodków po lewej i prawej stronie.
10. Ponumeruj zarodki od jajnika do szyjki macicy lub od szyjki macicy do jajnika.
    UWAGA: Jest to szczególnie ważne, jeśli wstrzyknięte zarodki mają być pobierane w stadium embrionalnym.
11. Za pomocą wilgotnego bawełnianego wacika delikatnie wepchnij wszystkie zarodki z powrotem do jamy brzusznej, z wyjątkiem pierwszych trzech, które mają zostać wstrzyknięte.
12. Umieść kroplę PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) na gumce na szalce Petriego i przytrzymaj ją bezpośrednio nad zarodkami.
13. Włóż zamknięte kleszcze do nacięcia gumki i zwolnij kleszcze, aby otworzyć elastyczne nacięcie, aby płyn spadł na zarodki.
    UWAGA: Zapewnia to nawodnienie zarodków i przyleganie elastycznej błony do mokrej skóry samicy, zapobiegając wyciekowi PBS w kolejnych krokach.
14. Przeciągnij odcinek macicy, odpowiadający trzem zarodkom, przez gumkę za pomocą kleszczy i delikatnie przyłóż szalkę Petriego na brzuchu samicy.
15. Za pomocą kleszczy i wilgotnego bawełnianego wacika wyreguluj ułożenie macicy i gumkę, aby upewnić się, że gumka jest uszczelniona na skórze samicy, aby zapobiec wyciekowi PBS.
16. Użyj czterech glinianych nóżek, aby zabezpieczyć i przymocować szalkę Petriego bezpośrednio nad brzuchem, zmniejszając nacisk na samicę i wrażliwość obrazowania na oddech i bicie serca samicy.
17. Dociśnij cylinder z gliny modelarskiej po prawej stronie zarodków/macicy, aby zamocować macicę (ryc. 1C).
    UWAGA: Ta instrukcja orientacji zakłada, że igła znajduje się po lewej stronie samicy i że zarodki lewego rogu macicy samicy są odsłonięte. Strona macicy (lewy lub prawy róg macicy) jest kluczowa, ponieważ owodniowa (AC) jest skierowana w stronę igły (lewy róg; Rysunek 1D) lub zwrócony w stabilizujący gliniany cylinder (prawy róg; Rysunek 1E).
18. Aby wstrzyknąć zarodki z prawego rogu macicy, umieść gliniany cylinder po lewej stronie zarodków (ryc. 1F) i obróć stół grzewczy o 180° (ryc. 1G), aby uzyskać prawidłową orientację. Jeśli zamiast tego igłę można przesunąć, dostosuj ją odpowiednio do odpowiedniej konfiguracji.
19. Dodawać PBS do szalki Petriego, aż zarodki i macica zostaną pokryte PBS.
20. Opuść sondę ultrasonograficzną do PBS i wyreguluj mysz/stół chirurgiczny tak, aby pierwszy zarodek był wyrównany z sondą ultradźwiękową, aby ułatwić rejestrację wstrzyknięć.
    UWAGA: "Pierwszy" odnosi się do numeracji zarodków od jajnika do szyjki macicy.
21. Zeskanuj wszystkie trzy zarodki i sprawdź klimatyzacje. Określ objętość wstrzyknięcia w następujący sposób:
    1. Zmierz średnicę AC za pomocą ultrasonografu. Wstrzyknąć 69 nl, jeśli średnica AC wynosi ≤0,2 mm; wstrzyknąć 2 x 69 nL (= 138 nL), jeśli średnica AC wynosi >0,2 mm i ≤0,29 mm; i wstrzyknąć 3 x 69 nL (= 207 nL), jeśli średnica AC > 0,29 mm (Rysunek 1H).
       >UWAGA: Poprzednie eksperymenty wykazały, że objętości iniekcji do 207 nL są dobrze tolerowane przy E7,5. Udane wstrzyknięcia przy minimalnym wpływie na przeżycie osiąga się, gdy względny wzrost objętości AC nie przekracza 90%. Różnice w wielkości AC między rodzeństwem z miotu lub szczepami myszy są powszechne i mogą wymagać dalszej optymalizacji.
22. Ustaw objętości wtrysku za pomocą sterownika wtrysku.
23. Ustaw prędkość wtrysku na niską z szybkością wtrysku 23 nL/s.
    UWAGA: Różne modele urządzeń mogą powodować różne siły wtrysku.
24. Opuść igłę do PBS za pomocą głównych kół w systemie szyn (płaszczyzny x i z, Rysunek 1I) i naciśnij przycisk Opróżnij na sterowniku nanowtryskiwacza, aż płyn dotrze do końcówki igły.
    UWAGA: Jeśli igła jest zatkana, naciśnięcie przycisku Opróżnij może rozpuścić zator i/lub usunąć zator
.
25. Wyjąć igłę z PBS i nacisnąć przycisk Inject. Sprawdź, czy została rozładowana kropla o przybliżonej pożądanej objętości.
26. Opuść igłę do PBS i wyrównaj ją z sondą ultradźwiękową i zarodkiem, przesuwając nanowstrzykiwacz za pomocą koła płaszczyzny y na mikromanipulatorze (Rysunek 1J).
    UWAGA: Końcówka igły jest idealnie wyrównana, gdy pojawia się jako jasny punkt na obrazie ultrasonograficznym (Rysunek 1K, L). Za pomocą mikromanipulatora igłę można przesuwać we wszystkich trzech płaszczyznach kierunków.
27. Wyreguluj kąt igły za pomocą pokrętła kąta wstrzyknięcia, aby zapewnić prawie prostopadły kąt wstrzyknięcia względem ściany macicy. Wprowadzić igłę do prądu przemiennego jednym ruchem za pomocą pokrętła iniekcyjnego na mikromanipulatorze (Rysunek 1J-M). Zwracaj uwagę na jasność końcówki igły. Jeśli końcówka igły zniknie z obrazu ultrasonograficznego, przesuń sondę ultrasonograficzną do przodu lub do tyłu, aby przywrócić ostrość igły.
    UWAGA: Gdy igła znajdzie się w AC, można dokonać drobnych modyfikacji pozycji igły i ostrości bez szkody dla zarodka (regulacja w zakresie ~0,3 mm). Nie należy regulować położenia igły bardziej niż to.
28. Naciśnij przycisk Inject (dla 207 nL ustaw głośność na 69 nL i wstrzyknij trzy razy). Po wstrzyknięciu należy odczekać dodatkowe 5-10 sekund przed wycofaniem igły jednym delikatnym ruchem.
29. Przenieś etap do następnego zarodka i powtórz kroki 1.22-1.26 dla pozostałych dwóch zarodków, jeśli mają odpowiednie rozmiary AC.
30. Wyjmij sondę ultradźwiękową i igłę z PBS za pomocą mikromanipulatora. Obrócić igłę od operatora, aby uniknąć uszkodzeń i obrażeń.
31. Za pomocą kleszczy skieruj 1. i 2. zarodki z powrotem do brzucha samicy, delikatnie przepychając je przez gumkę. Delikatnie chwyć tkankę przylegającą do 3. zarodka i pociągnij macicę w kierunku górnego końca elastycznego nacięcia. Delikatnie podciągnij 4-6 zarodek za pomocą kleszczy i pozwól 3-mu zarodkowi ponownie wejść do jamy brzusznej.
    UWAGA: Ten krok można wykonać bez zmiany PBS lub usuwania szalki Petriego.
32. Powtarzaj w razie potrzeby, aż wszystkie zarodki z optymalnymi AC zostaną wstrzyknięte lub zostanie osiągnięty limit czasu.
33. Delikatnie wepchnij zarodki/macicę z powrotem do brzucha samicy.
34. Odessać PBS i usunąć szalkę Petriego. Jeśli wirus został użyty, należy go traktować jako odpad zakaźny.
35. Zszyj warstwę mięśniową za pomocą Vicryl (USP 6-0, długość igły 13 mm, 3/8 koła) w prostych szwach ciągłych lub przerywanych i zamknij skórę 1-2 klipsami (patrz Tabela materiałów).
36. Wyłączyć pompę izofluranu.
37. Usuń taśmę chirurgiczną i umieść samicę w pozycji leżącej (brzuchem do dołu) w czystej klatce na płycie grzewczej o temperaturze 40 °C.
    UWAGA: Oczekuje się, że samica odzyska przytomność i będzie mobilna w ciągu 10 minut. Upewnij się, że procedura została zakończona w ciągu 30 minut. Podłoże genetyczne, wiek i waga samicy mogą wpływać na wrażliwość na znieczulenie. Monitoruj myszy podczas operacji pod kątem oznak powolnego oddychania (powolny oddech oznacza, że znieczulenie jest zbyt głębokie) lub ruchu (znieczulenie jest zbyt lekkie). Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg masy ciała) lub fluniksyna (2,5 mg/kg mc.) lub podobne, zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, można w razie potrzeby podać 8 godzin po pierwszym wstrzyknięciu.
38. Jeśli ma zostać wstrzyknięta inna samica, należy przygotować obszar operacyjny, monitorując przebudzenie pierwszej.
    1. Przetrzyj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem, aby usunąć resztki krwi lub tkanek i sterylizuj je w podgrzewanym sterylizatorze szklanych kulek przez 10 sekund. Wyrzuć bawełniane waciki i użyj bibuły. Wytrzyj szalkę Petriego i kawałki gliny do sucha bibułą.
39. Powtarzać kroki 1.1-1.35, aż wszystkie samice zostaną wstrzyknięte.
40. Opróżnić igłę i wyrzucić.
    1. Jeśli w igle pozostał wirus lub roztwór do wstrzykiwań, naciśnij Empty na nanowstrzykiwaczu i opróżnij zawartość igły na bibułce.
    2. Całkowicie cofnij metalowy tłok, naciskając przycisk Fill, aż usłyszysz podwójny sygnał dźwiękowy ze sterownika, co oznacza, że tłok jest całkowicie cofnięty.
    3. Poluzuj tuleję zaciskową i zsuń igłę z metalowego tłoka. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre odpady.
41. Wyczyść ławkę BSL-2 (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2).
    1. Jeśli użyto wirusa, spryskaj całe pole operacyjne środkiem dezynfekującym (zobacz Tabelę Materiałów). Po 15 minutach zetrzyj środek dezynfekujący i oczyść całe pole operacyjne 70% etanolem. Jeśli nie użyto wirusa, wyczyść wszystkie powierzchnie 70% etanolem.
    2. Zetrzyj wszelkie pozostałe PBS z sondy ultradźwiękowej suchą, miękką, niestrzępiącą się bibułą.
42. Odpady należy wyrzucać zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
43. Wyłączyć ultrasonograf, stół grzewczy, ławkę BSL2 i zasilanie_O2.

Wyniki

Rysunek 1: Optymalna wielkość i orientacja jamy owodniowej dla udanych wstrzyknięć. (A) Róg macicy z wieloma decyduami E7,5, w kształcie sznura kulek (na dole) w porównaniu z jelitem grubym (na górze). (B) Chw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 mL Strzykawka	BD Bioscience	309628
27 G Igła	BD Bioscience	300635
3,5 cala kapilary	Drummond Scientific	3000203G/X	Były używane do wciągania igieł domowych
Przetwornik serii MS 70 MHz Visual	Sonics	MS700
Aquasonic przezroczysty żel ultradźwiękowy	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 myszy	Charles River, Niemcy	Crl:CD1(ICR)	Kobiety: od 8 tygodnia życiaMężczyźni: od 12 tygodnia życia
Wacik bawełniany	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Kleszcze opatrunkowe delikatne proste 13 cm	Agnthos	08-032-130
Klipsy EZ 9 mm	Angthos	59027	Klipsy
Nożyczki do tęczówki, Super Cut, proste, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Izofluoran	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Zakupiony w szwedzkiej aptece
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Taśma membranowa	Visual Sonics	SA-11053
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
Stół do obsługi myszy	Visual Sonics	50249
Zestaw automatycznego wtryskiwacza Nanoject II	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
szalka Petriego z centralnym otworem (niska ścianka)	Visual Sonics	SA-11620
szalka Petriego, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	środek dezynfekujący
Membrana silikonowa	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, sterylizator gorących koralików	Angthos	31100
Taśma chirurgiczna (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) System anestezjologiczny	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Imaging Station 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; Igła C-3, 45 cm fioletowy filament	Agnthos	J384H