Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Streszczenie

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w jądrze łożyska prążka końcowego (BNST), aktywność neuronów jest modulowana, co pozwala naukowcom analizować sygnały mózgu i mięśni związane z indukcją czuwania.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Chirurgia zwierząt, wstrzyknięcie wirusa, elektroda do EEG/EMG i implantacja światłowodu

UWAGA: Odpowiednie techniki ochrony i postępowania należy wybrać w oparciu o poziom bezpieczeństwa biologicznego wirusa, który ma być zastosowany. Wirus związany z adenowirusem (AAV) powinien być używany w izolowanym pomieszczeniu klasy P1A do wstrzykiwań, a probówka z AAV musi być sterylizowana w autoklawie po wykorzystaniu całej objętości. Miejsce operacji i cały wszczepiony materiał powinny być czyste i sterylne podczas użytkowania.

UWAGA: Patrz rysunek 1.

1. Zdezynfekuj sprzęt chirurgiczny za pomocą autoklawu.

2. Znieczulij myszy izofluranem za pomocą waporyzatora znieczulającego. Obserwuj, aż mysz osiągnie pożądaną głębokość znieczulenia, określoną przez utratę reakcji na szczypanie ogona kleszczami. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.

3. Zdezynfekuj pole operacyjne roztworem jodu lub 70% etanolem (EtOH, 3x) i wystarczająco wysusz. Pozwól wirusowi rozmrozić się na lodzie podczas wykonywania operacji. Przykryj obszar operacyjny chłonnym papierem laboratoryjnym.

4. Zamocuj głowę myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą pasków dousznych i szczypty do nosa. Po upewnieniu się, że głowa jest stabilnie trzymana, wykonaj nacięcie śródstrzałkowe na skórze głowy, aby upewnić się, że pozycje bregmy i lambdy znajdują się na tym samym poziomie na linii poziomej.

5. Aby uniknąć luki pozycjonującej, odpowiednio wyreguluj poziomy szczypania nosa i nauszników w górę iw dół. Bregma i lambda odnoszą się odpowiednio do przecięcia się sutura saggitalis i sutura coronalis lub sutura lambdoidal (ryc. 2).

6. Użyj klamer Serafin, aby przytrzymać skórę, aby utrzymać dostęp do czaszki. Po odsłonięciu czaszki należy zdezynfekować powierzchnię czaszki jodem lub 5%_H2O2, aby umożliwić wyraźniejsze uwidocznienie szwów czaszkowych, w tym bregmy i lambdy.

7. Przygotuj wstrzyknięcie wektora AAV:

1. Umyj wnętrze strzykawki o pojemności 10 ml (patrz Tabela materiałów) kolejno 70% EtOH, 100% EtOH i wysterylizowaną wodą, 5 razy każdy. Zamocować strzykawkę w zacisku ramienia pompy do mikroiniekcji i upewnić się, że cały roztwór ze strzykawki został opróżniony.

2. Ostrożnie zassać 2 μl oleju mineralnego bez pęcherzyków powietrza, a następnie odessać wyznaczoną objętość roztworu wirusa. Po aspiracji należy manipulować tłokiem i upewnić się, że roztwór wirusa pojawił się na końcu igły.

UWAGA: Objętość wstrzykniętego roztworu wirusa została określona w eksperymentach pilotażowych z użyciem tego samego szczepu myszy i tego samego produktu wirusowego. Zależność między objętością roztworu wirusa a zasięgiem obszaru zakażenia powinna być oszacowana z wyprzedzeniem.

8. Wstrzyknij wektor AAV:

styl 1. Wyreguluj końcówkę igły do mikroiniekcji na bregmie i zanotuj współrzędne jako oryginalny punkt. Przesunąć końcówkę do wyznaczonego miejsca wstrzyknięcia (dla BNST: przednio-tylna + 0,2 mm, przyśrodkowo-boczna ± 1,0 mm, grzbietowo-brzuszna - 4,2 mm) i umieścić końcówkę igły w tej pozycji. Umieść znak na czaszce i wywierć otwory o średnicy około 2 mm za pomocą wiertła dentystycznego z frezem z węglika spiekanego 0,7 mm. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej lub tkanki mózgowej.

2. Po usunięciu krwi z okolic otworów wacikiem, powoli przesuń igłę do pozycji BNST. Powoli wstrzyknąć wyznaczoną ilość roztworu wirusa (0,07 μl/min) za pomocą mechanicznego mikroiniektora. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę na 5 minut, aby roztwór wystarczająco naciekł do tkanki BNST. Ostrożnie wyjąć igłę.

3. W przypadku wstrzyknięć obustronnych, powtórz kroki 1.8.1-1.8.2 po drugiej stronie. Przez cały czas trwania zabiegu należy stosować sterylną sól fizjologiczną, aby czaszka była wilgotna.

UWAGA: Użyliśmy niestandardowych implantów elektroencefalograficznych (EEG)/elektromiograficznych (EMG) (szerokość: 5 mm, głębokość: 7 mm, wysokość: 1 mm) z czterema elektrodami EEG (4 mm), dwiema elektrodami EMG (2 mm; przyciąć elektrodę 4 mm do 2 mm za pomocą szczypiec) i 6 elektrod (4,5 mm) (ryc. 2A).

9. dwa druty ze stali nierdzewnej (patrz Tabela Materiałów), z których 1 mm izolacji jest zdjęty z obu końców do elektrod EMG. Dopasuj środek elektrod do bregmy, zaznacz położenie każdej elektrody EEG (przednio-tylna ± 1,5 mm, przyśrodkowo-boczna ± 1,0 mm) i określ położenie implantu (ryc. 2B).

10. Światłowody implantologiczne

:

1. Przymocuj tuleję światłowodową do manipulatora i obróć ramię manipulatora tak, aby miało kąt ±30° względem linii poziomej (proces ten jest potrzebny tylko w celu uniknięcia zakłóceń między elektrodami a światłowodami, np. w przypadku stymulacji BNST). Połóż końcówkę światłowodu na bregmie i zapisz współrzędne.

2. Przesuń końcówkę do docelowej linii wprowadzania i zaznacz pozycję na czaszce. Umieść również dodatkowe znaki w pobliżu miejsca wkręcenia kotwiących. Wywierć czaszkę w każdym miejscu wiertłem dentystycznym, aby wprowadzić światłowód i przykręcić. Przykręć do czaszki. Uważaj, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki śrubą.

3. Włóż światłowód delikatnie, aż sięgniesz powyżej BNST za pomocą manipulatora. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce (ryc. 1B).

4. Nałóż fotoutwardzalny cement dentystyczny (patrz Tabela Materiałów), aby pokryć włókno i. Czas reakcji do zestalenia kleju powinien być określony w instrukcji producenta (Nasz materiał wymaga ekspozycji na światło przez co najmniej 10 sekund za pomocą fotogeneratorów o określonej długości fali. Po tym nie ma potrzeby suszenia kleju).

5. W tym kroku upewnij się, że żadne materiały (lub klej) nie zajmują miejsca na montaż elektrod. Ponadto należy unikać przerywania cementu dla tulejki łączącej się ze światłowodem i. Powtórz kroki 1.10.1-1.10.4 po przeciwnej stronie dla stymulacji obustronnej.

11. Wywierć otwory na elektrody EEG/EMG. Włóż końcówki elektrod do otworów. Przytrzymaj implant i nałóż klej cyjanoakrylowy na przestrzeń między czaszką a elektrodami. Włóż ponownie, uważając, aby nie kolidować z żadnymi materiałami.

12. Pokryj obwód elektrod i włókien światłowodowych klejem cyjanoakrylowym, a następnie nałóż na klej akcelerator cyjanoakrylianowy. Ten krok pozwala uniknąć przerw w łączeniu tulejkowego z optycznym i przewodu elektroda-przewód (rysunek 1C).

UWAGA: Klej cyjanoakrylowy i jego przyspieszacz są szkodliwe dla oka myszy. Uważaj, aby nie spowodować rozlania tych substancji chemicznych. Należy również uważać, aby nie dotykać mocno elektrod i włókien, aby uniknąć nieoczekiwanego odchylenia bezpośrednio po zestaleniu kleju.

13. Odsłoń mięśnie szyi myszy i włóż przewody elektrody EMG pod mięsień. Dostosuj długość elektrody EMG tak, aby znajdowała się tuż pod mięśniami karkowymi. Wystarczy lekkie połączenie między końcówką elektrody a powięzią mięśniową, aby złapać sygnał EMG.

14. Nałożyć klej cyjanoakrylowy, aby wypełnić implanty i zestalić klej płynem przyspieszającym. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby się zregenerować, aż pojawi się odruch posturalny. Dostosuj temperaturę poduszki grzewczej do temperatury ciała spoczynkowego zwierzęcia (36.0 °C w ZT 0-12 w przypadku myszy C57BL6; nie przekraczaj 38.0 °C).

UWAGA: Antybiotyk nie jest wymagany do sterylnej operacji. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi analgezji pooperacyjnej. Trzymaj myszy w klatce domowej przez okres rekonwalescencji wynoszący co najmniej 7 dni.

2. Monitorowanie EEG/EMG z fotowzbudzeniem docelowych neuronów w określonych stanach snu

UWAGA: Ten protokół obejmuje użycie sprzętu laserowego klasy 3B lub urządzeń LED. Eksperymentatorzy powinni być świadomi informacji dotyczących bezpieczeństwa. Wymagane są okulary ochronne.

1. Przed podłączeniem laserowego do światłowodu wyreguluj intensywność lasera za pomocą skalera. Przymocuj końcówkę laserowego do nieużywanego światłowodu za pomocą tulejki i upewnij się, że na styku światłowodu z nie ma miejsca.

2. Włącz główny wyłącznik lasera i odczekaj 20 minut, aż się rozgrzeje.

3. Wyślij laser do kontrolera intensywności i dostosuj intensywność lasera do 10 mW / mm². Zmień tryb lasera na logikę tranzystorową i potwierdź, że impulsy świetlne są emitowane ze światłowodu sterowanego przez regulator wzorca, który jest ustawiony na 10 ms dla czasu trwania, 40 ms dla spoczynku, 20 razy dla cyklu i 20 razy powtórz (czyli 20 Hz z 10 ms impulsy świetlne przez 20 s).

4. Po okresie rekonwalescencji przenieś myszy do komory doświadczalnej w celu zarejestrowania EEG/EMG. Myszy domowe utrzymywano w stałej temperaturze 23 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum.

5. Podłącz wszczepioną elektrodę i adapter, który jest przywiązany do pierścienia ślizgowego, aby uniknąć splątania. Zaleca się pokrycie złącza materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, takim jak folia aluminiowa, aby zapobiec wyciekowi lasera. Jeśli wymagany jest eksperyment dwustronny, użyj pierścienia ślizgowego z rozwidlonym mocowaniem do.

6. W tym protokole oceniamy opóźnienie do czuwania spowodowane snem bez szybkich ruchów gałek ocznych (NREM) lub snem z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM), dlatego czas nagrywania powinien być ograniczony w zoptymalizowanym czasie zeitgeber (ZT0 definiuje się jako czas, w którym światło jest włączone). Protokół ten został przeprowadzony pomiędzy ZT4 - ZT10. Pozwól myszom swobodnie przebywać w komorze doświadczalnej przez co najmniej 1 godzinę w ramach aklimatyzacji.

7. W okresie eksperymentalnym monitoruj sygnały EEG i EMG na tym samym monitorze i oceń stan myszy jako czuwanie, sen NREM lub sen REM. Użyj kontroli wzmocnienia dla każdej fali, aby ułatwić rozróżnienie każdego stanu.

8. W celu pomiaru opóźnienia snu do czuwania NREM, obserwuj stabilny sen NREM przez 40 s lub stabilny sen REM przez 30 s, a następnie włącz przełącznik generatora wzorców do fotostymulacji (protokół ten generuje 20 Hz z 10 ms impulsy świetlne przez 20 s). Potwierdź emisję lasera do wszczepionych światłowodów.

9. Rejestruj sygnały EEG/EMG, dopóki stan snu nie zmieni się w stan czuwania. Jeśli potrzebne są dwa lub więcej badań eksperymentalnych, ogranicz manipulację optogenetyczną do jednego dziennie, ponieważ fotostymulacja jest sztuczną interwencją, która może wpływać na architekturę snu / czuwania.

10. Po eksperymencie głęboko znieczulić i perfuzjonować sterylną solą fizjologiczną i paraformaldehydem (PFA) w celu pobrania próbki całego mózgu do analizy immunohistochemicznej.

Wyniki

Rysunek 1: Procedura wstrzykiwania AAV, implantów światłowodowych i implantów EEG/EMG. (A) Eksperymentalna procedura wstrzykiwania wirusa. Gen ChR2 lub EYFP (dla kontroli) z fuzją EYFP włączony do wektora AAV, którego tra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x1 Światłowodowe złącza obrotowe	Doric	FRJ 1x1 FC-FC	dla optogenetyki
6-pinowe złącze	header KEL corporation	DSP02-006-431G
Gniazdo 6-pin	Hirose	21602X3GSE
Przetwornik A/D	Nippon koden	N/A	Przetwornik analogowo-cyfrowy
AAV_{10} -EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×10^{13} (kopie genomowe/ml)
AAV_{10} -EF1a-DIO-EYFP			5.82×10^{13} (kopie genomowe/ml)
Ampicylina	Fuji film	014-23302
Wzmacniacz	Nippon koden	Nie dotyczy	rejestracji EEG/EMG
Parownik anestezjologiczny	Muromachi	MK-AT-210D
Automatyczny wtryskiwacz	KD scientific	780311
Frez z węglika spiekanego	Minitor	B1055	φ0,7 mm. Określany jako wiertło dentystyczne, używany z mikrosilnikiem obrotowym o dużej prędkości
Adhezja cyjanoakrylowa (Aron alpha A) i przyspieszenie	Konishi	#30533
Lampa do utwardzania zębów	3M	Elipar S10
Klej epoksydowy	Izolacja Konishi	# 04888	lutu 6-pinowego i ekranowanego
Patchcord światłowodowy (rozgałęziony)	Doric	BFP (#) _50/125 / 900-0,22
Myszy GAD67-Cre	dostarczone przez dr Kenji Sakimura		Gen rekombinazy Cre jest wbity w allel Gad67
Strzykawka Hamilton	Hamilton	65461-01
Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości	FOREDOM	K.1070	Używany z frezem z węglików spiekanych
Tuleja łącząca	Thorlab	ADAF1	φ2,5 mm Ceramiczny
izofluran	Pfizer	871119
Laser	Rapp OptoElectronic	Nie dotyczy	473nm długość fali
Laserowy kontroler intensywności	COHERENT	1098293
Stymulator laserowy	centrum badawcze	STO2	określany jako generator impulsów w tekście
Światłowód z tulejką	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	dostarczony przez PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	dostarczony przez Dr. Karla Deisserotha
krosowy	Doric	D202-9089-0,4	o długości 0,4 m, przewodnik laserowy między laserem a złączem obrotowym
pHelper	Stratagene
Fotoutwardzalny cement dentystyczny	3M	56846
Zacisk Serafin	Stoelting	52120-43P
ekranowany	mogami	W2780	do gniazda 6-pin do zapisu EEG/EMG
Komora do nagrywania snu	N	/A N/A	Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) z uchwytem na zbiornik na wodę
Oprogramowanie do znaków snu	KISSEI COMTEC	N/A	do analizy EEG/EMG
Neuronauka z pierścieniem ślizgowym	, inc	N/A	do analizy EEG/EMG
Śruba ze stali nierdzewnej	Yamazaki	N/A	φ1,0 x 2,0
Drut ze stali nierdzewnej	Drut Cooner	AS633	średnicy 0,0130 cala
Ramka stereotaktyczna z konsolą cyfrową	Koph	N/A	Model 940
Igła strzykawkowa	Hamilton	7803-05
Niezbędne oprogramowanie do nagrywania	KISSEI COMTEC	Nie dotyczy	do rejestracji EEG/EMG

do wokół Bio o