Wstrzykiwanie samoorganizujących się peptydów i nerwowych komórek prekursorowych w celu naprawy rdzenia kręgowego w modelu szczurzym

Streszczenie

Źródło: Zweckberger, K., et al. Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym. J. Vis. Exp. (2015).

Protokół ten demonstruje ukierunkowane podejście do iniekcji w celu naprawy urazu rdzenia kręgowego w modelu szczurzym. Polega na dostarczeniu samoorganizujących się peptydów (SAP) do rdzenia zmiany chorobowej w celu stworzenia rusztowania nośnego, a następnie wstrzyknięciu komórek prekursorowych neuronów (NPC) wokół zmiany w celu przebudowy tkanki.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Model stłuczenia / kompresji tętniaka szyjki macicy

1. Przed zabiegiem należy sterylizować narzędzia w autoklawie i utrzymywać je w sterylności podczas całego zabiegu chirurgicznego, umieszczając je w kąpieli alkoholowej o stężeniu 70%.
2. Znieczulenie szczurów Wistar (250-270 g) kombinacją tlenu (_O2), podtlenku azotu (N₂O) (1:1) i 1,8-2,2% izofluranu i wspomaganie spontanicznego oddychania za pomocą maski do znieczulenia gazowego. W celu indukcji znieczulenia zacznij od 5% izofluranu przez 1 minutę, a następnie zmniejsz. Przed rozpoczęciem operacji należy kontrolować głębokość znieczulenia, podając bolesny bodziec (np. w łapy). Stosuj tłuste maści do oczu, aby uniknąć wysuszenia i zapobiec późniejszym infekcjom.
3. Połóż szczury na poduszce grzewczej (37 °C) i przymocuj głowę do ramy stereotaktycznej.
4. Ogolić obszar chirurgiczny wokół odcinka szyjnego kręgosłupa i zdezynfekować jodonem powidonu i 70% alkoholem.
5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej powyżej kręgosłupa od kręgu szyjnego (C2) docierając do wydatnego wyrostka trzonu kręgu piersiowego 2 (T2).
6. Przetnij zewnętrzną warstwę mięśni kręgowych bezpośrednio na linii środkowej (aby uniknąć krwawienia) w kierunku czaszkowo-ogonowym i dalej tępo rozetnij głębsze warstwy mięśni, aż dotrzesz do wyrostka kolczastego i blaszek. Wkładać zwijacze.
7. Zorientuj wydatny processus spinosus trzonu kręgu T2, aby obserwować docelowe poziomy dla laminektomii. Po identyfikacji i mikrochirurgicznym przygotowaniu wybranych blaszek należy przeciąć więzadła kłamkowe w celu rozluźnienia blaszek i wyrostka kolczastego. Na koniec przetnij blaszki obcinaczem do kości bocznym w stosunku do rdzenia kręgowego i usuń je delikatnie, unikając ucisku samego rdzenia kręgowego.
   UWAGA: Najczęstsze poziomy to C5/6, C6/7 lub C7/T1. Śmiertelność okołooperacyjna wzrasta wraz z poziomem urazu. Krwawienie z zatoki żylnej przykręgosłupowej jest powszechne i można mu zaradzić poprzez ostrożne uciskanie gąbką.
8. Przed włożeniem klipsa w celu uszkodzenia pępowiny, zidentyfikuj pojawiające się korzenie nerwowe, aby oszczędzić im przycinania (szczególnie na poziomach C5/6).
9. W celu zapewnienia płynnej indukcji klipsa należy poluzować oponę twardą brzuszną od grzbietowej strony trzonów kręgów za pomocą haczyka i przygotować korytarz dla klipsa.
10. Na koniec włóż otwarty klips i pozwól mu się zatrzasnąć (szybkie zamknięcie), aby uzyskać uraz spowodowany kontuzją. Siła zamykania klipsa i czas trwania zamykania klipsa określają intensywność urazu i stopień kompresji. Powszechnie stosowane są siły klipsa wynoszące od 15 do 35 g i czas przycinania wynoszący np. 1 minutę (rysunek 1).
11. Po zdjęciu klipsa należy ułożyć mięśnie w 2 warstwach i zamknąć ranę.
12. Przerwij znieczulenie i pozwól zwierzęciu obudzić się pod ciągłą obserwacją, aż odzyska wystarczającą świadomość do leżenia mostka. Na koniec umieść szczura w pojedynczej klatce i postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia pooperacyjnego.
13. Ponieważ zwierzęta zmagają się z ciężkością tego typu urazów, należy zwrócić szczególną uwagę na leczenie pooperacyjne:
    1. Podawaj leki przeciwbólowe (buprenorfina i meloksykam odpowiednio przez 3 dni i 5 dni oraz zgodnie z objawami klinicznymi).
    2. Podawać dodatkowy roztwór soli fizjologicznej podskórnie przez 3 dni (2 razy dziennie po 5-10 mililitrów (ml)).
    3. Podawaj antybiotyki w wodzie do picia 2 dni przed i do 7 dni po operacji (np. Moksyfloksacyna)
    4. Ściskaj pęcherz moczowy 2-3 razy dziennie, aż powrót do funkcji pęcherza będzie stale widoczny.
    5. Deficyty neurologiczne i stan fizjologiczny operowanych zwierząt należy obserwować co najmniej raz dziennie.

2. Wstrzykiwanie SAP i NPC (14 dni po urazie)

1. Wywołaj znieczulenie zgodnie z opisem w 1.1 do 1.3, zamocuj głowę szczura w ramce stereotaktycznej, usuń szwy lub klipsy do ran i zdezynfekuj ranę i obszar operacyjny powidonem i 70% alkoholem.
2. Ostrożnie wypreparuj mięśnie przykręgosłupowe, włóż retraktory, usuń mikroskopijnie tkankę bliznowatą z opony twardej i ponownie odsłonij miejsce zmiany.
3. Przygotuj SAPs w stężeniu 1% (w/v) do wykonania żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. QL6 SAP mają fizjologicznie zgodne pH i nie muszą być buforowane przed wstrzyknięciem. Do wizualizacji SAP w rdzeniu kręgowym należy użyć fluorescencyjnej pochodnej QL6 (izotiocyjanian fluoresceiny QL6 [FITC]).
4. Wstrzyknąć SAP (5 mikrolitrów (μl) do środka zmiany, rozprowadzając w 2 porcjach, każda 2,5 μl obustronnie od linii środkowej. Użyj strzykawki Hamilton połączonej z ramką stereotaktyczną za pomocą kapilary z mikroszkła (średnica zewnętrzna 100 mikrometrów (μm) [OD]). Ostrożnie otwórz oponę twardą końcówką ostrej igły i włóż szklaną kapilarnę stereotaktycznie na 2 milimetry (mm) do uszkodzonego rdzenia kręgowego.
5. Po wstrzyknięciu 1/3 objętości należy usunąć igłę na głębokość 1,5 mm, a po upływie kolejnych 1/3 do 1 mm. Po wstrzyknięciu całej objętości, a przed wyjęciem strzykawki, należy odczekać 5 minut, aby ustabilizować tworzenie się żelu.
6. Aby wygenerować NPC, użyj dorosłych myszy z czerwonym białkiem fluorescencyjnym discosoma (DsRed) (lub myszy z żółtym białkiem fluorescencyjnym [YFP], zielonych) i wyizoluj je i hoduj ze strefy przykomorowej.
7. Oceń żywotność NPC za pomocą barwienia błękitem trypanowym, które wskazuje na obecność ~90% żywych komórek w zawiesinie komórki. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej (50 x 10³ żywe komórki/μl), a następnie użyć ich do przeszczepu komórek.
8. Wykonać cztery wstrzyknięcia dordzeniowe o objętości 2 μl (8 μl objętości całkowitej, zawierające 4 x 10⁵ NPC) obustronnie w odległości 2 mm od miejsca urazu. Po otwarciu opony twardej należy wprowadzić kapilarnę Hamilton micro glass 1,5 mm poniżej grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego i wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórkowej. Wybierz szybkość wtrysku około 0,5 μl /min (min).
9. Pod koniec każdego wstrzyknięcia, a przed usunięciem naczynia włosowatego ze włókniny włóknistej należy odczekać co najmniej 1 minutę, pozwalając na rozciągnięcie tkanki w celu dostosowania się do nowej objętości komórki. (Rysunek 2)

Wyniki

Rysunek 1: Model tętniaka stłuczenia/ucisku klipsa. (A) Zdjęcie przez mikroskop chirurgiczny po laminektomii C7/T1 i stłuczeniu/ucisku rdzenia kręgowego szczura. (B) Zdjęcie klipsa ze sprężyną pierścieniową g...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klips tętniakowy	SharpTech
	Leica
Micro	World Precision Instruments, Inc.
Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt	David Kopf Instrumenty
Strzykawka Hamilton	Firma
Instrument chirurgiczny	Narzędzia
Isoflurane USP	Partnerzy farmaceutyczni Kanada Inc.
0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań USP	Baxter
7,5% jodu powidonu	Purdue Pharma 70
% Alkohol izopropylowy USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien

Mikroskop chirurgiczny System iniekcji Hamilton do nauki o naukach