Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Streszczenie

W organizmach eukariotycznych messenger RNA (mRNA) jest transkrybowane w jądrze i musi zostać wyeksportowane do cytoplazmy, aby uzyskać dostęp do aparatu translacyjnego. Chociaż eksport jądrowy mRNA był szeroko badany w Xenopus oocytes¹ oraz w organizmach podatnych na manipulacje genetyczne, takich jak drożdże² i linia komórkowa S2 pochodząca z Drosophila³, przeprowadzono niewiele badań w komórkach ssaków. Ponadto kinetykę eksportu mRNA w somatycznych komórkach ssaków można było wnioskować jedynie pośrednio^4,5. Aby zmierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA w hodowlach tkankowych ssaków, opracowaliśmy analizę wykorzystującą metodę mikroiniekcji w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH). Analizy te zostały wykorzystane do wykazania, że w komórkach ssaków większość cząsteczek mRNA jest eksportowana w sposób zależny od splicingu^6,7 lub w sposób wymagający specyficznych sekwencji RNA, takich jak region kodujący sekwencję sygnałową (SSCR) ⁶. W tej analizie do komórek mikroiniekuje się mRNA syntetyzowane in vitro lub DNA plazmidowe zawierające interesujący gen. Mikroiniekowane komórki inkubuje się przez różne odstępy czasu, a następnie utrwala i ocenia subkomórkową lokalizację RNA za pomocą metody FISH. W przeciwieństwie do transfekcji, w której transkrypcja zachodzi kilka godzin po dodaniu kwasów nukleinowych, mikroiniekcja DNA lub mRNA umożliwia szybką ekspresję i pozwala na uzyskanie precyzyjnych danych kinetycznych.

Protokół

Istnieją dwie metody oparte na mikroiniekcji, które mogą być wykorzystane do pomiaru kinetyki eksportu mRNA w komórkach ssaków: iniekcja mRNA syntetyzowanego in vitro lub iniekcja plazmidowego DNA, który jest transkrybowany in vivo do mRNA. Każda z tych technik ma swoje zalety i wady. W niniejszym opracowaniu opisujemy obie techniki i omawiamy różnice między tymi dwoma podejściami.

1. Przygotowanie materiałów do iniekcji

1. mRNA transkrybowany in vitro
   1. mRNA jest transkrybowany z plazmidów lub produktów PCR zawierających badany gen, poprzedzony odpowiednim promotorem polimerazy RNA (np. promotorami T7 lub SP6). Transkrypcję przeprowadza się in vitro przy użyciu odpowiedniego enzymu (polimerazy RNA T7 lub SP6, Invitrogen) z zastosowaniem odpowiednich nukleotydów i nadmiaru analogu czapeczki.
   2. Transkrypty są poliadenylowane in vitro przy użyciu polimerazy Poly-A (Invitrogen) i ATP zgodnie z protokołami producenta.
   3. Następnie mRNA jest oczyszczane przy użyciu kolumienek firmy Invitrogen lub Qiagen.
   4. Eluowane mRNA jest następnie wytrącane poprzez dodanie 1/20 objętości 3M octanu potasu i 2 objętości 100% etanolu w temperaturze -20°C przez jedną godzinę, a następnie wirowane przy 13,000g w temperaturze 4°C przez 30min. Jeśli obecna jest nadmiarowa ciecz, osad można przemyć lodowatym 70% etanolem.
   5. Otrzymany osad mRNA jest suszony na powietrzu, a następnie rozpuszczany w buforze do iniekcji (140mM KCl i 10mM HEPES, pH 7.4). Należy pamiętać, że wszelkie zanieczyszczenia etanolem mogą być toksyczne dla komórki poddanej mikroiniekcji. Rozpuszczone mRNA można przechowywać w temperaturze -80°C do długotrwałego przechowywania.
   6. Do mikroiniekcji mRNA rozcieńcza się do stężenia 200μg/ml w buforze do iniekcji i miesza z dekstranem 70kDa sprzężonym z Oregon Green 488 (OG) (1mg/ml; Invitrogen). Ponieważ dekstran sprzężony z OG jest zbyt duży, aby dyfundować przez pory jądrowe, pozwoli to nie tylko na identyfikację iniektowanych komórek, ale także pomoże określić, jaka część cieczy została wstrzyknięta do jądra, a jaka wyciekła do cytoplazmy (patrz 4.1.2). Alternatywnie można zastosować dowolną fluorescencyjną cząsteczkę o wysokiej masie cząsteczkowej, która nie jest w stanie przejść przez pory jądrowe.
   7. Przed napełnieniem igły próbki są wirowane przy 13,000g w temperaturze 4°C przez co najmniej 20min, aby wytrącić wszelkie cząstki stałe, które mogłyby potencjalnie zablokować końcówkę igły.
2. DNA plazmidowe
   1. DNA plazmidowe zawierające badany gen można przygotować przy użyciu standardowych zestawów do oczyszczania DNA firmy Qiagen. Zazwyczaj większe preparaty DNA charakteryzują się wyższą jakością i są zatem efektywniej transkrybowane po iniekcji.
   2. DNA plazmidowe rozcieńcza się do stężenia 50-200μg/ml w buforze do iniekcji zawierającym dekstran 70 kDa sprzężony z OG (1mg/ml).
   3. Przed napełnieniem igły ciecz do iniekcji jest wirowana przy 13,000g w temperaturze 4°C przez co najmniej 20min.
3. Igły do mikroiniekcji
   1. Igły są wytwarzane z borokrzemianowych kapilar szklanych o średnicy 1,0mm (Nr kat. 1B100F-3; World Precision Instruments Inc.) przy użyciu wyciągarki do mikropipet Sutter p97 Flaming/Brown z filamentem 2,5mm.
   2. Igły do iniekcji są tworzone za pomocą trzystopniowego programu wyciągania z użyciem filamentu pudełkowego 2,5x4,5 mm (nr kat. FB245B, Sutter Instrument Co.). Parametry programu zastosowane w tym eksperymencie wymieniono poniżej, jednak powinny one zostać zoptymalizowane dla każdego filamentu.

      Krok nr	Grzanie	Wyciąganie	Prędkość	Czas	Ciśnienie
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (Temperatura rampy=740)
4. Przygotowanie komórek
   1. Zasadniczo każda linia komórek ssaków może zostać poddana mikroiniekcji, jednak typy komórek, które dobrze się rozpływają, są zazwyczaj bardziej podatne na iniekcję. Wybór linii komórkowej może zależeć również od innych czynników. Na przykład mRNA kodujące białka wydzielnicze są kierowane na powierzchnię retikulum endoplazmatycznego, co jest znacznie bardziej widoczne w komórkach COS-7 w porównaniu do fibroblastów NIH 3T3⁶ (porównać lokalizację mRNA t-ftz-Δi na rysunkach 3 i 4).
   2. Komórki powinny być wysiane na przemytych kwasem kwadratowych szkiełkach nakrywkowych (25x25mm) w szalkach Petriego 30mm przez co najmniej 24h przed mikroiniekcją. W niektórych liniach komórkowych rozpływanie można stymulować poprzez wysiewanie komórek na szkiełka pokryte fibronektyną^6,8. Idealnie monowarstwa komórkowa powinna osiągnąć około 70-90% konfluencji w momencie iniekcji.
   3. Aby umożliwić łatwą identyfikację iniektowanych komórek, monowarstwę komórkową przed iniekcją rani się za pomocą plastikowej końcówki pipety 200μl. Zazwyczaj na szkiełku wykonuje się nacięcie w kształcie krzyża (Rysunek 1), a komórki pozostawia się do regeneracji w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej 15min przed iniekcją.
   4. Podczas mikroiniekcji pożywka do hodowli tkankowych powoli traci CO₂ w wyniku dyfuzji, przez co staje się zasadowa. Aby pomóc utrzymać neutralne pH podczas iniekcji, pożywkę można uzupełnić o 10mM HEPES pH 7.4. Dodatkowy bufor można dodać do pożywki dzień przed mikroiniekcją.
5. Mikroskop i mikromanipulator
   1. Mikroiniekcje komórek wykonuje się przy użyciu mikroskopu odwróconego, który jest odizolowany na stole pneumatycznym w celu zminimalizowania wibracji, które mogłyby zakłócić proces mikroiniekcji. Mikroskop jest wyposażony w dwa obiektywy: suchy 10x, służący do pozycjonowania komórek i igły, oraz suchy obiektyw fazowy 40x o bardzo długiej odległości roboczej, służący do obrazowania procesu mikroiniekcji.
   2. Aberracje optyczne spowodowane obrazowaniem komórek przez szkiełko nakrywkowe i szalkę Petriego można wyeliminować, jeśli obiektyw posiada pierścień korekcyjny. Upewnienie się, że pole jasne mikroskopu jest prawidłowo ustawione dla oświetlenia Köhlera⁹, pomoże również skorygować aberracje spowodowane rozpraszaniem światła przez igłę iniekcyjną (patrz 2.2.4).
   3. Igła jest sterowana za pomocą trójosiowego wiszącego manipulatora z joystickiem (NT-88-V3MSH, Narishige). Manipulator gruby jest przymocowany do tylnego filara mikroskopu, co pozwala na łatwe podnoszenie i opuszczanie igły do szalki przy zachowaniu jej pierwotnej pozycji.
   4. Igła jest przymocowana do uchwytu, który jest zaciśnięty na manipulatorze grubym. Rurka łączy uchwyt z szklaną strzykawką 5cc (Nr kat. 512311; Becton Dickinson), która wytwarza ciśnienie iniekcji niezbędne do wypchnięcia cieczy z końcówki igły do mikroiniekcji. Aby kontrolować poziom ciśnienia, korpus i tłok strzykawki są utrzymywane w pozycji przez regulator strzykawki, który składa się z dwóch korków, zacisku do rur (dostępnego w każdym sklepie budowlanym) i dwóch metalowych zacisków (Rysunek 2). Aby zapewnić utrzymanie wysokiego ciśnienia w strzykawce, do tłoka strzykawki nakłada się smar próżniowy (Dow Corning).
6. Fluorescencyjna sonda hybrydyzacyjna
   1. Sekwencja pierwotna wstrzykniętego kwasu nukleinowego jest zwijana przy użyciu oprogramowania do przewidywania drugorzędowej struktury RNA, takiego jak RNAstructure 4.6¹⁰.
   2. Złożenia mRNA są oceniane wizualnie w celu zidentyfikowania regionu o długości około 50 nukleotydów, który ma tendencję do bycia wolnym od struktur drugorzędowych o wysokich temperaturach topnienia, takich jak długie nici dwuniciowe.
   3. Komplement odwrotny tego regionu jest syntetyzowany z fluorophorem Alexa546 przyłączonym do końca 5' sondy (można je nabyć w firmie Integrated DNA Technologies).
   4. Sondę rozcieńcza się wodą do stężenia 100μM i przechowuje w temperaturze -80°C przez 2-3 lata.

2. Mikroiniekcja do jądra komórkowego

1. Napełnianie mikrostrzykawki w mikromanipulatorze do mikroiniekcji
   1. Przy użyciu końcówek GELoader (nr kat. 022351656; Epindorff) pobiera się około 1 μl płynu do wstrzyknięcia z odwirowanej próbki DNA lub mRNA. Płyn należy pobierać z górnej części próbki, aby uniknąć naruszenia osadu, który zawiera cząstki mogące zapchać igłę.
   2. Końcówkę pipety wprowadza się do tylnego końca igły, a następnie wydmuchuje ciecz. Ciecz zostanie wciągnięta do czubka igły dzięki działaniu kapilarnemu, a w ciągu 5–30 s w pobliżu czubka powinien pojawić się widoczny menisk.
   3. Igła wypełniona cieczą zostaje włożona do uchwytu, który następnie zostaje przymocowany do mikromanipulatora pod kątem 45°.
   4. Igłę wizualizuje się przy użyciu obiektywu 10x, a następnie za pomocą pokręteł grubego mikromanipulatora ustawia się ją w centrum pola widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowej. Następnie igłę podnosi się o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w późniejszych etapach (2.2.2), po czym odsuwa się tylny filar mikroskopu.
   5. Ciśnienie zwiększa się poprzez wciśnięcie tłoka o 0,5–2 ml.
2. Mikroiniekcja
   1. Szalkę Petri z wypełnionym nakryciem szkiełkiem, na którym znajduje się uszkodzona monowarstwa, umieszcza się na stole obserwacyjnym.
   2. Tylny filar mikroskopu zostaje przesunięty do przodu do pozycji pionowej, co powoduje ustawienie kondensora w jednej linii i wprowadzenie igły do cieczy. Czynność tę należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec złamaniu igły o szkiełko nakrywkę (patrz 2.1.4).
   3. Przy użyciu obiektywu 10x identyfikuje się środek rany krzyżowej, a następnie pozycjonuje się igłę nad komórkami przeznaczonymi do iniekcji.
   4. Powiększenie zwiększa się poprzez przełączenie na obiektyw 40x, a następnie opuszcza się igłę i centruje ją, korzystając z pokręteł precyzyjnej regulacji w dżojstiku. Jeśli obraz jest nieostry, należy upewnić się, że światło padające jest odpowiednio ustawione (tj. oświetlenie Köhlera)⁹) przy użyciu soczewki Bertranda (patrz 1.5.2).
   5. Wstrzykiwanie należy rozpocząć w jednym narożniku krzyża rany i kontynuować wzdłuż jednej krawędzi, aby ułatwić identyfikację wstrzykniętych komórek podczas wizualizacji (patrz Rycina 1).
   6. Igłę opuszcza się do momentu nawiązania kontaktu z jądrem. O tym, że komórka została zainfekowana, można łatwo przesądzić po wyraźnej zmianie jasności fazowej, która towarzyszy procesowi wstrzykiwania.
   7. Jeśli ciecz wypełni całą komórkę, może to oznaczać, że ciśnienie jest zbyt wysokie i należy je obniżyć.
   8. Jeśli nie zostanie wykryta zmiana jasności fazowej, może to wskazywać na zbyt niskie ciśnienie mikroiniekcji, aby przebić błonę komórkową, lub na zatkanie końcówki igły. Może to być wynikiem szeregu problemów, w tym: niewystarczającego ciśnienia, niedoskonałości igły oraz zablokowania końcówki igły przez drobne cząsteczki. Ponieważ osadzenie każdej igły w mikromanipulatorze jest czasochłonne, a podłoże do iniekcji jest często bardzo wartościowe, ważne jest, aby zmaksymalizować odsetek igieł, które mogą zostać skutecznie wykorzystane do iniekcji. Poniżej znajduje się instrukcja krok po kroku dotycząca próby odblokowania zatkanej końcówki igły. Po każdym kroku należy spróbować wykonać iniekcję w 2–3 komórkach, aby ocenić, czy niedrożność została usunięta:

      	Czynność	Cel i zadanie
      1	Dostosuj ostrość, aby widzieć długość końcówki igły.	Aby ustalić, czy igła posiada wyraźną wadę lub czy w jej końcówce znajduje się duża cząstka zanieczyszczenia powodująca zator.
      2	Umieść końcówkę igły obok unoszącej się w naczyniu cząsteczki materiału.	Jeśli ciecz wypływa z końcówki, powinna ona wprawiać cząstkę w ruch drgań bez bezpośredniego kontaktu cząstki z igłą.
      3	Docisnąć tłok do samego końca strzykawki	Ten przejściowy wzrost ciśnienia powinien usunąć wszelkie zatory w końcówce. Po zwolnieniu tłoka powinien on powrócić samodzielnie; jeśli tak się nie stanie, oznacza to, że w strzykawce nie wytwarza się ciśnienie i należy dokręcić połączenia i/lub dodać dodatkową smarVacuum.
      4	Wyciągnij igłę z pożywki komórkowej	Siła wyciągania igły z medium wodnego może pomóc w usunięciu zatorów znajdujących się na jej końcówce.
      5	Całkowicie wyjmij tłok ze strzykawki, a następnie włóż go ponownie.	Może być wymagany ten dodatkowy wzrost ciśnienia w celu udrożnienia końcówki igły.
      6	Przesunąć końcówkę igły po czystym fragmencie szkiełka nakrywkowego	Dalsze działanie to powoduje dodatkowe wzruszenie cząstek wewnątrz igły i pomaga zmienić ich położenie, co pozwala na usunięcie niedrożności w jej końcówce. Mocniejsze zdrapywanie może doprowadzić do odpryśnięcia końcówki, umożliwiając tym samym usunięcie zatoru z igły.
      7	Załaduj nową igłę

      
      
      Kolejnym powszechnym problemem jest stopniowy spadek ciśnienia w igle, co wymaga częstej kompensacji poprzez dodatkowe wciskanie tłoka strzykawki. Często pomocne w utrzymaniu bardziej stabilnego ciśnienia może być nałożenie dodatkowej smaru próżniowego na tłok strzykawki. Problem ten może jednak wynikać z nieszczelności połączeń między strzykawką a rurką, rurką a końcówką (wand) lub końcówką a igłą. Większość wycieków powietrza można uszczelnić za pomocą Parafilmu (Fisher) lub smaru, jeśli jest to konieczne, choć nieszczelności między końcówką a igłą można usunąć jedynie poprzez wymianę uszczelki gumowej w końcówce.
   9. Komórki wzdłuż brzegu rany poddawane są mikroińjekcji przez określony czas (10–15 min). Dzięki wprawie w tym przedziale czasowym można przeprowadzić iniekcję do kilkuset komórek.
   10. Po mikroiniekcji komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez pożądany czas przed utrwaleniem. W przypadku iniekcji DNA transkrypcję przerywa się po 20 minutach poprzez potraktowanie komórek $\alpha$-amanityną (1 $\mu$g/ml; Sigma-Aldrich) rozpuszczoną w pożywce wzrostowej. Stężenie to skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcyjnego plazmidu (Rycina 3).
   11. Pojedynczą igłę można wykorzystać wielokrotnie do wstrzyknięcia materiału do wielu szkiełek nakrywkowych, although igłę należy jednak wymienić przy zmianie rodzaju mikroiniekcyjnego DNA lub RNA. Po odłączeniu igły od uchwytu należy ją zutylizować i nie używać ponownie.
   12. Martwe lub pływające komórki mogą czasami przykleić się do końcówki igły i zakłócać proces mikroiniekcji. Aby usunąć te zanieczyszczenia z igły, należy wysunąć ją z cieczy, cofając filar, a następnie powoli ponownie wprowadzić igłę do cieczy, przywracając filar do pozycji pionowej.
   13. Aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA, należy utrwalić oddzielne próbki w czasie 0 min, 15 min, 30 min, 60 min i 120 min po mikroiniekcji RNA lub po zastosowaniu α-amanityny.

3. Fixacja i barwienie komórek

1. Fiksacja i permeabilizacja komórek
   1. W odpowiednim czasie odsysa się pożywkę wzrostową, a komórki przemywa dwukrotnie 2 ml roztworu PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄, pH 7,4). Ważne jest, aby utrzymać wilgotność szkiełek nakrywkowych, minimalizując czas, w którym nie są one zanurzone w cieczy.
   2. Komórki utrwala się poprzez dodanie 2 ml 4% paraformaldehydu (Electron Microscope Sciences) w PBS na co najmniej 15 min w temperaturze pokojowej.
   3. Utrwalone próbki przemywa się dwukrotnie roztworem PBS.
   4. Komórki poddaje się permeabilizacji za pomocą 2 ml 0,1% Triton X-100 w PBS przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Próbki przemywa się dwukrotnie roztworem PBS.
2. Barwienie FISH
   1. Następnie należy przygotować próbki do hybrydyzacji. Komórki przemywa się dwukrotnie roztworem 1x SSC (150mM NaCl, 15mM cytrynianu sodu, pH 7,0) z 25-60% formamidem. W kwestii ilości formamidu należy zastosować takie samo stężenie, jakie występuje w roztworze do hybrydyzacji (patrz 3.2.3).
   2. Aby przygotować komorę barwiącą, dno 150-milimetrowej szalki Petriego pokrywa się wodą, a na wodzie kładzie się kawałek Parafilmu. Wodę usuwa się poprzez obrócenie szalki, co pozwala Parafilmowi przywrzeć do dna naczynia. Pęcherzyki powietrza usuwa się ręcznie.
   3. Dla każdego szkiełka nakrywkowego przeznaczonego do barwienia, na Parafilm nanosi się pipetą krople po 100μl roztworu do hybrydyzacji (25-60% formamidu, 100mg/ml siarczanu dekstranu, 1mg/ml tRNA z E. coli, 5mM kompleksu rybosydowo-wanadylonego w 1x SSC z sondą rozcieńczoną 1:500). Należy pamiętać, że ilość formamidu powinna być zoptymalizowana dla konkretnie używanej sondy FISH.
   4. Za pomocą pęsety wyjmuje się szkiełko nakrywkowe z 30-milimetrowej szalki Petriego, a następnie za pomocą papieru filtracyjnego Whatman (VWR) osusza się stronę tylną (wolną od komórek) szkiełka i usuwa nadmiar buforu ze strony przedniej, nie wysuszając utrwalonych komórek. Następnie szkiełko nakłada się stroną z komórkami do dołu na roztwór FISH. Procedurę tę powtarza się dla każdego szkiełka.
   5. Po ponownym założeniu pokrywy komory barwiącej, próbki inkubuje się przez 5-18 h w temperaturze 37°C.
3. Przemywanie i montowanie zbarwionych próbek
   1. Kilka komór przemywających przygotowuje się w ten sam sposób co komorę barwiącą (patrz 3.2.2).
   2. Dla każdego szkiełka nakrywkowego na Parafilm w komorze przemywającej nanosi się pipetą 1 ml buforu do przemywania (1x SSC z 25-60% formamidem). Ponownie należy zastosować takie samo stężenie formamidu, jakie występuje w roztworze do hybrydyzacji (patrz 3.2.3).
   3. Aby wyjąć szkiełka nakrywkowe z komory barwiącej, obok szkiełka nanosi się pipetą 1 ml buforu do przemywania. Ciecz powinna zostać wciągnięta pod każdą próbkę dzięki działaniu kapilarnemu.
   4. Używając pęsety, wyjmuje się szkiełka nakrywkowe i każde z nich kładzie się na kropli buforu do przemywania, inkubując w temperaturze pokojowej przez 5 min.
   5. Kroki od 3.3.2 do 3.3.4 powtarza się jeszcze dwukrotnie, tak aby każde szkiełko nakrywkowe zostało przemyte łącznie 3 razy.
   6. W przypadku chęci jednoczesnego barwienia RNA i białek za pomocą immunofluorescencji, należy przejrzeć sekcję 3.4.
   7. Preparaty przemywa się 70% etanolem i osusza chusteczkami Kimwipes. Dla każdego szkiełka nakrywkowego na preparat nanosi się pipetą 10-30 μl medium montażowego z DAPI (Fluoromount G, Southern Biotech). Na jednym preparacie można umieścić dwa szkiełka nakrywkowe.
   8. Za pomocą pęsety i papieru filtracyjnego Whatman osusza się tył szkiełka nakrywkowego i usuwa nadmiar cieczy z jego przedniej strony, nie wysuszając próbek. Następnie każde szkiełko nakłada się stroną z komórkami do dołu na kroplę medium montażowego.
   9. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze 4°C.
4. Barwienie immunofluorescencyjne
   1. Próbki należy przemyć dwukrotnie PBS, aby usunąć formamid, który może zakłócać prawidłowe barwienie przeciwciałami.
   2. Dla każdego szkiełka nakrywkowego na Parafilm w komorze przemywającej nanosi się pipetą 50μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych (1,0μg/ml przeciwciała, 0,1% TX-100, 0,1mg/ml BSA wolnego od RNazy w PBS).
   3. Używając pęsety, szkiełka nakrywkowe kładzie się stroną z komórkami do dołu na roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 30 min.
   4. Dla każdego szkiełka nakrywkowego na Parafilm w komorze przemywającej nanosi się pipetą dwie krople po 1 ml PBS.
   5. Aby wyjąć szkiełka nakrywkowe z roztworu barwiącego przeciwciałami, obok szkiełka nanosi się pipetą 1 ml PBS. Ciecz powinna zostać wciągnięta pod każdą próbkę dzięki działaniu kapilarnemu.
   6. Używając pęsety, wyjmuje się szkiełka nakrywkowe i każde z nich kładzie się na pierwszej kropli PBS na 5 min, a następnie na drugiej kropli PBS na kolejne 5 min.
   7. Kroki 3.4.2 do 3.4.6 powtarza się, używając roztworu fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych (1,0μg/ml przeciwciała, 0,1% TX-100, 0,1mg/ml BSA w PBS). Należy pamiętać, że ponieważ marker wstrzykiwania i RNA są widoczne w kanale zielonym i czerwonym, przeciwciało wtórne musi być sprzężone z kompatybilnym barwnikiem, takim jak Alexa647.
   8. Szkiełka nakrywkowe montuje się zgodnie z opisem w punkcie 3.3.7.

4. Obrazowanie i kwantyfikacja

1. Obrazowanie
   1. Do obrazowania komórek po iniekcji stosuje się mikroskop epifluorescencyjny. Wstrzyknięte komórki można zlokalizować, odnajdując miejsca przecięć tkanki i identyfikując komórki z wstrzykniętym markerem (dekstran OG).
   2. Dla każdej obserwowanej komórki wykonuje się zdjęcie wstrzykniętego dekstranu OG. Podczas obrazowania mikroinjekcyjnego mRNA istotne jest, aby kwantyfikacja obejmowała jedynie komórki, które otrzymały >90% wstrzykniętego płynu (tj. dekstranu) do jądra.
   3. Następnie wykonuje się obraz RNA. Aby umożliwić dokładny pomiar RNA, czas ekspozycji dla wszystkich komórek w danym przebiegu czasowym powinien pozostać stały i mieścić się w zakresie dynamicznym kamery. Idealnie każdy obraz powinien zawierać niewstrzykniętą komórkę, aby móc prawidłowo obliczyć intensywność fluorescencji tła (patrz 4.2.4).
   4. W celu ułatwienia kwantyfikacji można również wykonać obraz barwienia DAPI. Jeśli przeprowadzono immunofluorescencję, można obrazować również zabarwione białko. Przykład rozkładu mRNA w różnych punktach przebiegu czasowego przedstawiono na rysunku 4. mRNA koduje białko wydzielnicze i jest zatem kierowane do ER w komórkach COS-7. Należy zauważyć, że kierowanie do ER zweryfikowano poprzez współbarwienie RNA przeciwciałami przeciwko TRAPα, białku rezydentnemu ER¹¹.
2. Kwantyfikacja
   
   Można to osiągnąć za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania do analizy obrazu. Oprogramowanie ImageJ dobrze nadaje się do kwantyfikacji rozkładu mRNA w komórkach, ponieważ pozwala na ręczne oddzielenie frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej, pomiar średniej fluorescencji tych frakcji, a uzyskane dane można łatwo kopiować i wklejać do innego oprogramowania, takiego jak Microsoft Excel.
   1. Obrazy odpowiadające fluorescencji FISH, dekstranu OG i DAPI są otwierane i łączone za pomocą narzędzia Images to Stack.
   2. W warstwie DAPI lub dekstranu narzędziem Threshold izoluje się obszar odpowiadający mikroinjekcyjnemu jądru. Frakcję tę zaznacza się narzędziem Wand, a po przejściu do warstwy FISH, za pomocą narzędzia Measure rejestruje się pole powierzchni (A_Nuc) i średnią intensywność (F_Nuc).
   3. Obrys perymetru komórki wykonuje się za pomocą narzędzia Freehand selection, a będąc w warstwie FISH, za pomocą narzędzia Measure rejestruje się pole powierzchni (A_Tot) i średnią intensywność (F_Tot). Jeśli fluorescencja komórki jest znacznie silniejsza niż tło, zamiast narzędzia Freehand selection do obrysowania wybranej komórki można użyć narzędzia Threshold.
   4. Za pomocą funkcji Rectangular selection rysuje się prostokąt nad niewstrzykniętą komórką i rejestruje średnią intensywność (F_Back).
   5. Wszystkie pomiary są kopiowane do arkusza Excel.
   6. Eksport mRNA oblicza się za pomocą następującego równania:
      
      

      ANuc	Powierzchnia jądra
      ATot	Powierzchnia całej komórki
      FNuc	Średnia fluorescencja frakcji jądrowej
      FTot	Średnia fluorescencja frakcji całej komórki
      FBack	Średnia fluorescencja komórki nietransfekowanej

      
      Dla każdego punktu czasowego oblicza się średni %Export i nanosi go na wykres w funkcji czasu.
   7. Stabilność mRNA oblicza się, wykreślając średnią całkowitą fluorescencję mRNA (A_Tot x (F_Tot - F_Back)) w czasie. Zazwyczaj stwierdzamy, że ilość mRNA znacznie różni się między komórkami i między szkiełkami podstawczymi. Może to wynikać z niespójności prędkości przepływu igły oraz wydajności barwienia FISH.

Rycina 1. Szkiełko nakrywkowe do mikroiniekcji. Komórki są hodowane do osiągnięcia 70-90% konfluencji, a następnie poddawane zranieniu w pionie i poziomie za pomocą plastikowego końcówki pipety 200μl. Począwszy od miejsca skrzyżowania ran, komórki są wstrzykiwane wzdłuż jednej z krawędzi rany (strzałka).

Rycina 2. Regulator strzykawki. A) Schemat blokowy przedstawiający sposób montażu regulatora strzykawki. B) Schemat zmontowanego urządzenia. C) Fotografia zmontowanego regulatora strzykawki.

Rysunek 3. Wpływ α-amanityny na transkrypcję wstrzykniętego plazmidowego DNA. Komórki fibroblastów NIH3T3, poddane wstępnej inkubacji z różnymi stężeniami α-amanityny, wstrzyknięto plazmidowym DNA t-ftz-Δi oraz koniugatem 70kD dekstranu z OG. Wstrzyknięte komórki inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, a następnie utrwalono i barwiono na mRNA t-ftz-Δi przy użyciu specyficznej sondy FISH6. Każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia obrazowanemu dla OG-70kDa dekstranu oraz mRNA t-ftz-Δi. Należy zauważyć, że wysokie, ale nie niskie stężenia leku całkowicie zahamowały produkcję transkryptu t-ftz-Δi. Pasek skali = 15μm.

Rysunek 4. Przebieg czasowy eksportu jądrowego mRNA. Do komórek COS-7 wstrzyknięto plazmidowe DNA t-ftz-Δi oraz koniugowany z OG dekstran 70kD. 30 min po wstrzyknięciu komórki poddano działaniu α-amanityny i inkubowano w 37°C przez wskazane odstępy czasu. Następnie komórki utrwalono i zabarwiono sondą przeciwko mRNA t-ftz-Δi oraz przeciwciałami przeciwko markerowi ER TRAPα. Każdy rząd odpowiada pojedynczemu polu komórek. A) Rozkład mRNA w przebiegu czasowym po mikroiniekcji. B) Powiększenie punktu czasowego 120 min z (A), wykazujące kolokalizację mRNA t-ftz-Δi i ER. Na prawym panelu przedstawiono nałożenie zabarwień mRNA t-ftz-Δi (zielony) i TRAPα (czerwony). Paski skali = 15μm.

Dyskusja

Mikroiniekcja jest potężnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania wielu różnych procesów komórkowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnej transfekcji komórek, mikroiniekcja pozwala badaczowi na efektywne wprowadzenie kwasów nukleinowych do jąder komórkowych w bardzo krótkim przedziale czasowym. W rezultacie możliwe jest przeprowadzenie analiz kinetycznych, takich jak określanie szybkości eksportu mRNA, lokalizacji mRNA oraz syntezy białek. Ponadto, ze względu na stosunkowo krótki czas trwania eksperymentu, można poddawać komórki działaniu związków toksycznych przez krótkie okresy bez wywoływania efektów plejotropowych. Co więcej, wraz z kwasami nukleinowymi można wstrzyknąć związki hamujące lub stymulujące, takie jak białka dominująco negatywne. Wreszcie, mikroiniekcje eliminują konieczność stosowania odczynników do transfekcji, które są często toksyczne dla komórek i mogą zaburzać różne funkcje komórkowe.

Iniekcje mRNA w porównaniu do iniekcji plazmidowego DNA

Wybór kwasu nukleinowego do iniekcji będzie zależał od szeregu rozważań. Po iniekcji plazmidowego DNA polimeraza RNA II nie tylko syntetyzuje mRNA, ale także rekrutuje czynniki białkowe do powstającego transkryptu.^12,13Ponieważ czynniki te sterują takimi zdarzeniami, jak procesing mRNA, eksport jądrowy i lokalizacja cytoplazmatyczna, iniekcje DNA plazmidowego mogą być wykorzystywane do oceny, w jaki sposób transkrypcja jest sprzężona z procesami w następnych etapach. Chociaż transkrypcja może być sprzężona z eksportem jądrowym¹⁴stwierdziliśmy, że wstrzyknięty mRNA jest eksportowany nieco szybciej niż in vivo transkrybowane mRNA⁶Przyczyny tego stanu rzeczy nie są obecnie jasne, jednak wynik ten może sugerować, że w miarę jak nowo syntetyzowany mRNA wydostaje się z polimerazy RNA II, może on być związany w kompleksach, które opóźniają eksport jądrowy.

Iniekcje mRNA oferują pewne zalety. Po pierwsze, badacz nie musi stosować inhibitorów polimerazy RNA, co mogłoby wpłynąć na sposób, w jaki komórki regulują ogólny metabolizm RNA. Po drugie, RNA może zostać zmodyfikowane in vitro przed iniekcją. Na przykład mRNA można syntetyzować z różnymi analogami czapeczki 5' lub o różnej długości ogonów poly(A), aby ocenić, jak te cechy wpływają na eksport jądrowy⁶. Po trzecie, można w przybliżeniu oszacować dokładną ilość wstrzykniętego RNA. Postępując zgodnie z powyższym protokołem, szacujemy, że do każdego jądra wstrzykniętych zostaje około 20 000 do 50 000 cząsteczek, co jest wartością stosunkowo niską w porównaniu z całkowitą liczbą transkryptów w typowej komórce ssaka (400 000 do 850 000 cząsteczek)¹⁵. Główną wadą iniekcji mRNA jest to, że podczas mikroiniekcji nieunikniony jest pewien wyciek płynu do cytoplazmy. Ponieważ mRNA wstrzyknięte bezpośrednio do cytoplazmy pozostaje stabilne przez długi czas (A. Palazzo, nieopublikowana obserwacja), należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze komórek do analizy ilościowej. Zazwyczaj analizujemy komórki, które otrzymały >90% płynu iniekcyjnego w jądrze, co oceniamy na podstawie rozkładu OG-dekstranu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do iniekcji	Sigma-Aldrich		140 mM KCl i 10 mM HEPES, pH 7.4
Dekstran Oregon Green 488-70kD	Invitrogen	D7173	Roztwór stokowy o stężeniu 10mg/ml w buforze do iniekcji może być przechowywany przez dłuższy czas w temperaturze -80°C
Kapilary borokrzemianowe	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Grotki do pipet do nakładania żelu do napełniania igieł iniekcyjnych	Eppendorf	022351656
Mikroskop	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Mikromanipulator	Narishige International	NT-88-V3MSH
Strzykawka do iniekcji	BD Biosciences	512311
Bufor PBS	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
Bufor SSC	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodu, pH 7.4
4% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15686	Roztwór stokowy 37% paraformaldehydu rozcieńczony w PBS
0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28314	Roztwór stokowy 10% Triton X-100 rozcieńczony w PBS
Formamid	Fisher Scientific	F84-1
Siarczan dekstranu	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli tRNA	Sigma-Aldrich	R1753
Kompleks wanadylu z rybosydem (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Papier filtracyjny Whatman	VWR international	28298-020
Stół wibroizolacyjny	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanityna	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Wytrawiacz pipet Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Smar próżniowy	Dow Corning	695400008
Polimeraza RNA T7	New England Biolabs	M0251S
Polimeraza Poly(A)	Ambion	AM1350
Bufor do hybrydyzacji	Sigma-Aldrich		100mg/ml siarczanu dekstranu, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM cytrynianu sodu, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamidu