Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Streszczenie

Źródło: Keener, D. G., et al. Elektroporacja pojedynczych komórek w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje proces elektroporacji pojedynczej komórki w celu wprowadzenia plazmidowego DNA do neuronów w hodowlach plastrów hipokampa myszy. Procedura obejmuje precyzyjne pozycjonowanie pipety, regulację ciśnienia i impulsy elektroporacyjne w celu przejściowej przepuszczalności błony neuronalnej, ułatwiając transfer genów. Po elektroporacji wycinek jest inkubowany, aby umożliwić ekspresję wprowadzonego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie kultur w plasterkach

1. Przygotuj organotypowe kultury plastrów hipokampa myszy, jak opisano wcześniej, używając postnatalnych myszy w wieku od 6 do 7 dni obu płci.
   1. Przygotować pożywkę preparacyjną do organotypowej hodowli plastrów składającej się z (w mM): 238 sacharozy, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, a następnie gazować 5% CO₂/95% O₂ do pH 7,4.
   2. Przygotować organotypową pożywkę hodowlaną w warstwach składającą się z: 78,8% (v/v) minimum niezbędnego podłoża Eagle, 20% (v/v) surowicy końskiej, 17,9 mM NaHCO₃, 26,6 mM glukozy, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES), insuliny (1 μg/ml) i 0,06 mM kwasu askorbinowego o pH dostosowanym do 7,3. Dostosuj osmolarność do 310-330 osmol za pomocą osmometru.
   3. Wypreparuj hipokampy z całego mózgu za pomocą dwóch szpatułek i pokrój (400 μm) za pomocą rozdrabniacza tkanek. Oddzielić plastry za pomocą dwóch kleszczyków i przenieść do 30-milimetrowych wkładek do hodowli komórkowych na 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką hodowlaną (950 μl) pod wkładkami.
2. Organtypowe kultury warstwowe należy przechowywać w inkubatorze do hodowli tkankowych (35°C, 5% CO₂) i zmieniać pożywkę do hodowli plastrów co dwa dni.

2. Przygotowanie plazmidu

1. Przygotuj plazmid dla interesującego genu.
   1. Subklonować gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) do wektora pCAG.
   2. Oczyść plazmid pCAG-EGFP za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn i rozpuść w roztworze wewnętrznym, który składa się z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu zawierającej 140 mM K-metanosulfonianu, 0,2 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego (EGTA), 2 mM MgCl₂ i 10 mM HEPES, dostosowanego do pH 7,3 za pomocą KOH (stężenie plazmidu: 0,1 μg/μL).

3. Przygotowanie pipet szklanych

1. Wyciągnij pipety ze szkła borokrzemianowego (4,5 – 8 MΩ) na ściągaczu do mikropipet (Rysunek 1A).
   UWAGA: Szklane pipety używane do zapisów z użyciem zacisków krosowych dla całych komórek są idealne do elektroporacji.
2. Piecz szklane pipety przez noc w temperaturze 200°C w celu sterylizacji.
3. Sprawdź rozmiar końcówki pipety pod mikroskopem preparacyjnym, aby w przybliżeniu określić opór elektryczny.
   1. Opcjonalnie:Sprawdź rezystancję pipety, podłączając pipetę do elektrody elektroporacyjnej i użyj mikromanipulatora, aby manewrować końcówką pipety w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF) sterylizowanym filtrem zawierającym (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, gazowanej 5% CO₂/95% O₂ do pH 7,4. Potwierdź rzeczywistą rezystancję za pomocą odczytu na elektroporatorze.
      UWAGA: Im ostrzejsza końcówka pipety, tym większy opór elektryczny. Rezystancja pipety powinna być mniejsza niż 10 MΩ. Szklane pipety o wysokiej rezystancji (ilustracja 1B) często zapychają końcówkę podczas wielokrotnej elektroporacji.

4. Konfiguracja stanowiska do elektroporacji

1. Zainstaluj elektroporator w standardowym stanowisku do elektrofizjologii całych komórek, wyposażonym w pionowy mikroskop zamontowany na ruchomym stole, mikromanipulator i pompę perystaltyczną.
2. Zamontuj stopień główny elektroporatora na mikromanipulatorze i podłącz parę głośników do elektroporatora. Podłącz elektroporator do pedału nożnego, który może być użyty do wysłania impulsu, gdy jest gotowy.
   UWAGA: Po włączeniu głośniki emitują dźwięk, który jest wskaźnikiem oporu elektrycznego na elektrodzie. Umożliwia to określenie względnych zmian oporności bez odwracania uwagi od zabiegu.

5. Przygotowanie do elektroporacji

1. Przenieś wkładki hodowlane z plastrów z 6-dołkowych płytek na 3-centymetrowe szalki Petriego załadowane 900 μl pożywki hodowlanej i przechowywane w stołowym inkubatorze CO₂ do momentu przygotowania do przeprowadzenia elektroporacji.
   1. Wstępnie inkubować świeże wkładki hodowlane z pożywką hodowlaną w plastrach (1 ml) przez co najmniej 30 minut na 3,5 cm szalce Petriego w celu wyhodowania plastrów po elektroporacji.
2. Oczyść i przygotuj zestaw do elektroporacji.
   Proszę
   1. przelać linie 10% wybielaczem przez 5 minut, aby wysterylizować rurkę i komorę przed rozpoczęciem eksperymentu na dany dzień.
   2. Przetapiaj linie dejonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut, aby całkowicie spłukać.
   3. Perfuzjuj linie za pomocą sterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 mM tetrodotoksyny (TTX).
      UWAGA: TTX minimalizuje toksyczność komórkową i śmierć z powodu nadmiernego pobudzenia interneuronów.
3. Ustaw parametry impulsu elektroporatora: amplituda 5 V, impuls prostokątny, ciąg 500 ms, częstotliwość 50 Hz i szerokość impulsu 500 μs.
4. Napełnić szklaną pipetę 5 μl roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid.
   1. Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z końcówki pipety, kilkakrotnie przesuwając i delikatnie stukając w końcówkę.
   2. Sprawdź, czy końcówka nie jest uszkodzona, wizualizując ją pod mikroskopem preparacyjnym lub powtarzając krok 3.3.1 w celu sprawdzenia oporu pipety.
      UWAGA: Jeśli końcówka jest uszkodzona, szklaną pipetę należy wyrzucić, a krok ten należy powtórzyć z nową szklaną pipetą przygotowaną wcześniej w kroku 3.
5. Mocno przymocuj końcówkę pipety do elektrody i włącz głośniki. Zapisz odczyt (rezystancję pipety) elektroporatora, gdy końcówka zetknęła się z medium aCSF.
6. Przeciąć membranę wkładki hodowlanej za pomocą ostrego ostrza i odizolować jeden plasterek kultury. Ostrożnie przenieś kulturę plastrów do komory elektroporacyjnej za pomocą kleszczy o ostrym kącie i utrwal jej położenie za pomocą kotwicy do plastrów.
   1. Nie trzymaj kultury plastrów poza inkubatorem dłużej niż 30 minut na raz, aby zapobiec skutkom ubocznym, takim jak zmiany w zdrowiu lub funkcji neuronów.

6. Interesujące ogniwa elektroporacyjne

1. Zastosuj nadciśnienie do pipety za pomocą ust lub za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ciśnienie 0,2 - 0,5 ml) podłączonej do rurki.
2. Użyj trójwymiarowego pokrętła mikromanipulatora, aby manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów.
3. Wybierz komórkę docelową i zbliż się do niej, utrzymując nadciśnienie, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie, które jest widoczne pod mikroskopem.
4. Wykonuj cykle ciśnieniowe.
   1. Szybko zastosuj łagodne podciśnienie doustnie, tak aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną powstało luźne uszczelnienie, co jest wizualnie sygnalizowane przez membranę sięgającą nieco do końcówki pipety. Obserwuj wzrost (~2,5x początkowy opór) oporu pipety, nasłuchując wzrostu tonu dochodzącego z głośników. Szybko ponownie zastosuj nadciśnienie, aby wgłębienie ponownie się uformowało.
   2. Natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe bez przerwy, a następnie utrzymuj podciśnienie przez 1 s.
      UWAGA: Przerwy między cyklami, wywieranie zbyt dużego nacisku lub utrzymywanie podciśnienia przez zbyt długi czas może spowodować znaczne uszkodzenie ogniwa i prawdopodobnie spowodować śmierć ogniwa podczas elektroporacji.
5. Szybko pulsuj elektroporatorem raz za pomocą pedału nożnego, gdy ton z głośników osiągnie stabilny wierzchołek wysokości, wskazując szczytową rezystancję elektryczną. Nie czekaj na szczytową rezystancję dłużej niż 1 s przed wysłaniem impulsu.
   UWAGA: Nie zaobserwowaliśmy elektroporacji poza celem podczas korzystania z tego protokołu. Transfekcji poddano tylko te komórki, które miały kontakt ze szklaną pipetą podczas cykli ciśnieniowych. Umieszczenie pipety w pobliżu innych neuronów nie powoduje transfekcji genu.
6. Delikatnie wycofaj pipetę na około 100 μm z kuwety bez wywierania nacisku.
7. Ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do zarejestrowanego odczytu w kroku 5.5, a następnie zbliż się do następnej komórki.
   >
   1. Usuń potencjalne zatkania, wskazane wizualnie lub przez znacznie zwiększoną (>15% wyższą) rezystancję pipety po elektroporacji, stosując nadciśnienie.
      >UWAGA: Jeśli nie ma widocznego zatkania, a opór jest nadal znacznie wyższy, wyrzuć pipetę i użyj nowej. Średnio pipeta może być używana do maksymalnie 20 zdarzeń elektroporacji, jeśli użytkownik jest ostrożny.
8. Po elektroporacji przenieś kulturę plastrów na świeżą wkładkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 35°C w inkubatorze przez okres do 3 dni.

Wyniki

Rysunek 1: Dwa reprezentatywne obrazy szklanych pipet. (A) Pipety o niższej rezystancji (6,5 MΩ), używane w tym protokole, oraz (B) pipety o wyższej rezystancji (10,4 MΩ) typowe dla protokołów elektroporacji.

Materiały