Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

2. Po usunięciu krwi z okolic otworów wacikiem, powoli przesuń igłę do pozycji BNST. Powoli wstrzyknąć wyznaczoną ilość roztworu wirusa (0,07 μl/min) za pomocą mechanicznego mikroiniektora. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę na 5 minut, aby roztwór wystarczająco naciekł do tkanki BNST. Ostrożnie wyjąć igłę.

3. W przypadku wstrzyknięć obustronnych, powtórz kroki 1.8.1-1.8.2 po drugiej stronie. Przez cały czas trwania zabiegu należy stosować sterylną sól fizjologiczną, aby czaszka była wilgotna.

UWAGA: Użyliśmy niestandardowych implantów elektroencefalograficznych (EEG)/elektromiograficznych (EMG) (szerokość: 5 mm, głębokość: 7 mm, wysokość: 1 mm) z czterema elektrodami EEG (4 mm), dwiema elektrodami EMG (2 mm; przyciąć elektrodę 4 mm do 2 mm za pomocą szczypiec) i 6 elektrod (4,5 mm) (ryc. 2A).

9. dwa druty ze stali nierdzewnej (patrz Tabela Materiałów), z których 1 mm izolacji jest zdjęty z obu końców do elektrod EMG. Dopasuj środek elektrod do bregmy, zaznacz położenie każdej elektrody EEG (przednio-tylna ± 1,5 mm, przyśrodkowo-boczna ± 1,0 mm) i określ położenie implantu (ryc. 2B).

10. Światłowody implantologiczne

1. Przymocuj tuleję światłowodową do manipulatora i obróć ramię manipulatora tak, aby miało kąt ±30° względem linii poziomej (proces ten jest potrzebny tylko w celu uniknięcia zakłóceń między elektrodami a światłowodami, np. w przypadku stymulacji BNST). Połóż końcówkę światłowodu na bregmie i zapisz współrzędne.

2. Przesuń końcówkę do docelowej linii wprowadzania i zaznacz pozycję na czaszce. Umieść również dodatkowe znaki w pobliżu miejsca wkręcenia kotwiących. Wywierć czaszkę w każdym miejscu wiertłem dentystycznym, aby wprowadzić światłowód i przykręcić. Przykręć do czaszki. Uważaj, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki śrubą.

3. Włóż światłowód delikatnie, aż sięgniesz powyżej BNST za pomocą manipulatora. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce (ryc. 1B).

4. Nałóż fotoutwardzalny cement dentystyczny (patrz Tabela Materiałów), aby pokryć włókno i. Czas reakcji do zestalenia kleju powinien być określony w instrukcji producenta (Nasz materiał wymaga ekspozycji na światło przez co najmniej 10 sekund za pomocą fotogeneratorów o określonej długości fali. Po tym nie ma potrzeby suszenia kleju).

5. W tym kroku upewnij się, że żadne materiały (lub klej) nie zajmują miejsca na montaż elektrod. Ponadto należy unikać przerywania cementu dla tulejki łączącej się ze światłowodem i. Powtórz kroki 1.10.1-1.10.4 po przeciwnej stronie dla stymulacji obustronnej.

11. Wywierć otwory na elektrody EEG/EMG. Włóż końcówki elektrod do otworów. Przytrzymaj implant i nałóż klej cyjanoakrylowy na przestrzeń między czaszką a elektrodami. Włóż ponownie, uważając, aby nie kolidować z żadnymi materiałami.

12. Pokryj obwód elektrod i włókien światłowodowych klejem cyjanoakrylowym, a następnie nałóż na klej akcelerator cyjanoakrylianowy. Ten krok pozwala uniknąć przerw w łączeniu tulejkowego z optycznym i przewodu elektroda-przewód (rysunek 1C).

UWAGA: Klej cyjanoakrylowy i jego przyspieszacz są szkodliwe dla oka myszy. Uważaj, aby nie spowodować rozlania tych substancji chemicznych. Należy również uważać, aby nie dotykać mocno elektrod i włókien, aby uniknąć nieoczekiwanego odchylenia bezpośrednio po zestaleniu kleju.

13. Odsłoń mięśnie szyi myszy i włóż przewody elektrody EMG pod mięsień. Dostosuj długość elektrody EMG tak, aby znajdowała się tuż pod mięśniami karkowymi. Wystarczy lekkie połączenie między końcówką elektrody a powięzią mięśniową, aby złapać sygnał EMG.

14. Nałożyć klej cyjanoakrylowy, aby wypełnić implanty i zestalić klej płynem przyspieszającym. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby się zregenerować, aż pojawi się odruch posturalny. Dostosuj temperaturę poduszki grzewczej do temperatury ciała spoczynkowego zwierzęcia (36.0 °C w ZT 0-12 w przypadku myszy C57BL6; nie przekraczaj 38.0 °C).

UWAGA: Antybiotyk nie jest wymagany do sterylnej operacji. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi analgezji pooperacyjnej. Trzymaj myszy w klatce domowej przez okres rekonwalescencji wynoszący co najmniej 7 dni.

2. Monitorowanie EEG/EMG z fotowzbudzeniem docelowych neuronów w określonych stanach snu

UWAGA: Ten protokół obejmuje użycie sprzętu laserowego klasy 3B lub urządzeń LED. Eksperymentatorzy powinni być świadomi informacji dotyczących bezpieczeństwa. Wymagane są okulary ochronne.

1. Przed podłączeniem laserowego do światłowodu wyreguluj intensywność lasera za pomocą skalera. Przymocuj końcówkę laserowego do nieużywanego światłowodu za pomocą tulejki i upewnij się, że na styku światłowodu z nie ma miejsca.

2. Włącz główny wyłącznik lasera i odczekaj 20 minut, aż się rozgrzeje.

3. Wyślij laser do kontrolera intensywności i dostosuj intensywność lasera do 10 mW / mm². Zmień tryb lasera na logikę tranzystorową i potwierdź, że impulsy świetlne są emitowane ze światłowodu sterowanego przez regulator wzorca, który jest ustawiony na 10 ms dla czasu trwania, 40 ms dla spoczynku, 20 razy dla cyklu i 20 razy powtórz (czyli 20 Hz z 10 ms impulsy świetlne przez 20 s).

4. Po okresie rekonwalescencji przenieś myszy do komory doświadczalnej w celu zarejestrowania EEG/EMG. Myszy domowe utrzymywano w stałej temperaturze 23 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum.

5. Podłącz wszczepioną elektrodę i adapter, który jest przywiązany do pierścienia ślizgowego, aby uniknąć splątania. Zaleca się pokrycie złącza materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, takim jak folia aluminiowa, aby zapobiec wyciekowi lasera. Jeśli wymagany jest eksperyment dwustronny, użyj pierścienia ślizgowego z rozwidlonym mocowaniem do.

6. W tym protokole oceniamy opóźnienie do czuwania spowodowane snem bez szybkich ruchów gałek ocznych (NREM) lub snem z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM), dlatego czas nagrywania powinien być ograniczony w zoptymalizowanym czasie zeitgeber (ZT0 definiuje się jako czas, w którym światło jest włączone). Protokół ten został przeprowadzony pomiędzy ZT4 - ZT10. Pozwól myszom swobodnie przebywać w komorze doświadczalnej przez co najmniej 1 godzinę w ramach aklimatyzacji.

7. W okresie eksperymentalnym monitoruj sygnały EEG i EMG na tym samym monitorze i oceń stan myszy jako czuwanie, sen NREM lub sen REM. Użyj kontroli wzmocnienia dla każdej fali, aby ułatwić rozróżnienie każdego stanu.

8. W celu pomiaru opóźnienia snu do czuwania NREM, obserwuj stabilny sen NREM przez 40 s lub stabilny sen REM przez 30 s, a następnie włącz przełącznik generatora wzorców do fotostymulacji (protokół ten generuje 20 Hz z 10 ms impulsy świetlne przez 20 s). Potwierdź emisję lasera do wszczepionych światłowodów.

9. Rejestruj sygnały EEG/EMG, dopóki stan snu nie zmieni się w stan czuwania. Jeśli potrzebne są dwa lub więcej badań eksperymentalnych, ogranicz manipulację optogenetyczną do jednego dziennie, ponieważ fotostymulacja jest sztuczną interwencją, która może wpływać na architekturę snu / czuwania.

10. Po eksperymencie głęboko znieczulić i perfuzjonować sterylną solą fizjologiczną i paraformaldehydem (PFA) w celu pobrania próbki całego mózgu do analizy immunohistochemicznej.