Stymulacja nerwu błędnego w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem

Streszczenie

Źródło: Childs, J. E., et al. Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje metodę stymulacji nerwu błędnego (VNS) w modelu szczura w celu zmniejszenia zachowania związanego z zamarzaniem. Szczury uwarunkowane strachem otrzymują VNS podczas ponownej ekspozycji na dźwięk, co prowadzi do zmniejszenia zamrażania i ujawnia jego potencjał terapeutyczny.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Warunkowanie strachu słuchowego

UWAGA: Ten protokół warunkowania strachu jest bardziej intensywny niż większość, ponieważ celem tych eksperymentów jest zwiększenie wygaszania. Przy łagodnym kondycjonowaniu strachu, które łatwo wygasić, efekt podłogi może przesłonić to wzmocnienie.

1. Zwierzęta domowe w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Codziennie dotykaj zwierząt podczas rekonwalescencji po operacji.
2. Ustawić aparaturę kondycjonującą i testującą, składającą się ze skrzynki operacyjnej umieszczonej w komorze wyciszającej (rysunek 1C). Skrzynka operacyjna ma przezroczyste plastikowe ścianki o wymiarach 20 x 20 x 20 cm i ma podłogę z siatki ze stali nierdzewnej, która jest podłączona do generatora wstrząsów nożnych. Użyj światła białego domu, aby oświetlić komorę do nagrywania wideo. Użyj tonu poziomu ciśnienia akustycznego (SPL) 9 kHz, 85 dB jako bodźca kondycjonowanego (CS).
3. Rejestruj zachowanie za pomocą kamery cyfrowej umieszczonej wewnątrz komory nad skrzynką operacyjną. Przeglądaj i monitoruj sesję na komputerze znajdującym się poza pokojem zachowań. Zapisuj filmy do późniejszej analizy.
4. Przetrzyj komory 70% etanolem przed i po każdej sesji, aby wyeliminować sygnały węchowe.
5. Kondycjonuj szczury ze strachu przez 2 dni (ryc. 2A). Potwierdź, że szczury nie boją się z natury tonu, prezentując 5 tonów (9 kHz, 85 dB, 30 s) pierwszego dnia. Upewnij się, że poziomy zamarzania są znikome.
   1. Postępuj zgodnie z początkowymi prezentacjami tonów z 8 parami ton-footshock (1 s, 0.5 mA) w każdym z 2 kolejnych dni. Powtórz parowanie ton-wstrząs stopowy ponownie drugiego dnia. Zmieniaj interwał między bodźcami (ISI) w zakresie od 2 do 4 minut, średnio 3 minuty dla każdej próby. Losowo wybierz punkt, w którym następuje wstrząs podczas dźwięku.
6. Trzeciego dnia przetestuj siłę skojarzenia ton/szok. Zagraj 4 tony z ISI wynoszącym 3, 4 lub 5 minut (średnia 4 minuty) przy braku wstrząsów stopami i rejestruj zachowanie zwierząt podczas prezentacji tonów i podczas interwałów między bodźcami jako miary uwarunkowanej reakcji strachu (CFR).
7. W 4 dniu rozpocznij trening wygaszania ze stymulacją nerwu błędnego (VNS) lub pozorowanym VNS.
   1. Podłącz szczury do stymulatora, wkładając męskie łączniki ze stymulatora do miejsca wejściowego stymulacji. Umieść zwierzęta w komorze (Rysunek 1A, 1C). Ustaw stymulator na 0,4 mA, szerokość impulsu 500 μs przy 30 Hz. Ustaw stymulację na całkowity czas trwania 30,15 s, rozpoczynając 150 ms przed nadejściem tonu. Zagraj w 4 tony zwierząt i sparuj każdą prezentację dźwiękową z VNS lub pozornym VNS.
8. Okresowo testuj integralność elektryczną mankietu i miejsca wejściowego za pomocą oscyloskopu.
   1. Podłącz zwierzę jak zwykle i podziel wyjście ze stymulatora na oscyloskop.
   2. Ustaw zakres na oscyloskopie od -20 V do +20 V i uruchom stymulację. Przebieg stymulacji 30 Hz powinien być widoczny na oscyloskopie. Stymulacje o napięciu przekraczającym 10 V wskazują na wysoką impedancję i nieprawidłowo działający mankiet lub połączenie w miejscu wejścia stymulacji.
9. Aby przetestować wpływ VNS na trening wymierania, uruchom drugi test CFR w 5 dniu. Zapisz czas spędzony na zamrażaniu podczas prezentacji tonów i porównaj go z bazowym zamrażaniem zarejestrowanym podczas pierwszego testu CFR.
10. Analizuj filmy za pomocą niezależnego obserwatora, który jest ślepy na warunki leczenia. Zmierz czas spędzony na zamrożeniu podczas prezentacji tonów za pomocą stopera. Zamrożenie definiuje się jako całkowite unieruchomienie, podczas którego szczur wykazuje szybkie oddychanie, opuszczoną głowę i rozłożone łapy. Analizę zachowania podczas zamrożenia można podzielić na dwie fazy: podczas prezentacji tonu i podczas interwału między bodźcami.

Wyniki

Rysunek 1. Stymulacja nerwu błędnego i konfiguracja eksperymentalna. (A) Schemat konfiguracji używanej dla VNS. Zwierzęta są podłączone do jednostki izolującej stymulację za pomocą nasadki czołowej, z której 2 druty platynowo-irydowe prowadzą podskórnie d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Betadine	Henry Schein	69066950
Aparat cyfrowy - Logitech webcam C210	Logitech	B003LVZO88
Platynowy drut irydowy	Medwire	10IR9/49T
Izolowany stymulator impulsów model 2100	Systemy	720000
Sinometr Oscyloskop jednokanałowy 10 MHz	Sinometr	CQ5010C
Extech 407730 40-130-decybelowy cyfrowy miernik poziomu dźwięku	Extech Instruments	B000EWY67W
podwójnym wyjściem DSCK-C, zaszyfrowany szoker	Kinder Scientific Co

AM