Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórek nerwowych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu

Streszczenie

Źródło: Furmanski, O., et al. Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki nerwowe pochodzące z komórek macierzystych są stereotaktycznie wstrzykiwane do granicy istoty szarej i istoty białej kory głębokiej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Przeszczepione komórki integrują się z tkanką, wspomagając regenerację funkcjonalną i naprawę obwodów w uszkodzonym mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Stereotaktyczne przeszczepienie zawiesiny komórkowej

1. Procedurę przeszczepu komórek należy rozpocząć około 24 godziny po kraniektomii.
2. Przygotuj sprzęt do przeszczepu komórek i materiały chirurgiczne
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej do irygacji ran. Podłączyć igłę 25 G do strzykawki, aby kontrolować irygację.
   2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem CsA (cyklosporyny A) w celu immunosupresji. Do strzykawki CsA przymocować igłę o długości 25 G lub większą. W razie potrzeby należy uzupełnić strzykawkę CsA między operacjami.
   3. Przygotować szklane igły z pipet kapilarnych ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm przy użyciu standardowych metod.
   4. Użyj cienkiej pęsety, aby złamać końcówki igieł do średnicy około 200 μm. Upewnij się, że cylindryczny trzon igły nie jest dłuższy niż 2,5 cm.
3. Skalibrować pompę strzykawkową do użytku ze strzykawką o pojemności 10 μl. Wprowadź natężenie przepływu 0,2 μl/min, aby uzyskać całkowitą objętość 2,0 μl.
4. Przygotować zawiesinę indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).
   1. Wykonuj wszystkie czynności związane z komórkami w kapturze BSL-2 (poziom bezpieczeństwa biologicznego-2) przy użyciu standardowych technik sterylnego obchodzenia się.
   2. Przygotować hodowle komórkowe z wyprzedzeniem zgodnie ze standardowymi warunkami określonymi dla danego typu komórki.
      UWAGA: W eksperymentach pokazanych w tej demonstracji wykorzystano różne komórki fenotypu nerwowego pochodzące z hiPSC.
   3. Delikatnie zdysocjuj komórki w zawiesinę jednokomórkową za pomocą roztworu do odrywania komórek lub innych preferowanych środków enzymatycznych lub chemicznych.
   4. Policz komórki w zawiesinie, a następnie rozcieńcz zawiesinę do 5 x 10⁴ komórek/μl w minimalnej pożywce do hodowli komórkowej (np. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) w 1,7 ml probówki z klapką.
   5. Przestrzegać następujących uwag dotyczących przeszczepu:
      1. Utrzymuj komórki w zawiesinie w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegów.
      2. Strzykawkę należy ładować tylko bezpośrednio przed wykonaniem wstrzyknięcia śródmiąższowego
         UWAGA: Jeśli zawiesina komórek zostanie położona na boku, grawitacja może spowodować jej osiadanie lub przyleganie do boku strzykawki, co prowadzi do nieprawidłowości w liczbie wstrzykiwanych komórek.
      3. Przydziel ~ 5 x 10⁵ komórek (zawiesina 10 μL) na mysz w przypadku wykonywania zabiegów przeszczepu wielu komórek w ciągu jednego dnia.
5. Wykonaj operację przeszczepu stereotaktycznego
   1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia podłączonej do parownika izofluranu ze źródłem sprężonego tlenu. Wywołaj znieczulenie ~3% izofluranem o stężeniu tlenu ~0,7 l/min.
   2. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce z dołączonym stożkiem znieczulającym na nos.
      1. Przymocuj głowę do pozycji za pomocą pasków do uszu i paska do gryzienia, ustawiając głowę tak, aby kość czołowa czaszki była pozioma. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5%-2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.
   3. Wykonaj pielęgnację przedoperacyjną i przygotowanie aseptyczne
      1. Nałóż nawilżającą maść okulistyczną zawierającą antybiotyki na oczy za pomocą bawełnianego wacika.
      2. Przepłukać miejsce nacięcia sterylną solą fizjologiczną, aby oczyścić miejsce i poluzować szwy. Delikatnie nałóż 70% etanolu za pomocą bawełnianego wacika, aby wysterylizować miejsce nacięcia.
   4. Usuń szwy za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek okulistycznych. Przepłukać miejsce operacji i kraniektomię dużą ilością sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
      1. Jeśli kora wykazuje cechy dyskwalifikujące, takie jak nadmierna przepuklina, przebarwienia, zaburzone unaczynienie lub krwotok, zwierzę powinno zostać wykluczone.
   5. Załaduj strzykawkę do przeszczepu komórek
      1. Przenieś zawiesinę komórek z inkubatora o temperaturze 37 °C do kaptura bezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych. Delikatnie zakręć lub postukaj w rurkę, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek.
      2. Użyj mikropipetora, aby załadować ~7,5 μl zawiesiny komórek do strzykawki Hamilton przez końcówkę tłoka.
         1. Trzymaj strzykawkę pod kątem ~120° z końcem tłoka skierowanym w dół. Włożyć tłok, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza między zawieszenie a końcówkę tłoka.
      3. Przymocować zespół uszczelki do igły do pipety, a następnie przymocować igłę do strzykawki.
      4. Nacisnąć tłok, aby przesunąć zawiesinę komórek do igły do pipety. Jeśli występuje opór przed wypływem zawiesiny, użyj cienkiej pęsety, aby złamać końcówkę igły, aby zwiększyć średnicę.
   6. Podłączyć strzykawkę do stereotaktycznej pompy strzykawkowej. Przesunąć tłok, aby upewnić się, że zespół pompy strzykawkowej działa prawidłowo.
   7. Przesunąć igłę do współrzędnych do wstrzyknięcia.
      1. Wyrównaj końcówkę igły do bregma. Ustaw współrzędne X i Y na 0. Następnie przesunąć końcówkę igły nad kraniektomią do 2,0 mm bocznie i -1,0 mm do tyłu do bregmy. Przyłóż końcówkę igły do powierzchni opony twardej i ustaw współrzędną stereotaktyczną na Z = 0.
      2. Nacisnąć tłok, aby upewnić się, że zawiesina komórek przepływa prawidłowo, zanim wprowadzi się igłę do mózgu.
      3. Wprowadzić igłę do mózgu na głębokość Z = -1,4 mm. Te stereotaktyczne współrzędne umieszczają przeszczep na granicy istoty szarej i białej kory głębokiej.
   8. Uruchomić pompę strzykawkową, aby wprowadzić zawiesinę komórek. Ustaw timer na stole laboratoryjnym na 15 minut i uruchom timer. Użyj mikroskopu o dużej odległości roboczej, aby monitorować odpływ zawiesiny komórek.
      1. Nawadniaj miejsce operacji sterylną solą fizjologiczną podczas iniekcji, aby utrzymać nawodnienie tkanek.
      2. Po 15 minutach powoli wyjmij igłę do przeszczepu. Przepłukać miejsce operacji solą fizjologiczną i zamknąć nacięcie szwami.
   9. Wykonaj opiekę pooperacyjną
      1. Przerwij znieczulenie. Podać CsA we wstrzyknięciu podskórnym w kark w dawce 10 mg/kg mc. Umieść mysz w czystej i wstępnie ogrzanej klatce pooperacyjnej.
      2. Podać przeciwbólowy paracetamol w wodzie pitnej w ilości 1,0 mg/ml.
         UWAGA: Podać środek przeciwbólowy zgodnie z odpowiednim standardowym protokołem operacyjnym (SOP) Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) oraz z uwzględnieniem zmiennych wyników doświadczalnych.
      3. Zapewnij zwilżoną klatkę do odzyskiwania pokarmu, aby pomóc w nawodnieniu i regeneracji.
6. Kontynuować codzienne wstrzyknięcia CsA w dawce 10 mg/kg mc. przez cały okres przeżycia myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
strzykawki	Becton Dickinson (BD)	309659
1,7 ml probówki z klapką	Denville	C2170
10 mikrolitrów strzykawka	Hamilton	7635-01
25G Igły do strzykawek Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70% etanolu			Produkt do wyboru; różni się w zależności od regionu
Zawiesina doustna acetaminofenu	Tylenol (dla dzieci)		Rozcieńczyć do 1 mg/ml w wodzie
Parownik znieczulający	Vetland	0521-11-22
Ściereczka		do obsługi zwierząt	Zakup w domu towarowym
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
Sprężony tlen			Produkt do wyboru; różni się w zależności od regionu
Cyklosporyna A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Taśma izolacyjna	3M Corporation		Zakup w domu towarowym
Pęseta drobnoziarnista	Fine Science Tools	11254-20
Kleszcze	Fine Science Tools	91106-12
Pipety kapilarne szklane, 1 mm OD, 0,58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-3
Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Frez Zestaw 5	Cell Point Scientific	60-1000
Impact One Stereotaktyczny impaktor do CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Zegary laboratoryjne	Fisher Scientific	14-649-17
Mikropipeta ściągacz	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Wystarczy dowolny ściągacz
Szkiełka nasadkowe do mikroskopu	Fisherbrand	12-545-E Średni
		uchwyt do montażu szkiełek mikroskopowych	Produkt do wyboru
Lustro			Zakup w domu towarowym
Uchwyt igły hemostat	Fine Science Tools	12002-12
Okulistyczny maść	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Okulistyczne nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15018-10
Plastikowe pudełko			Zakup w domu towarowym
Plastikowy cylinder			Zakup w domu towarowym
Pompa strzykawkowa z napędem QSI	Stoelting	53311
Wyjmowana igła złączka zaciskowa	Hamilton	55750-01
Mała rama stereotaktyczna dla gryzoni	Stoelting	51925
Małe nożyczki	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Sterylne podkładki nasączone alkoholem	Fisherbrand	06-669-62
Sterylne waciki bawełniane/Końcówki Q Kendall	Tyco Healthcare	540500
Sterylna sól fizjologiczna	Hospira	NDC-0409-1966-07
Stopery (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus Gold	Fisherbrand	15-188-48
Szwy - jedwab 5.0 z zakrzywioną igłą	Oaza	MV-682

>1 ml