$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Materiały i odczynniki
- Zwierzęta
- Do eksperymentów użyj sześciotygodniowych samic myszy CF1 o wadze 30–35 g.
UWAGA: Myszy trzymano w grupach (5 myszy w klatce) w indywidualnie wentylowanych, sterylizowanych klatkach z 1/4" kolb kukurydzy i 2-calowymi kwadratowymi gniazdami do gniazdowania. Klatki utrzymywano w kontrolowanym 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym, a temperatura w pomieszczeniu wynosiła od 19,4 °C do 25 °C. Myszy były karmione globalną dietą gryzoni i automatycznym systemem dostarczania wody.
- Instruments
- Użyj następujących narzędzi chirurgicznych, aby skutecznie przeprowadzić operację: jednorazowe strzykawki (27 G, 1.0 mL) do iniekcji dootrzewnowej, maszynka do strzyżenia futra, mikroskop stereo preparacyjny, kleszcze do mikrooperacji, nożyczki do mikrochirurgii oraz małe kości i sterylizowane gąbki z włókniny.
UWAGA: Wszystkie narzędzia i materiały są sterylizowane w autoklawie przed zabiegiem lub wstępnie sterylizowane przez producentów. Podczas zabiegu narzędzia są spryskiwane 75% alkoholem, aby zachować sterylność.
- Anesthetic Solutions
- Użyj roztworu znieczulającego #1, aby wywołać znieczulenie i użyj roztworu znieczulającego #2 przed wstrzyknięciem zwojów korzenia grzbietowego (DRG), aby utrzymać znieczulenie.
- Aby przygotować roztwór znieczulający #1, rozcieńczyć ketaminę i ksylazynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w końcowym stężeniu 10 mg/ml i 1,2 mg/ml.
- Aby przygotować roztwór znieczulający #2, rozcieńczyć awertynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o końcowym stężeniu 20 mg/ml.
- Plazmid DNA i oligonukleotydy RNA
- Przygotuj plazmidy za pomocą zestawu komercyjnego, postępując zgodnie z protokołami producenta. Rozcieńczyć plazmidowe DNA w sterylnej wodzie dejonizowanej do stężenia 2,0 μg/μL.
- Dodaj roztwór barwnika Fast Green, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,005–0,01% (v/v) w celu lepszej wizualizacji konturu DRG podczas wstrzykiwania.
- Rozpuścić małe interferujące RNA (siRNA) lub oligonukleotydy mikroRNA (oligonukleotydy mikroRNA) w odpowiednich dostarczonych przez producentów, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μM.
- Pipeta do mikroiniekcji
- Pociągnij szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet i odetnij końcówkę wyciągniętej szklanej pipety kapilarnej nożyczkami do mikrochirurgii, aby uzyskać otwór o średnicy zewnętrznej około 50 μm. Następnie sterylizuj szklaną pipetę w świetle UV na czystej ławie przez około 20–30 minut.
- Zamontuj wysterylizowaną szklaną pipetę na uchwycie pipety podłączonym do wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji. Ustaw parametry systemu mikroiniekcji na ciśnienie 30 psi i czas trwania 8 ms.
- Electroporation System
- Podłącz elektrody do systemu elektroporacji fali prostokątnej i ustaw następujące parametry: 15 ms impulsy przy 35 V w odstępach 950 ms dla elektroporacji in vivo.
- Roztwór do perfuzji i utrwalania
- Rozpuść proszek paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w stężeniu 4% (w/v). Przechowywać roztwór PFA w temperaturze 4 °C.
2. Procedury eksperymentalne
- Chirurgiczne narażenie DRG L4 i L5
- Znieczulij mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia roztworu znieczulającego #1 przygotowanego wcześniej (ketaminą 100 mg/kg masy ciała i ksylazyną 12 mg/kg masy ciała).
- Ogol obszar chirurgiczny za pomocą maszynki do strzyżenia futra.
UWAGA: Ponieważ będzie kolejna operacja zmiażdżenia lewego nerwu kulszowego, sierść lewej tylnej części uda może być golona jednocześnie. - Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) i monitoruj temperaturę w odbycie za pomocą sondy temperatury.
- Aby przetestować znieczulenie, uszczypnij palce u nóg i ogon myszy i obserwuj reakcje behawioralne.
- Przyklej cztery kończyny myszy do tablicy korkowej.
- Przetrzyj obszar chirurgiczny roztworem jodoforu, a następnie użyj 75% alkoholu, aby usunąć jodofor przed przecięciem skóry.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Przed nacięciem zaznacz obie strony grzebieni biodrowych cienkim markerem. Narysuj linię łączącą dwa punkty grzbietów biodrowych, aby ułatwić identyfikację pozycji DRG L5.
- Wykonaj 3 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej dolnej części pleców za pomocą mikronożyczek. Ponadto odłącz mięśnie przykolcowe, takie jak mięsień wielodzielny i mięsień najdłuższy lędźwiowy, od wyrostków kolczystych L3 do S1 i odsłoń stawy międzywyrostkowe L4-5 i L5-6.
- Użyj mikro-rongeur, aby usunąć stawy międzywyrostkowe L4-5 i L5-6. Ponadto usuń lewy łuk nerwowy L4 i L5, aby odsłonić grzbietową stronę DRG.
- DRG Injection
- Wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór znieczulający #2 (z avertyną 200 mg/kg masy ciała) w celu podtrzymania znieczulenia przed wstrzyknięciem DRG.
- Załaduj plazmidy DNA lub oligonukleotydy RNA (1 μl na DRG) do szklanej pipety kapilarnej.
- Ostrożnie włóż końcówkę szklanej pipety kapilarnej do DRG.
- Stopniowo wstrzykiwać 1,0 μl roztworu plazmidów DNA lub oligonukleotydów RNA do DRG za pomocą wewnątrzkomórkowych systemów dozowania mikroiniekcji (30 psi, 8 ms).
UWAGA: Czas trwania wstrzyknięcia nie powinien trwać krócej niż 5 minut.
- Electroporation
- Upuść PBS na końcówki elektrod.
- Oczyść krwawienie za pomocą wysterylizowanej kwadratowej gazy bawełnianej.
- Delikatnie ściśnij docelowy DRG elektrodami i zastosuj 5 kwadratowych impulsów elektrycznych za pomocą systemu elektroporacji.
- Zamknij odpowiednio warstwy mięśni i skóry za pomocą nylonowych szwów 5-0.
- Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) pod ścisłą ostrożnością, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.
UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1 000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
- Zmiażdżenie nerwu kulszowego
- Dwa lub trzy dni (w zależności od projektu eksperymentalnego) po elektroporacji DRG, znieczulij mysz dootrzewnowo roztworem znieczulającym #2 (z avertin 400 mg/kg masy ciała).
- Przyklej cztery kończyny myszy do tablicy korkowej.
- Wykonaj 1 cm nacięcie 0,5 cm w lewo wzdłuż linii środkowej. Przetnij mięśnie, takie jak mięsień pośladkowy wielki i mięsień gruszkowaty, podłużnie. Odsłoń odcinek nerwu kulszowego między większym otworem kulszowym a wcięciem kulszowym.
- Zmiażdż nerw kleszczami mikrochirurgicznymi przez 12 s i oznacz miejsce zmiażdżenia nylonowym szwem epineuralnym 10-0. Zrób węzeł na membranie opony twardej, aby zaznaczyć miejsce zgniecenia.
- Zamknij warstwy mięśni i skóry za pomocą nylonowego szwu 5-0.
- Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) ze szczególną uwagą, aż całkowicie odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.
UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1 000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
- Perfuzja myszy, DRG i zbiór nerwu kulszowego
- Dwa lub trzy dni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego (w zależności od projektu eksperymentalnego), znieczulij mysz dootrzewnowo roztworem znieczulającym #2.
- Perfuzję myszy przezsercowo z PBS (pH 7,4), a następnie lodowato zimnym 4% paraformaldehydem (PFA) (pH 7,5) w PBS.
- Po perfuzji ostrożnie oddziel DRG wraz z korzeniami nerwowymi i nerwem kulszowym przed kolanem za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść nerw kulszowy bezpośrednio w 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C.
- Obrazowanie i pomiar znakowanych fluorescencyjnie aksonów czuciowych
- Ostrożnie zdejmij przyczepioną tkankę i błonę na utrwalonym nerwie kulszowym za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie zamień 4% PFA na PBS i trzykrotnie umyj nerw.
- Umieść nerw kulszowy na szkiełku i trzymaj go prosto. Dodaj 80 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu wokół nerwu, a następnie połóż na nim szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz całą zamontowaną tkankę pod naciskiem.
- Umieść spłaszczone tkanki na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w akcesorium do akwizycji mozaiki i przetwarzania obrazu.
UWAGA: Długości wzbudzenia i emisji wynoszą 488 nm i 509 nm. Możliwe jest również ręczne wykonanie wielu nakładających się obrazów i zszycie obrazów za pomocą ImageJ z wtyczką Mosaic. - Mierząc długość zregenerowanych aksonów, prześledź wszystkie możliwe do zidentyfikowania fluorescencyjnie znakowane aksony w nerwie kulszowym od miejsca zmiażdżenia (oznaczonego szwem epineuralnym 10-0) do dystalnych końców aksonu.