Artykuł metodologiczny

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2387

⸱

4 grudnia 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Streszczenie

W organizmach eukariotycznych messenger RNA (mRNA) jest transkrybowane w jądrze i musi zostać wyeksportowane do cytoplazmy, aby uzyskać dostęp do aparatu translacyjnego. Chociaż eksport jądrowy mRNA był szeroko badany w Xenopus oocytes1 oraz w organizmach podatnych na manipulacje genetyczne, takich jak drożdże2 i linia komórkowa S2 pochodząca z Drosophila3, przeprowadzono niewiele badań w komórkach ssaków. Ponadto kinetykę eksportu mRNA w somatycznych komórkach ssaków można było wnioskować jedynie pośrednio4,5. Aby zmierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA w hodowlach tkankowych ssaków, opracowaliśmy analizę wykorzystującą metodę mikroiniekcji w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH). Analizy te zostały wykorzystane do wykazania, że w komórkach ssaków większość cząsteczek mRNA jest eksportowana w sposób zależny od splicingu6,7 lub w sposób wymagający specyficznych sekwencji RNA, takich jak region kodujący sekwencję sygnałową (SSCR) 6. W tej analizie do komórek mikroiniekuje się mRNA syntetyzowane in vitro lub DNA plazmidowe zawierające interesujący gen. Mikroiniekowane komórki inkubuje się przez różne odstępy czasu, a następnie utrwala i ocenia subkomórkową lokalizację RNA za pomocą metody FISH. W przeciwieństwie do transfekcji, w której transkrypcja zachodzi kilka godzin po dodaniu kwasów nukleinowych, mikroiniekcja DNA lub mRNA umożliwia szybką ekspresję i pozwala na uzyskanie precyzyjnych danych kinetycznych.

Protokół

Istnieją dwie metody oparte na mikroiniekcji, które mogą być wykorzystane do pomiaru kinetyki eksportu mRNA w komórkach ssaków: iniekcja mRNA syntetyzowanego in vitro lub plazmidowego DNA, które jest transkrybowane in vivo do mRNA. Każda z tych technik ma swoje zalety i wady. Poniżej opisujemy obie techniki i omawiamy różnice między tymi dwoma podejściami.

1. Przygotowanie materiałów do wstrzyknięcia

  1. In vitro transkrybowany mRNA
    1. mRNA jest transkrybowane z plazmidów lub produktów PCR zawierających gen zainteresowania z odpowiednim promotorem polimerazy RNA (np. promotorami T7 lub SP6) położonym powyżej sekwencji genu. Transkrypcję przeprowadza się in vitro przy użyciu odpowiedniego enzymu (polimerazy RNA T7 lub SP6, Invitrogen) z odpowiednimi nukleotydami i nadmiarem analogu czapeczki.
    2. Transkrypty są poliadenylowane in vitro przy użyciu polimerazy poli-A (Invitrogen) i ATP zgodnie z protokołami producenta.
    3. Następnie mRNA jest oczyszczane przy użyciu kolumn firmy Invitrogen lub Qiagen.
    4. Wyeluowane mRNA są następnie wytrącane poprzez dodanie 1/20 objętości 3M octanu potasu oraz 2 objętości 10% etanolu w temperaturze -20°C przez jedną godzinę, a następnie centryfugowanie przy 13 0 g przy 4°C przez 30 min. W przypadku obecności nadmiaru cieczy osad można przemyć lodowatym 70% etanolem.
    5. Otrzymany osad mRNA należy wysuszyć na powietrzu, a następnie rozpuścić w buforze do iniekcji (140 mM KCl i 10 mM HEPES, pH 7,4). Należy pamiętać, że wszelkie zanieczyszczenia etanolem mogą być toksyczne dla komórki poddanej mikroiniekcji. Rozpuszczony mRNA można przechowywać w temperaturze -80°C do długoterminowego przechowywania.
    6. Do mikroiniekcji mRNA rozcieńcza się do 200μg/ml w buforze do iniekcji, a następnie zmieszano z dekstranem 70 kDa sprzężonym z Oregon Green 48 (OG) (1 mg/ml; Invitrogen). Ponieważ dekstran sprzężony z OG jest zbyt duży, aby dyfundować przez pory jądrowe, pozwoli to nie tylko na identyfikację iniekcyjnych komórek, ale pomoże również określić, jaka ilość cieczy została wstrzyknięta do jądra, a jaka przedostała się do cytoplazmy (patrz 4.1.2). Alternatywnie można zastosować dowolną fluorescencyjną cząsteczkę o wysokiej masie cząsteczkowej, która nie jest w stanie przeniknąć przez pory jądrowe.
    7. Próbki odwiruje się przy 13 0 g przez 4°C przez co najmniej 20 min przed nabraniem cieczy do igły, aby doprowadzić do sedymentacji wszelkich cząstek stałych, które mogłyby potencjalnie zablokować światło igły.
  2. Plazmidowe DNA
    1. Plazmidowe DNA zawierające geny zainteresowania można przygotować przy użyciu standardowych zestawów do oczyszczania DNA firmy Qiagen. Zazwyczaj większe preparaty DNA charakteryzują się wyższą jakością, a w konsekwencji są efektywniej transkrybowane po iniekcji.
    2. Plazmidowy DNA rozcieńcza się 50-krotnie do 200μg/ml w buforze do iniekcji zawierającym dekstran 70 kDa sprzężony z OG (1 mg/ml).
    3. Przed napełnieniem igły ciecz do wstrzykiwań należy odwirować przy 13 0 g przy 4°C przez co najmniej 20 min.
  3. Igły do mikroiniekcji
    1. Igły wykonuje się z kapilar borokrzemianowych o średnicy 1,0 mm (nr kat. 1B10F-3; World Precision Instruments Inc.), używając wyciągacza mikropipet Sutter p97 Flaming/Brown z filamentem o średnicy 2,5 mm.
    2. Igły do iniekcji są wytwarzane za pomocą trzystopniowego programu wyciągania z wykorzystaniem filamentu w przekroju kwadratowym o wymiarach 2,5x4,5 mm (nr kat. FB245B, Sutter Instrument Co.). Poniżej przedstawiono parametry programu zastosowane w tym doświadczeniu, jednak powinny one zostać zoptymalizowane dla każdego konkretnego filamentu.
      Krok nrCiepłoPociągnijPrędkośćCzasCiśnienie
      17401008250500
      27401008250500
      374010010250500

      (Temperatura rampowania=740)
  4. Przygotowanie komórek
    1. Zasadniczo każdą linię komórkową ssaków można poddać mikroiniekcji, jednak typy komórek, które wykazują tendencję do znacznego rozpłaszczania się, są zazwyczaj bardziej podatne na ten zabieg. Wybór linii komórkowej może również zależeć od innych czynników. Na przykład mRNA kodujące białka wydzielnicze są kierowane na powierzchnię retikulum endoplazmatycznego, co jest znacznie bardziej widoczne w komórkach COS-7 niż w fibroblastach NIH 3T3.6 (porównać lokalizację mRNA t-ftz-Δi na rycinach 3 i 4).
    2. Komórki należy wysiać na kwadratowe szkiełka podstawowe (25x25 mm) przemyte kwasem, umieszczone w szalkach Petriego o średnicy 30 mm, na co najmniej 24 godziny przed mikroiniekcją. W przypadku niektórych linii komórkowych rozprzestrzenianie się komórek można stymulować poprzez wysiewanie ich na szkiełka podstawowe pokryte fibronektyną.6,8W idealnym przypadku w momencie iniekcji monowarstwa komórkowa powinna osiągać konfluencję na poziomie około 70–90%.
    3. Aby umożliwić łatwą identyfikację wstrzykniętych komórek, przed iniekcją w monowarstwie komórkowej wykonuje się ranę za pomocą 200μl plastikowa końcówka do pipety. Zazwyczaj na szkiełku nakrywkowym wytrawia się krzyż (Rysunek 1), a komórki pozostawia się na co najmniej 15 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych w celu regeneracji przed wstrzyknięciem.
    4. Podczas mikrowstrzykiwania pożywka do hodowli tkankowej powoli traci CO22 do dyfuzji, w wyniku czego staje się zasadowe. Aby pomóc w utrzymaniu neutralnego pH podczas mikroiniekcji, do pożywki można dodać 10 mM HEPES o pH 7,4. Dodatkowy bufor można dodać do pożywki dzień przed mikroiniekcją.
  5. Mikroskop i mikromanipulator
    1. Komórki poddawano mikroiniekcji przy użyciu odwróconego mikroskopu ustawionego na stole pneumatycznym w celu zminimalizowania wibracji, które mogłyby zakłócić proces mikroiniekcji. Mikroskop wyposażono w dwa obiektywy: suchy obiektyw 10x, służący do pozycjonowania komórek i igły, oraz suchy obiektyw fazowy 40x o zwiększonej odległości roboczej, służący do obrazowania procesu mikroiniekcji.
    2. Aberracje optyczne powstające podczas obserwacji komórek przez szkiełko nakrywne i szalkę Petriego można wyeliminować, jeśli obiektyw posiada pierścień korekcyjny. Zapewnienie właściwego ustawienia pola jasnego mikroskopu dla oświetlenia Köhlera9pomoże również skorygować aberracje spowodowane rozproszeniem światła przez igłę wstrzykującą (patrz 2.2.4).
    3. Igła jest sterowana za pomocą trójosiowego wiszącego joysticka do mikromanipulacji (NT-88-V3MSH, Narishige). Manipulator gruby jest przymocowany do tylnego filaru mikroskopu, co pozwala na łatwe podnoszenie i opuszczanie igły do naczynia przy jednoczesnym zachowaniu jej pierwotnej pozycji.
    4. Igła jest przymocowana do uchwytu, który z kolei jest zakleszczony do manipulatora grubo nastawnego. Rurka łączy uchwyt z szklaną strzykawką o pojemności 5 ml (nr kat. 51231; Becton Dickinson), która wytwarza ciśnienie wtrysku niezbędne do wypchnięcia cieczy z końcówki igły do mikroiniekcji. Aby kontrolować poziom ciśnienia, korpus i tłok strzykawki są utrzymywane w pozycji przez regulator strzykawki, który składa się z dwóch korków, zacisku do rur (dostępnego w każdym sklepie z narzędziami) oraz dwóch metalowych klamer (rycina 2). Aby zapewnić utrzymanie wysokiego ciśnienia w strzykawce, do tłoka strzykawki nakłada się smar próżniowy (Dow Corning).
  6. Fluorescencyjna sonda hybrydyzacyjna
    1. Sekwencja pierwotna wstrzykniętego kwasu nukleynowego jest zwijana przy użyciu oprogramowania do przewidywania drugorzędowej struktury RNA, takiego jak RNAstructure 4.610.
    2. Struktury drugorzędowe mRNA są oceniane wizualnie w celu zidentyfikowania regionu o długości około 50 nukleotydów, który wykazuje tendencję do braku struktur drugorzędowych o wysokich temperaturach topnienia, takich jak długie pasma dwuniciowe.
    3. Rewersyjne komplementarną sekwencję tego regionu syntetyzuje się z fluorochromem Alexa546 przyłączonym do końca 5' sondy (produkty te można nabyć od Integrated DNA Technologies).
    4. Sondę rozcieńcza się wodą do stężenia 100μM i przechowywany w temperaturze -80°C przez 2-3 lata.

2. Mikrowstrzykiwanie do jądra komórkowego

  1. Załadowanie płynu do mikroiniekcji w mikroskopie do mikroiniekcji
    1. W przybliżeniu 1μl odpowiednią ilość cieczy do wtryskiwania pobiera się z odwirowanej próbki DNA lub mRNA, używając końcówek GELoader (Nr produktu 02351656; Epindorff). Ciecz należy aspirować z górnej części próbki, aby uniknąć naruszenia osadu, który zawiera cząstki mogące doprowadzić do zapchania igły.
    2. Koniec pipety wprowadza się do tylnego końca igły, a następnie wydaje się ciecz. Ciecz zostanie wciągnięta do wierzchołka igły pod wpływem działania kapilarnego, a w ciągu 5–30 s powinien pojawić się widoczny menisk w pobliżu wierzchołka.
    3. Wypełnioną cieczą igłę wprowadza się do uchwytu, który następnie mocuje się do mikromanipulatora w punktu 45° kąt
    4. Igłę wizualizuje się przy użyciu obiektywu 10x i pozycjonuje w centrum płaszczyzny widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowej, korzystając z pokręteł grubego mikromanipulatora. Następnie igłę unosi się o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w późniejszych etapach (2.2.2), po czym odsuwa się tylną kolumnę mikroskopu.
    5. Ciśnienie zwiększa się poprzez wciśnięcie tłoka o 0,5-2 cm³.
  2. Mikrowstrzykiwanie
    1. Szalkę Petri z szkiełkiem nakrywkowym, na którym znajduje się monowarstwa z zadaniem rany, umieszcza się na stole obserwacyjnym.
    2. Tylny filar mikroskopu jest przesuwany do przodu do pozycji pionowej, co powoduje wyrównanie kondensora i wprowadzenie igły do cieczy. Należy to wykonać ostrożnie, aby zapobiec złamaniu igły o szkiełko nakrywkę (patrz 2.1.4).
    3. Przy użyciu obiektywu 10x odnaleziono środek rany krzyżowej, a następnie umieszczono igłę nad komórkami przeznaczonymi do iniekcji.
    4. Powiększenie zwiększa się poprzez przełączenie na obiektyw 40x, a następnie igłę opuszcza się i centruje za pomocą pokręteł mikroregulacji na joysticku. Jeśli obraz jest nieostry, należy upewnić się, że światło padające jest odpowiednio ustawione (tj. poprzez zastosowanie oświetlenia Köhlera).9) przy użyciu soczewki Bertranda (patrz 1.5.2).
    5. Wstrzykiwanie należy rozpocząć w jednym narożniku krzyża rany i kontynuować wzdłuż jednej krawędzi, aby ułatwić identyfikację wstrzykniętych komórek podczas wizualizacji (patrz Rycina 1).
    6. Igłę obniża się tak, aby nawiązać kontakt z jądrem komórkowym. O tym, że komórka została poddana iniekcji, można łatwo przekonać się po wyraźnej zmianie jasności obrazu w kontraście fazowym, która towarzyszy temu procesowi.
    7. Jeśli ciecz wypełni całą komórkę, może to wskazywać na zbyt wysokie ciśnienie, które należy obniżyć.
    8. Jeśli nie zostanie wykryta zmiana jasności fazowej, może to wskazywać na to, że ciśnienie mikroiniekcyjne jest niewystarczające do przebicia błony komórkowej lub że końcówka igły jest zapchana. Może być to wynik szeregu problemów, w tym: niewystarczającego ciśnienia, niedoskonałości igły oraz zablokowania końcówki igły przez drobne cząsteczki. Ponieważ załadowanie każdej igły do mikromanipulatora jest czasochłonne, a podłoże do iniekcji jest często bardzo cenne, ważne jest, aby zmaksymalizować odsetek igieł, które można efektywnie wykorzystać do iniekcji. Poniżej znajduje się instrukcja krok po kroku dotycząca prób udrożnienia zapchanej końcówki igły. Po każdym kroku należy spróbować wykonać iniekcję w 2–3 komórkach, aby ocenić, czy niedrożność została usunięta:
       DziałanieCel i zadanie
      1Ustaw ostrość obrazu, aby widoczna była długość końcówki igły.Aby ustalić, czy igła posiada wyraźną wadę lub czy w jej końcówce znajduje się duża cząstka zanieczyszczenia powodująca zator.
      2Umieść końcówkę igły obok pływającej cząsteczki w szalce.Jeśli ciecz wypływa z końcówki, powinna ona wprawić cząstkę w ruch bez bezpośredniego kontaktu cząstki z igłą.
      3Docisnąć tłok do samego końca strzykawkiTen tymczasowy wzrost ciśnienia powinien usunąć wszelkie zatory w końcówce. Po zwolnieniu tłoka powinien on powrócić samodzielnie; jeśli tak się nie stanie, oznacza to, że w strzykawce nie wytwarza się ciśnienie i należy dokręcić połączenia i/lub dodać dodatkową smar próżniową.
      4Wyciągnij igłę z pożywki komórkowejSiła towarzysząca wyciąganiu igły z medium wodnego może pomóc w usunięciu zatorów znajdujących się na końcówce igły.
      5Całkowicie wyjmij tłok ze strzykawki, a następnie ponownie go włóż.Może być wymagane to dodatkowe zwiększenie ciśnienia w celu udrożnienia końcówki igły.
      6Przesuń końcówkę igły po czystym fragmencie szkiełka nakrywkowegoDalsze działanie to intensyfikuje ruch cząstek wewnątrz igły i pomaga w ich przemieszczeniu, co pozwala usunąć zator z jej końcówki. Silniejsze drapanie może spowodować odpryśnięcie końca igły, umożliwiając tym samym wydostanie się zatoru z jej wnętrza.
      7Załaduj nową igłę 


      Kolejnym częstym problemem jest stopniowy spadek ciśnienia wewnątrz igły, co wymaga częstej kompensacji poprzez dalsze dociskanie tłoka strzykawki. Często pomocne w utrzymaniu bardziej stałego ciśnienia może być dodanie dodatkowej smaru próżniowego do tłoka strzykawki. Problem ten może jednak wynikać z nieszczelności połączeń między strzykawką a rurką, rurką a końcówką (wand) lub końcówką a igłą. Większość wycieków powietrza można uszczelnić za pomocą Parafilmu (Fisher) lub smaru, jeśli jest to konieczne, choć nieszczelności między końcówką a igłą można usunąć jedynie poprzez wymianę uszczelki gumowej w końcówce.
    9. Komórki wzdłuż krawędzi rany poddawane są mikroiniekcji w ustalonym przedziale czasowym (10–15 min). Dzięki wprawie w tym czasie można przeprowadzić iniekcję do kilkuset komórek.
    10. Po mikroiniekcji komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek przez pożądany czas przed utrwaleniem. W przypadku wstrzykiwania DNA transkrypcję przerywa się po 20 minutach poprzez traktowanie komórek α-amanityną (1μg/ml; Sigma-Aldrich) rozpuszczony w pożywce wzrostowej. Stężenie to skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcyjnego plazmidu (Rysunek 3).
    11. Pojedynczą igłę można wykorzystać do iniekcji do wielu szkiełek cover-slip, choć należy ją wymienić przy zmianie rodzaju mikroiniekcyjnego DNA lub RNA. Po zdjęciu igły z uchwytu (wand) należy ją zutylizować i nie używać ponownie.
    12. Martwe lub pływające komórki mogą sporadycznie przyklejać się do końcówki igły, co może utrudniać mikroiniekcję. Aby usunąć te zanieczyszczenia z igły, należy wysunąć ją z cieczy, odsuwając filar, a następnie powoli ponownie wprowadzić igłę do cieczy, przywracając filar do pozycji pionowej.
    13. Aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA, należy utrwalić oddzielne próbki w czasie 0 min, 15 min, 30 min, 60 min i 120 min po mikrowstrzyknięciu RNA lub po zastosowaniu α-amanityny.

3. Fixacja i barwienie komórek

  1. Fiksacja i permeabilizacja komórek
    1. W odpowiednim czasie aspiruje się pożywkę wzrostową, a komórki przemywa się dwukrotnie 2 ml roztworu PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7,4). Ważne jest, aby utrzymać wilgotność szkiełek coverglass, minimalizując czas, w którym nie są one zanurzone w cieczy.
    2. Komórki fiksuje się poprzez dodanie 2 ml 4% paraformaldehydu (Electron Microscope Sciences) w PBS przez co najmniej 15 min w temperaturze pokojowej.
    3. Ufiksowane próbki przemywa się dwukrotnie roztworem PBS.
    4. Komórki permeabilizuje się 2 ml 0,1% Triton X-10 w PBS przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Próbki przemywa się dwukrotnie roztworem PBS.
  2. Barwienie FISH
    1. Następnie próbki należy przygotować do hybrydyzacji. Komórki przemywa się dwukrotnie roztworem 1x SSC (150mM NaCl, 15mM cytrynianu sodu, pH 7,0) z dodatkiem 25-60% formamidem. W przypadku stężenia formamidu należy zastosować taką samą koncentrację, jaka występuje w roztworze do hybrydyzacji (patrz 3.2.3).
    2. Aby przygotować komorę barwiącą, dno 150mm szalki Petriego pokrywa się wodą, a na powierzchni wody układa się kawałek Parafilmu. Wodę usuwa się, odwracając szalkę, co pozwala Parafilmowi przywrzeć do dna naczynia. Pęcherzyki powietrza usuwa się ręcznie.
    3. Dla każdego barwionego szkiełka coverglass na Parafilm nanosi się pipetą krople 10μl roztworu do hybrydyzacji (25-60% formamid, 10mg/ml siarczanu dekstranu, 1mg/ml tRNA E. coli, 5mM kompleksu rybosydowo-wanadylu w 1x SSC z sondą rozcieńczoną 1:50). Należy pamiętać, że ilość formamidu powinna być zoptymalizowana dla konkretnej stosowanej sondy FISH.
    4. Za pomocą pęsety wyjmuje się szkiełko coverglass z 30mm szalki Petriego, następnie za pomocą papieru filtracyjnego Whatman (VWR) osusza się stronę tylną (wolną od komórek), a z drugiej strony odsącza nadmiar buforu, nie dopuszczając do wyschnięcia ufiksowanych komórek. Następnie szkiełko kładzie się stroną komórek do dołu na roztwór FISH. Czynność tę powtarza się dla każdego szkiełka.
    5. Po ponownym nałożeniu pokrywy komory barwiącej, próbki inkubuje się przez 5-18 h w temperaturze 37°C.
  3. Przemywanie i montowanie zabarwionych próbek
    1. Kilka komór płuczących przygotowuje się w ten sam sposób, co komorę barwiącą (patrz 3.2.2).
    2. Dla każdego szkiełka coverglass na Parafilm w komorze płuczącej nanosi się 1 ml buforu do przemywania (1x SCC z 25-60% formamidem). Ponownie należy zastosować takie samo stężenie formamidu, jakie występuje w roztworze do hybrydyzacji (patrz 3.2.3).
    3. Aby wyjąć szkiełka coverglass z komory barwiącej, obok szkiełka nanosi się 1 ml buforu do przemywania. Ciecz powinna zostać wciągnięta pod każdą próbkę dzięki działaniu kapilarnemu.
    4. Za pomocą pęsety wyjmuje się szkiełka i każde z nich kładzie na kroplę buforu do przemywania, inkubując w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    5. Kroki 3.3.2 do 3.3.4 powtarza się jeszcze dwukrotnie, tak aby każde szkiełko zostało przemyte łącznie 3 razy.
    6. Jeśli RNA ma być współbarwione z jakimś białkiem za pomocą immunofluorescencji, należy przejść do sekcji 3.4.
    7. Preparaty przemywa się 70% etanolem i osusza chusteczkami Kimwipes. Na każde szkiełko coverglass nanosi się 10-30 μl medium montażowego z DAPI (Fluoromount G, Southern Biotech). Na jednym szkiełku można zamontować dwa coverglassy.
    8. Za pomocą pęsety i papieru filtracyjnego Whatman osusza się tył szkiełka coverglass i odsącza nadmiar cieczy z frontu szkiełka, nie wysuszając próbek. Następnie każde szkiełko kładzie się stroną komórek dołu na kroplę medium montażowego.
    9. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze 4°C.
  4. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Próbki należy przemyć dwukrotnie PBS, aby usunąć formamid, który może zakłócać prawidłowe barwienie przeciwciałami.
    2. Dla każdego szkiełka coverglass na Parafilm w komorze płuczącej nanosi się 50μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych (1,0μg/ml przeciwciał, 0,1% TX-10, 0,1mg/ml BSA wolnego od RNaz w PBS).
    3. Za pomocą pęsety szkiełka coverglass kładzie się stroną komórek dołu na roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    4. Dla każdego szkiełka coverglass na Parafilm w komorze płuczącej nanosi się dwie krople po 1 ml PBS.
    5. Aby wyjąć szkiełka coverglass z roztworu barwiącego przeciwciałami, obok szkiełka nanosi się 1 ml PBS. Ciecz powinna zostać wciągnięta pod każdą próbkę dzięki działaniu kapilarnemu.
    6. Za pomocą pęsety wyjmuje się szkiełka i każde z nich kładzie na pierwszą kroplę PBS na 5 min, a następnie na drugą kroplę PBS na kolejne 5 min.
    7. Kroki 3.4.2 do 3.4.6 powtarza się, używając roztworu fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych (1,0μg/ml przeciwciał, 0,1% TX-10, 0,1mg/ml BSA w PBS). Należy zwrócić uwagę, że ponieważ marker iniekcyjny i RNA są widoczne w kanale zielonym i czerwonym, przeciwciało wtórne musi być sprzężone z odpowiednim barwnikiem, np. Alexa647.
    8. Szkiełka coverglass montuje się zgodnie z opisem w punkcie 3.3.7.

4. Obrazowanie i kwantyfikacja

  1. Obrazowanie
    1. Do obrazowania komórek po wstrzyknięciu wykorzystuje się mikroskop epifluorescencyjny. Wstrzyknięte komórki można zlokalizować, odnajdując miejsca nacięć poprzecznych i identyfikując komórki zawierające wstrzyknięty znacznik (dekstran OG).
    2. Dla każdej obserwowanej komórki wykonuje się zdjęcie wstrzykniętego dekstranu OG. Podczas obrazowania mikroiniekcyjnego mRNA ważne jest, aby analiza ilościowa ograniczała się do komórek, które otrzymały >90% wstrzykniętej cieczy (tj. dekstranu) do jądra.
    3. Następnie wykonuje się obrazowanie RNA. Aby umożliwić dokładny pomiar RNA, czas ekspozycji dla wszystkich komórek w danym przebiegu czasowym powinien pozostać stały i mieścić się w zakresie dynamicznym kamery. Idealnie każdy obraz powinien zawierać komórkę niepoddaną iniekcji, aby można było prawidłowo obliczyć intensywność fluorescencji tła (patrz 4.2.4).
    4. Aby ułatwić kwantyfikację, można również pozyskać obraz barwienia DAPI. Jeśli przeprowadzono immunofluorescencję, można również zobrazować zabarwione białko. Przykład rozmieszczenia mRNA w różnych punktach czasowych przedstawiono na rysunku 4. mRNA koduje białko wydzielnicze, w związku z czym w komórkach COS-7 jest ono kierowane do retikulum endoplazmatycznego (ER). Należy zauważyć, że ukierunkowanie na ER zweryfikowano poprzez wspólne barwienie RNA i przeciwciał białka TRAPα, będącego białkiem rezydentnym ER.11.
  2. Ilościowe oznaczenie

    Można to osiągnąć za pomocą wielu różnych pakietów oprogramowania do analizy obrazu. Oprogramowanie ImageJ dobrze nadaje się do ilościowego określania rozkładu komórkowego mRNA, ponieważ umożliwia ręczne oddzielenie frakcji jądrowej od cytoplazmatycznej, pozwala na pomiar średniej fluorescencji tych frakcji, a uzyskane dane można łatwo kopiować i wklejać do innego oprogramowania, takiego jak Microsoft Excel.
    1. Obrazy odpowiadające fluorescencji FISH, dekstranu OG oraz DAPI są otwierane i łączone przy użyciu narzędzia Images to Stack.
    2. W warstwie DAPI lub dekstranu narzędzie Threshold jest wykorzystywane do wyizolowania obszaru odpowiadającego mikroiniekcyjnemu jądru. Część ta jest zaznaczana za pomocą narzędzia Wand, a po przejściu do warstwy FISH obszar (ANuc) oraz średnia intensywność (FNuc) rejestruje się przy użyciu narzędzia pomiarowego (Measure tool).
    3. Obrys komórki wyznacza się za pomocą narzędzia Freehand selection, a następnie, będąc na warstwie FISH, obszar (ATot) oraz średnia intensywność (FTot) rejestruje się za pomocą narzędzia Measure. Jeśli fluorescencja komórki jest znacznie intensywniejsza niż tło, do obrysowania wybranej komórki zamiast narzędzia Freehand selection można użyć narzędzia Threshold.
    4. Za pomocą funkcji zaznaczania prostokątnego (Rectangular selection) rysuje się ramkę wokół niezastrzykniętej komórki, a średnia intensywność (FPowrót) zostaje zarejestrowane.
    5. Wszystkie pomiary zostają skopiowane do arkusza programu Excel.
    6. Ilość wyeksportowanego mRNA oblicza się według następującego równania:
      Wzór na procentowy eksport w równaniu stanu równowagi statycznej dla analizy naukowej.
      ANucPole powierzchni jądra komórkowego
      ATotPowierzchnia całej komórki
      FNucŚrednia fluorescencja frakcji jądrowej
      FTotŚrednia fluorescencja frakcji całych komórek
      FWsteczŚrednia fluorescencja komórki nietransfekowanej

      Dla każdego punktu czasowego oblicza się średni procent eksportu (%Export), a następnie przedstawia go na wykresie w funkcji czasu.
    7. Stabilność mRNA oblicza się poprzez wykreślenie średniej całkowitej fluorescencji mRNA (ATot x (FTot - FPowrótz upływem czasu. Zazwyczaj stwierdzamy, że ilość mRNA znacznie różni się pomiędzy komórkami oraz pomiędzy szkiełkami podstawowymi. Może to wynikać z niespójności w szybkości przepływu w igle oraz z różnic w efektywności barwienia FISH.

Schemat procesu gojenia ran; igła tworząca ranę w monowarstwie komórkowej do badania migracji.
Rysunek 1. Szkiełko nakrywowe do mikoiniekcji. Komórki hoduje się do uzyskania 70-90% konfluencji, a następnie nanosi się rany w pionie i w poziomie za pomocą 200μl plastikowa końcówka pipety. Zaczynając od nacięcia krzyżowego, komórki wstrzykuje się wzdłuż krawędzi jednego z nacięć (strzałka).

Schemat montażu szklanej strzykawki; układ doświadczalny do wstrzykiwania cieczy przez gumowe stopry.
Rysunek 2. Regulator strzykawkowy. A) Schemat blokowy przedstawiający sposób montażu regulatora strzykawkowego. B) Schemat zmontowanego urządzenia. C) Zdjęcie zmontowanego regulatora strzykawkowego.

Mikroskopia fluorescencyjna, pobieranie OG-dekstranu, efekt α-amanityny, analiza ekspresji mRNA.
Rycina 3. Wpływ $\alpha$-amanityny na transkrypcję wstrzykniętego plazmidowego DNA. Komórki fibroblastów NIH3T3, uprzednio poddane działaniu różnych stężeń $\alpha$-amanityny, zostały wstrzyknięte z plazmidowym DNA t-ftz-$\Delta$i oraz koniugatem dekstranu 70kD z OG. Wstrzyknięte komórki inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, a następnie utrwalono i zabarwiono pod kątem mRNA t-ftz-Δi przy użyciu specyficznej sondy FISH6. Każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia obrazowanemu pod kątem dekstranu OG-70kDa oraz mRNA t-ftz-Δi. Należy zauważyć, że wysokie, ale nie niskie stężenia leku całkowicie zahamowały produkcję transkryptu t-ftz-Δi. Pasek skali = 15μm.

Mikroskopia poklatkowa lokalizacji OG-Dekstranu, mRNA oraz TRAPα; analiza transportu komórkowego.
Obrazowanie komórkowe mRNA t-ftz-Δi oraz TRAPα; analiza mikroskopowa; znakowanie fluorescencyjne.
Rysunek 4. Przebieg czasowy eksportu jądrowego mRNA. Do komórek COS-7 wstrzyknięto plazmidowe DNA t-ftz-Δi oraz dekstran 70 kD sprzężony z OG. 30 minut po iniekcji komórki poddano działaniu α-amanityny i inkubowano w 37°C dla wskazanych punktów czasowych. Komórki następnie utrwalono i poddano barwieniu sondą przeciwko mRNA t-ftz-Δi oraz przeciwciałami przeciwko markerowi retikulum endoplazmatycznego (ER) TRAPα. Każdy rząd odpowiada pojedynczemu polu komórek. A) Rozkład mRNA w zależności od czasu po mikroiniekcji. B) Powiększenie punktu czasowego 120 min z (A), wykazujące kolokalizację mRNA t-ftz-Δi i ER. Na prawym panelu przedstawiono nałożenie barwienia mRNA t-ftz-Δi (zielone) i TRAPα (czerwone). Paski skali = 15μm.

Dyskusja

Mikroiniekcja jest potężnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania wielu różnych procesów komórkowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnej transfekcji komórek, mikroiniekcja pozwala badaczowi na efektywne wprowadzenie kwasów nukleinowych do jąder komórkowych w bardzo krótkim przedziale czasowym. W rezultacie możliwe jest przeprowadzenie analiz kinetycznych, takich jak określanie szybkości eksportu mRNA, lokalizacji mRNA oraz syntezy białek. Ponadto, ze względu na stosunkowo krótki czas trwania eksperymentu, można poddawać komórki działaniu związków toksycznych przez krótkie okresy bez wywoływania efektów plejotropowych. Co więcej, wraz z kwasami nukleinowymi można wstrzyknąć związki hamujące lub stymulujące, takie jak białka dominująco negatywne. Wreszcie, mikroiniekcje eliminują konieczność stosowania odczynników do transfekcji, które są często toksyczne dla komórek i mogą zaburzać różne funkcje komórkowe.

Iniekcje mRNA w porównaniu do iniekcji plazmidowego DNA

Wybór kwasu nukleinowego do iniekcji będzie zależał od szeregu rozważań. Po iniekcji plazmidowego DNA polimeraza RNA II nie tylko syntetyzuje mRNA, ale także rekrutuje czynniki białkowe do powstającego transkryptu.12,13Ponieważ czynniki te sterują takimi zdarzeniami, jak procesing mRNA, eksport jądrowy i lokalizacja cytoplazmatyczna, iniekcje DNA plazmidowego mogą być wykorzystywane do oceny, w jaki sposób transkrypcja jest sprzężona z procesami w następnych etapach. Chociaż transkrypcja może być sprzężona z eksportem jądrowym14stwierdziliśmy, że wstrzyknięty mRNA jest eksportowany nieco szybciej niż in vivo transkrybowane mRNA6Przyczyny tego stanu rzeczy nie są obecnie jasne, jednak wynik ten może sugerować, że w miarę jak nowo syntetyzowany mRNA wydostaje się z polimerazy RNA II, może on być związany w kompleksach, które opóźniają eksport jądrowy.

Iniekcje mRNA oferują pewne zalety. Po pierwsze, badacz nie musi stosować inhibitorów polimerazy RNA, co mogłoby wpłynąć na sposób, w jaki komórki regulują ogólny metabolizm RNA. Po drugie, RNA może zostać zmodyfikowane in vitro przed iniekcją. Na przykład mRNA można syntetyzować z różnymi analogami czapeczki 5' lub o różnej długości ogonów poly(A), aby ocenić, jak te cechy wpływają na eksport jądrowy6. Po trzecie, można w przybliżeniu oszacować dokładną ilość wstrzykniętego RNA. Postępując zgodnie z powyższym protokołem, szacujemy, że do każdego jądra wstrzykniętych zostaje około 20 000 do 50 000 cząsteczek, co jest wartością stosunkowo niską w porównaniu z całkowitą liczbą transkryptów w typowej komórce ssaka (400 000 do 850 000 cząsteczek)15. Główną wadą iniekcji mRNA jest to, że podczas mikroiniekcji nieunikniony jest pewien wyciek płynu do cytoplazmy. Ponieważ mRNA wstrzyknięte bezpośrednio do cytoplazmy pozostaje stabilne przez długi czas (A. Palazzo, nieopublikowana obserwacja), należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze komórek do analizy ilościowej. Zazwyczaj analizujemy komórki, które otrzymały >90% płynu iniekcyjnego w jądrze, co oceniamy na podstawie rozkładu OG-dekstranu.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy E. Gomes za pomocne rady oraz A. Wilde za umożliwienie korzystania z różnego sprzętu. Praca ta była finansowana z grantu przyznanego A.F.P. przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (Canadian Institute for Health Research, FRN 102725).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor do iniekcjiSigma-Aldrich140 mM KCl i 10 mM HEPES, pH 7.4
Dekstran Oregon Green 488-70kDInvitrogenD7173Roztwór stokowy o stężeniu 10mg/ml w buforze do iniekcji może być przechowywany przez dłuższy czas w temperaturze -80°C
Kapilary borokrzemianoweWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
Grotki do pipet do nakładania żelu do napełniania igieł iniekcyjnychEppendorf022351656
MikroskopNikon InstrumentsEclipse Ti-S
MikromanipulatorNarishige InternationalNT-88-V3MSH
Strzykawka do iniekcjiBD Biosciences512311
Bufor PBSSigma-Aldrich137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
Bufor SSCSigma-Aldrich150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodu, pH 7.4
4% ParaformaldehydElectron Microscopy Sciences15686Roztwór stokowy 37% paraformaldehydu rozcieńczony w PBS
0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)Thermo Fisher Scientific, Inc.28314Roztwór stokowy 10% Triton X-100 rozcieńczony w PBS
FormamidFisher ScientificF84-1
Siarczan dekstranuFisher ScientificBP1585-100
E. coli tRNASigma-AldrichR1753
Kompleks wanadylu z rybosydem (VRC)Sigma-AldrichR3380
Papier filtracyjny WhatmanVWR international28298-020
Stół wibroizolacyjnyKinetic Systems5702E-3036-21
Fluoromount GSouthernBiotech0100-20
α-amanitynaSigma-AldrichA2263
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Wytrawiacz pipet Flaming/BrownSutter Instrument Co.P-97
Smar próżniowyDow Corning695400008
Polimeraza RNA T7New England BiolabsM0251S
Polimeraza Poly(A)AmbionAM1350
Bufor do hybrydyzacjiSigma-Aldrich100mg/ml siarczanu dekstranu, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM cytrynianu sodu, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamidu

Bibliografia

  1. Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
  2. Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
  3. Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
  4. Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
  5. Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
  6. Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
  7. Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
  8. Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
  9. Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
  10. Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
  11. Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
  12. Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
  13. Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
  14. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  15. Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test mikroiniekcyjnyfluorescencyjna hybrydyzacja in situhodowla tkanek ssaczychiniekcja plazmidowego DNAanaliza lokalizacji RNAilo ciowe oznaczanie fluorescencji cytoplazmatycznejtraktowanie alfa amanitynobrazowanie mikroskopowe w fluorescencji
Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.