Trwałe dostarczanie czynnika wzrostu nerwów za pomocą porowatego filmu krzemowego w komórkach guz chromochłonnego szczura 12

Streszczenie

Źródło: Rosenberg, M., et al. Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje zastosowanie degradowalnej nanostrukturalnej porowatej folii krzemowej (PSi) do przedłużonego uwalniania czynnika wzrostu nerwów (NGF) w celu wspierania różnicowania komórek PC12. NGF jest adsorbowany na porach folii poprzez oddziaływania elektrostatyczne i jest stopniowo uwalniany do mediów w wyniku dyfuzji i degradacji rusztowania. To kontrolowane dostarczanie sprzyja przeżyciu komórek PC12 i ułatwia wzrost i rozgałęzianie się neurytów przez dłuższy czas.

Protokół

1. Wytwarzanie utlenionych porowatych nośników krzemowych (PSiO₂)

1. Wytnij wafel krzemowy (Si) (jednostronnie polerowany na powierzchni <100> i mocno domieszkowany borem, typ p, 0,95 mΩ·cm) na próbki o średnicy 1,5 cm × 1,5 cm za pomocą pisaka z diamentową końcówką.
2. Próbki krzemu utleniać w piecu rurowym w temperaturze 400 °C przez 2 godziny w otaczającym powietrzu (szybkość ogrzewania: 25 °C/min, chłodzenie naturalne).
3. Zanurzyć próbki Si w roztworze wodnego kwasu fluorowodorowego (HF) (48%), podwójnie destylowanej wody (ddH₂O) i etanolu (99,9%) (1:1:3 v/v/v) na 5 minut; następnie trzykrotnie przepłukać próbki etanolem i wysuszyć pod strumieniem azotu.
   UWAGA: Roztwór HF należy przygotowywać i przechowywać wyłącznie w naczyniach z tworzywa sztucznego, ponieważ HF rozpuszcza szkło.
   UWAGA: HF jest cieczą silnie i należy obchodzić się z nią z najwyższą ostrożnością. W przypadku narażenia dokładnie spłukać wodą i potraktować dotknięty obszar żelem antidotum HF; Natychmiast wezwij pomoc medyczną.
4. Zamontuj próbkę Si w ogniwie trawiącym z politetrafluoroetylenu, używając paska folii aluminiowej jako styku wstecznego i cewki platynowej jako przeciwelektrody.
5. Wytrawić warstwę protektorową w roztworze wodnego roztworu HF i etanolu (99,9%) w stosunku 3:1 (v/v) przez 30 s przy stałej gęstości prądu 250 mA/^cm2; następnie spłukać powierzchnię powstałej folii PSi trzykrotnie etanolem i wysuszyć pod strumieniem azotu.
6. Rozpuścić świeżo wytrawioną warstwę porowatą w wodnym roztworze wodorotlenku sodu (NaOH) (0,1 M) przez 2 minuty. Następnie trzykrotnie spłucz etanolem i wysusz pod strumieniem azotu.
7. Zanurzyć próbkę w roztworze wodnego roztworu HF (48%),_ddH2O i etanolu (99,9%) (1:1:3 v/v) na 2 minuty. Następnie trzykrotnie spłucz etanolem i wysusz pod strumieniem azotu.
8. Elektrochemicznie wytrawić próbkę Si w roztworze wodnego roztworu HF i etanolu (99,9%) w stosunku 3:1 (v/v) przez 20 s przy stałej gęstości prądu 250 mA/^cm2; następnie trzykrotnie spłukać powierzchnię powstałej warstwy PSi etanolem i wysuszyć pod strumieniem azotu.
9. Świeżo wytrawione próbki PSi należy poddać termicznemu tlenieniu w piecu rurowym w temperaturze 800 °C przez 1 godzinę w otaczającym powietrzu (szybkość ogrzewania: 25 °C/min, naturalne chłodzenie) w celu utworzenia porowatego rusztowania SiO₂ (PSiO₂).
10. Próbki PSiO₂ należy wirować dodatnim grubym fotorezystem przy 4 000 obr./min przez 1 minutę, a następnie piec powlekane próbki w temperaturze 90 °C przez 2 minuty (szybkość nagrzewania: 5 °C/min, naturalne chłodzenie).
11. Próbki PSiO₂ pokrój w kostkę na próbki o średnicy 8 mm × 8 mm za pomocą piły do krojenia w kostkę.
12. Aby usunąć fotorezyst, namocz pokrojone w kostkę próbki w acetonie przez 3 godziny, a następnie dokładnie spłucz etanolem i wysusz pod strumieniem azotu.

2. Ładowanie PSiO₂ czynnikiem wzrostu nerwów (NGF)

1. Aby przygotować roztwór ładujący NGF, rozpuść 20 μg mysiego β-NGF w 400 μl roztworu 1:1 (v/v) 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ddH₂O.
2. Dodać 52 μl roztworu ładującego na próbkę PSiO₂ i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) w naczyniu z nakrętką.
   UWAGA: Utrzymuj wysoką wilgotność w naczyniu, aby zapobiec wysychaniu roztworu podczas inkubacji.
3. Zebrać roztwór na próbce w celu późniejszego ilościowego określenia zawartości NGF w nośniku PSiO₂.
   UWAGA: Ładowanie NGF do PSiO₂ należy przeprowadzić bezpośrednio przed zamierzonym użyciem; protokół nie może być tutaj wstrzymany ze względu na ryzyko wysuszenia i denaturacji białka.

3. Żywotność i wzrost komórek w obecności nosicieli PSiO₂ z NGF Hodowla komórkowa wirusa

1. pheochromocytoma szczura (PC12)
   1. Przygotuj podstawową pożywkę, dodając 10% surowicy końskiej (HS), 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki Roselle Park Medical Institute (RPMI).
   2. Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 1% HS, 1% L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki RPMI.
   3. Zawiesinę komórek (10-6 komórek) hodować w kolbie hodowlanej o średnicy 75^cm2 z 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej przez 8 dni; co 2 dni dodawać do kolby 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej.
   4. Aby wytworzyć zróżnicowaną hodowlę komórkową PC12, należy przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej; odwirowywać komórki przez 8 minut przy 200 x g i RT. Odrzucić supernatant.
   5. Zawiesić komórki w 5 ml świeżej podstawowej pożywki wzrostowej i ponownie odwirować komórki przez 5 minut przy 200 x g i RT; odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml podstawowej pożywki wzrostowej.
   6. Aby oddzielić skupiska komórek, należy je odessać dziesięć razy za pomocą strzykawki 23 G.
   7. Policz komórki za pomocą hemocytometru, licznika komórek i zasiej 10⁴ komórki/^cm2 obszar roboczy na płytkach pokrytych kolagenem typu I w obecności pożywki różnicującej.
   8. Po 24 godzinach dodaj świeży mysi β-NGF (50 ng/ml) lub nośnik PSiO₂ obciążony NGF na płytkę.
      >UWAGA: Wyższe stężenia NGF (>50 ng/ml) mają dokładnie taki sam efekt, jak określone stężenie.
   9. Odnawiaj pożywkę różnicującą co 2 dni.
   10. W celu oceny żywotności komórek dodać 10% (v/v) roztworu wskaźnika żywotności (na bazie resazuryny) w reprezentatywnych punktach czasowych i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C; zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm za pomocą spektrofotometru.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule Nazwa Firma Numer katalogowy Komentarze AcetonGadot830101375 AmfoterycynaPrzemysł biologiczny03-028-1B Wodny HF (48%)Merck101513 AZ4533 fotorezystorMetal Chem, Inc.AZ4533 Frakcja BSA vMP biomedicals216006950 roztwór BSA (10%)Biological Industries03-010-1B Kolagen typu lCorning Inc. 354236 CollagenaseEncoLS004176 Szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego powlekane kolagenemNUNC Thermanox1059846 D-(+)-glukozaSigma-Aldrich ChemicalsG8170 Dispase-IISigma-Aldrich Chemicals4942078001 Absolut etanolu (99,9%)Merck818760 FBSBiological Industries04-121-1A Guanidine-HClSigma-Aldrich ChemicalsG7294 Mieszanka odżywcza Ham's F-12Thermo Scientific11765054 HBSSThermo Scientific14185-045 HEPES (1M)Thermo Scientific15630-056 HSBiological Industries04-124-1A L-15 średniSigma-Aldrich ChemicalsL5520 LamininThermo Scientific23017015 L-glutaminaBiological Industries03-020-1A Mysi β-NGFPeprotech450-34-20 Normalny osioł surowica (NDS)Sigma-Aldrich ChemicalsG9023 PapainaSigma-Aldrich Chemicalsp-4762 PBS (pH 7,4) Przygotowana przez rozpuszczenie 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl w wodzie podwójnie destylowanej (ddH₂O, 18 MΩ·cm).PBS X10Biological Industries02-020-1A Linia komórkowa PC12ATCCCRL-1721 Penicylina–streptomycynaPrzemysł biologiczny03-032-1B Poli-L-lizynaSigma-Aldrich ChemicalsP4832 Odczynnik PrestoBlueThermo ScientificA13261 RPMI mediumBiological Industries01-100-1A Wafel SiSiltronix Corp. Wysoce domieszkowany B, typ p, rezystywność 0,00095 Ω cm, zorientowany na <100>Azydek soduSigma-Aldrich ChemicalsS2002 Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich ChemicalsS8045 Kwas garbnikowySigma-Aldrich Chemicals403040 Triton X-100Chem-Impex International Inc.Rok 1279