Transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimaka myszy w celu stymulacji słuchowej wywołanej światłem

Streszczenie

Źródło: Kozin, E. D., et.al. Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji szlaku słuchowego. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimakowego myszy (DCN) w celu umożliwienia stymulacji słuchowej wywołanej światłem. Wektor wirusowy kodujący opsynę, światłoczuły kanał jonowy, jest wstrzykiwany do DCN po kraniotomii i aspiracji móżdżku w celu uzyskania bezpośredniego dostępu. Ekspresja opsyn umożliwia aktywację neuronów przez światło, zapewniając model do badania reakcji szlaku słuchowego za pomocą optogenetyki.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Aspiracja móżdżku

1. Używając ssania francuskiego 5, zaaspiruj najbardziej boczną część lewej móżdżku leżącą nad DCN, aż DCN stanie się wizualny (Rysunek 1, prawy panel). Usuń około 1/4 do 1/3 lewego móżdżku. Głównym punktem orientacyjnym przylegającym do DCN jest bańka kanału półkolistego górnego.
   UWAGA: Aspiracja móżdżku jest kluczowym krokiem protokołu. Ukierunkowana aspiracja móżdżku jest najskuteczniejsza do wykonania, jeśli nastąpi jednorazowo, a nie przy wielu przejściach ssania, ponieważ spowoduje to krwawienie. Aby pomóc w aspiracji, ustaw płaszczyznę ogniskową mikroskopu na oczekiwanej głębokości CN, która będzie nieco dystalna do powierzchni móżdżku. Ustawienie płaszczyzny ogniskowej na CN poprawi wizualizację i zapewni ostry obraz.
2. Po aspiracji spodziewane jest dalsze krwawienie, nagromadzenie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i przemieszczenie móżdżku na DCN. Szybko wkropl 0,5 ml sterylnej soli fizjologicznej do kraniotomii, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Połączenie delikatnego wkłuwania z punktem dentystycznym i ssaniem może być następnie wykorzystane do oczyszczenia ścieżki do bezpośredniej wizualizacji DCN. Nie dotykaj bezpośrednio powierzchni DCN.

2. Mikroiniekcja ciśnieniowa w celu transferu genów za pośrednictwem wirusa i rekonwalescencji chirurgicznej

1. Po tym, jak DCN jest wolny od leżącej krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego i jest wyraźnie widoczny, wykonaj mikroiniekcji ciśnieniowe do DCN za pomocą 10 μl strzykawki Hamiltona przez okres 2 minut.
2. Wprowadzić igłę za pomocą mikromanipulatora, aż końcówka przestanie być widoczna pod powierzchnią DCN.
3. Aby uzyskać optymalną wydajność, użyj igły o rozmiarze 33 lub 34 (użyj gazoszczelnej strzykawki z igłą o rozmiarze 34) z płytkim skosem, takim jak 45°, aby zminimalizować uraz i zlokalizować objętość wstrzyknięcia w DCN, który jest cienką i płytką strukturą pnia mózgu (o grubości <300 μm).
   UWAGA: Można użyć innych narzędzi do mikroiniekcji. Idealnie byłoby, gdyby przyrząd do iniekcji był na tyle elastyczny, aby w razie potrzeby umożliwić lekkie zginanie, aby bezpośrednio skierować się na DCN. Ponadto, ponieważ mysz porusza się nieznacznie przez cały zabieg z powodu oddychania, instrument powinien być wystarczająco wytrzymały, aby wytrzymać niewielkie ruchy.

3. Rekonwalescencja chirurgiczna

1. Natychmiast po wstrzyknięciu należy ponownie przybliżyć skórę i pozwolić myszy na powrót do zdrowia zgodnie ze standardową procedurą odzyskiwania. Pozostały móżdżek i tkanka bliznowata wypełnią ubytek spowodowany aspiracją móżdżku. Stale monitoruj zwierzęta, aż do odzyskania wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Monitoruj tętno, częstość oddechów, a także zdolność do karmienia.
   UWAGA: Żadne zwierzę, które przeszło operację, nie wraca do klatki z innymi zwierzętami, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
2. Jeśli mysz zacznie chodzić w kółko po operacji (<5% przypadków), zwykle 2-4 godziny po zamknięciu nacięcia skóry, natychmiast poświęć mysz, ponieważ prawdopodobnie miałaby trudności z karmieniem. Ten efekt uboczny jest prawdopodobnie spowodowany aspiracją móżdżku. Zwierzę powinno być monitorowane pod kątem bólu pooperacyjnego i należy podać mu odpowiednie środki odurzające, aby zapewnić zwierzęciu komfort w oparciu o standardy instytucjonalne. Antybiotyki mogą być konieczne, jeśli istnieją dowody na infekcję.

Wyniki

Rysunek 1: Częściowa aspiracja móżdżku wykazuje dostęp do grzbietowego jądra ślimaka. Lewy panel: Po umieszczeniu myszy w uchwycie wykonuje się pionowe nacięcie przez skórę i tkanki miękkie wzdłuż tylnej części czaszki do tkanki miękkiej szyi. S...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Uchwyt stereotaktyczny	Stoelting	51500
5 Francuskie ssanie	Symetria Punkty chirurgiczne	2777914
dentystyczne	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Drobne narzędzia chirurgiczne	16020-14
10 μl Strzykawka Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Drobne narzędzia chirurgiczne	Rongeurs	16021-14