$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Model stłuczenia / kompresji tętniaka szyjki macicy
- Przed zabiegiem należy sterylizować narzędzia w autoklawie i utrzymywać je w sterylności podczas całego zabiegu chirurgicznego, umieszczając je w kąpieli alkoholowej o stężeniu 70%.
- Znieczulenie szczurów Wistar (250-270 g) kombinacją tlenu (O2), podtlenku azotu (N2O) (1:1) i 1,8-2,2% izofluranu i wspomaganie spontanicznego oddychania za pomocą maski do znieczulenia gazowego. W celu indukcji znieczulenia zacznij od 5% izofluranu przez 1 minutę, a następnie zmniejsz. Przed rozpoczęciem operacji należy kontrolować głębokość znieczulenia, podając bolesny bodziec (np. w łapy). Stosuj tłuste maści do oczu, aby uniknąć wysuszenia i zapobiec późniejszym infekcjom.
- Połóż szczury na poduszce grzewczej (37 °C) i przymocuj głowę do ramy stereotaktycznej.
- Ogolić obszar chirurgiczny wokół odcinka szyjnego kręgosłupa i zdezynfekować jodonem powidonu i 70% alkoholem.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej powyżej kręgosłupa od kręgu szyjnego (C2) docierając do wydatnego wyrostka trzonu kręgu piersiowego 2 (T2).
- Przetnij zewnętrzną warstwę mięśni kręgowych bezpośrednio na linii środkowej (aby uniknąć krwawienia) w kierunku czaszkowo-ogonowym i dalej tępo rozetnij głębsze warstwy mięśni, aż dotrzesz do wyrostka kolczastego i blaszek. Wkładać zwijacze.
- Zorientuj wydatny processus spinosus trzonu kręgu T2, aby obserwować docelowe poziomy dla laminektomii. Po identyfikacji i mikrochirurgicznym przygotowaniu wybranych blaszek należy przeciąć więzadła kłamkowe w celu rozluźnienia blaszek i wyrostka kolczastego. Na koniec przetnij blaszki obcinaczem do kości bocznym w stosunku do rdzenia kręgowego i usuń je delikatnie, unikając ucisku samego rdzenia kręgowego.
UWAGA: Najczęstsze poziomy to C5/6, C6/7 lub C7/T1. Śmiertelność okołooperacyjna wzrasta wraz z poziomem urazu. Krwawienie z zatoki żylnej przykręgosłupowej jest powszechne i można mu zaradzić poprzez ostrożne uciskanie gąbką. - Przed włożeniem klipsa w celu uszkodzenia pępowiny, zidentyfikuj pojawiające się korzenie nerwowe, aby oszczędzić im przycinania (szczególnie na poziomach C5/6).
- W celu zapewnienia płynnej indukcji klipsa należy poluzować oponę twardą brzuszną od grzbietowej strony trzonów kręgów za pomocą haczyka i przygotować korytarz dla klipsa.
- Na koniec włóż otwarty klips i pozwól mu się zatrzasnąć (szybkie zamknięcie), aby uzyskać uraz spowodowany kontuzją. Siła zamykania klipsa i czas trwania zamykania klipsa określają intensywność urazu i stopień kompresji. Powszechnie stosowane są siły klipsa wynoszące od 15 do 35 g i czas przycinania wynoszący np. 1 minutę (rysunek 1).
- Po zdjęciu klipsa należy ułożyć mięśnie w 2 warstwach i zamknąć ranę.
- Przerwij znieczulenie i pozwól zwierzęciu obudzić się pod ciągłą obserwacją, aż odzyska wystarczającą świadomość do leżenia mostka. Na koniec umieść szczura w pojedynczej klatce i postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia pooperacyjnego.
- Ponieważ zwierzęta zmagają się z ciężkością tego typu urazów, należy zwrócić szczególną uwagę na leczenie pooperacyjne:
- Podawaj leki przeciwbólowe (buprenorfina i meloksykam odpowiednio przez 3 dni i 5 dni oraz zgodnie z objawami klinicznymi).
- Podawać dodatkowy roztwór soli fizjologicznej podskórnie przez 3 dni (2 razy dziennie po 5-10 mililitrów (ml)).
- Podawaj antybiotyki w wodzie do picia 2 dni przed i do 7 dni po operacji (np. Moksyfloksacyna)
- Ściskaj pęcherz moczowy 2-3 razy dziennie, aż powrót do funkcji pęcherza będzie stale widoczny.
- Deficyty neurologiczne i stan fizjologiczny operowanych zwierząt należy obserwować co najmniej raz dziennie.
2. Wstrzykiwanie SAP i NPC (14 dni po urazie)
- Wywołaj znieczulenie zgodnie z opisem w 1.1 do 1.3, zamocuj głowę szczura w ramce stereotaktycznej, usuń szwy lub klipsy do ran i zdezynfekuj ranę i obszar operacyjny powidonem i 70% alkoholem.
- Ostrożnie wypreparuj mięśnie przykręgosłupowe, włóż retraktory, usuń mikroskopijnie tkankę bliznowatą z opony twardej i ponownie odsłonij miejsce zmiany.
- Przygotuj SAPs w stężeniu 1% (w/v) do wykonania żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. QL6 SAP mają fizjologicznie zgodne pH i nie muszą być buforowane przed wstrzyknięciem. Do wizualizacji SAP w rdzeniu kręgowym należy użyć fluorescencyjnej pochodnej QL6 (izotiocyjanian fluoresceiny QL6 [FITC]).
- Wstrzyknąć SAP (5 mikrolitrów (μl) do środka zmiany, rozprowadzając w 2 porcjach, każda 2,5 μl obustronnie od linii środkowej. Użyj strzykawki Hamilton połączonej z ramką stereotaktyczną za pomocą kapilary z mikroszkła (średnica zewnętrzna 100 mikrometrów (μm) [OD]). Ostrożnie otwórz oponę twardą końcówką ostrej igły i włóż szklaną kapilarnę stereotaktycznie na 2 milimetry (mm) do uszkodzonego rdzenia kręgowego.
- Po wstrzyknięciu 1/3 objętości należy usunąć igłę na głębokość 1,5 mm, a po upływie kolejnych 1/3 do 1 mm. Po wstrzyknięciu całej objętości, a przed wyjęciem strzykawki, należy odczekać 5 minut, aby ustabilizować tworzenie się żelu.
- Aby wygenerować NPC, użyj dorosłych myszy z czerwonym białkiem fluorescencyjnym discosoma (DsRed) (lub myszy z żółtym białkiem fluorescencyjnym [YFP], zielonych) i wyizoluj je i hoduj ze strefy przykomorowej.
- Oceń żywotność NPC za pomocą barwienia błękitem trypanowym, które wskazuje na obecność ~90% żywych komórek w zawiesinie komórki. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej (50 x 103 żywe komórki/μl), a następnie użyć ich do przeszczepu komórek.
- Wykonać cztery wstrzyknięcia dordzeniowe o objętości 2 μl (8 μl objętości całkowitej, zawierające 4 x 105 NPC) obustronnie w odległości 2 mm od miejsca urazu. Po otwarciu opony twardej należy wprowadzić kapilarnę Hamilton micro glass 1,5 mm poniżej grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego i wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórkowej. Wybierz szybkość wtrysku około 0,5 μl /min (min).
- Pod koniec każdego wstrzyknięcia, a przed usunięciem naczynia włosowatego ze włókniny włóknistej należy odczekać co najmniej 1 minutę, pozwalając na rozciągnięcie tkanki w celu dostosowania się do nowej objętości komórki. (Rysunek 2)
