Transfer genów do komórek Schwanna nerwu kulszowego gryzoni za pomocą elektroporacji

Streszczenie

Źródło: Ino, D. et al., Transfer genów in vivo do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje transfer genów in vivo do komórek Schwanna nerwu kulszowego gryzoni za pomocą elektroporacji. Do nerwu wstrzykuje się plazmidowy roztwór barwnika DNA, a impulsy elektryczne ułatwiają wejście DNA. DNA później integruje się z genomem komórki, umożliwiając pomyślny transfer genów w komórkach Schwanna.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie plazmidowego DNA

1. Generowanie plazmidów DNA do elektroporacji in vivo poprzez subklonowanie komplementarnego DNA (cDNA) lub sekwencji krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) do plazmidu ekspresyjnego dla komórek ssaków. Użyj natychmiastowego wczesnego wzmacniacza wirusa cytomegalii i plazmidu napędzanego przez promotor β i aktyny (CAG) kurczaka, ponieważ umożliwia to silną i stabilną ekspresję. Do ekspresji shRNA pod kontrolą promotora CAG należy użyć systemu kasetowego shRNA opartego na mir30 do subklonowania shRNA.
2. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu maxi-prep zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawieś DNA za pomocą soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (140 mM chlorek sodu, NaCl, 0,75 mM wodorofosforan disodowy, Na₂HPO₄, 25 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES); pH 7,40). Dostosuj stężenie DNA do ≥4 μg/μl.
3. Przygotować roztwór plazmidowego DNA o stężeniu 4 μg/μl i dodać minimalną ilość szybkiego zielonego barwnika (końcowe stężenie 0,01%) w celu oznaczenia miejsca wstrzyknięcia. Gdy wymagana jest jednoczesna elektroporacja wielu plazmidów, należy dostosować całkowite stężenie roztworu DNA plazmidu do 4 μg/μl.
   UWAGA: Optymalny skład DNA plazmidu należy określić zgodnie ze skutecznością transfekcji każdego plazmidu.

2. Sterylizacja narzędzi chirurgicznych i

1. narzędzi chirurgicznych w autoklawie soli fizjologicznej oraz 0,9% roztworu NaCl.

3. Przygotowanie szklanej mikropipety

1. Wyciągnij szklane pipety za pomocą ściągacza do pipet. Przyciąć końcówkę pipety do średnicy 30-50 μm. Użyj następujących parametrów: Ciepło, 600; Prędkość, 50; Czas, 75.

4. Chirurgia zwierząt, iniekcja DNA i elektroporacja

UWAGA: Przegląd tego kroku jest opisany na rysunku 1. Chociaż procedura dla szczeniąt szczurów jest opisana tutaj, metoda ta ma również zastosowanie do bardziej dojrzałych zwierząt stosujących tę samą procedurę.

1. Znieczulić szczura izofluranem w komorze indukcyjnej, aż zwierzę stanie się nieruchome, dostosowując przepływ tlenu do 0,4 l/min i stężenie izofluranu do 4% (obj./obj.). Wykonaj szczypanie palców u stóp, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie.
2. Umieść szczura na podgrzanym podgrzewaczu pod mikroskopem lornetkowym i utrzymuj znieczulenie, stale podając izofluran przez maskę na twarz. Dostosuj przepływ tlenu do 0,2 l/min, a stężenie izofluranu do 2% (vol/vol). Używaj kropli do oczu, aby zapobiec suchości oczu, jeśli oczy zwierzęcia są otwarte.
3. Przymocuj nogi taśmą chirurgiczną.
4. Oczyść skórę na tylnej części uda jodowidonem i wykonaj nacięcie skalpelem
   UWAGA: Ogolić miejsca chirurgiczne, jeśli są pokryte włosami.
5. Odsłoń nerw kulszowy, tworząc otwór między mięśniem czworogłowym uda a mięśniem dwugłowym uda za pomocą igieł do szycia.
6. Zwilż nerw 0,9% roztworem NaCl. Wchłoń nadmiar wody za pomocą niestrzępiącego się papieru.
7. Umieścić podstawę szklanej mikropipety na elastycznym wężu i wlać odpowiednią ilość roztworu DNA (co najmniej jeden mikrolitr) do mikropipety, delikatnie zasysając.
8. Podnieś odsłonięty nerw, delikatnie pociągając za dystalną stronę nerwu za pomocą igły.
   UWAGA: Nie napinaj nerwu, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne.
9. Wprowadzić szklaną mikropipetę do dystalnego miejsca na nerwie i wstrzyknąć roztwór DNA, wywierając nacisk (tj. wdmuchując w otwarty koniec elastycznej rurki). Roztwór DNA należy wstrzykiwać do momentu, gdy nerw stanie się zielony (maksymalnie 1 μl). Ze względu na to, że częste wkładanie mikropipety może spowodować uszkodzenie nerwu, nie należy wkładać mikropipety więcej niż dwa razy.
10. Umieść platynową elektrodę typu pęseta w odległości około 1-2 mm od nerwu. Wypełnij szczelinę między elektrodą a nerwem 0,9% roztworem NaCl.
    UWAGA: Nie trzymaj nerwu za elektrodę, aby uniknąć mechanicznego naprężenia nerwu.
11. Zastosować impulsy elektryczne w miejscu wstrzyknięcia za pomocą elektroporatora z elektrodą. Po pierwszym ustawieniu impulsu odwróć elektrodę i zastosuj kolejny zestaw impulsów. Użyj następujących parametrów: napięcie, 50 V; czas trwania impulsu, 5 ms; interwał impulsów, 100 ms; liczba impulsów, 4 razy.
12. Oczyść miejsce elektroporacji 0,9% roztworem NaCl.

5. Po elektroporacji

1. : Zamknij nacięcia klejem cyjanoakrylowym.
2. Po wyschnięciu kleju oczyść ranę jodonem powidonu.
3. Uwolnij szczeniaka z maski na twarz. Ogrzewaj szczeniaka na podgrzewaczu przez co najmniej godzinę, aby mógł w pełni zregenerować się po znieczuleniu.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat metody elektroporacji in vivo. Po pierwsze, odsłonięty jest nerw kulszowy znieczulonego szczura. Po drugie, plazmidowe DNA jest wstrzykiwane do nerwu kulszowego. Po trzecie, impulsy elektryczne są dostarczane do miejsca wstrzyknięcia pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Genopure plasmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Zestaw do oczyszczania plazmidowego DNA
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Barwnik do wstrzykiwań DNA
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Szkło kapilar
Rurka ssąca	Drummond	05-2000-00	Rurka ssąca do mikroiniekcji
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		do mikropipet
CUY21 Jednoogniwowy	BEX	CUY21 Jednokomórkowy	generator impulsów
Podgrzewacz elektryczny	KODEN	CAH-6A	Podgrzewacz podczas zabiegu
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Znieczulenie

Ściągacz elektroporator