Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

Streszczenie

Źródło: Tagliafierro, L., et al. Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje transdukcję lentiwirusową nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w celu ukierunkowanej modyfikacji epigenetycznej alfa-synukleiny, kluczowego białka w chorobie Parkinsona. Protokół umożliwia metylację DNA za pośrednictwem metylotransferazy, zmniejszając ekspresję SNCA w celu zbadania regulacji genów i potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Protokół

1. Różnicowanie dopaminergicznych nerwowych komórek progenitorowych

1. Rozmrażanie MD NPC (dopaminergiczne neuronalne komórki progenitorowe śródmózgowia)
   1. Przygotuj płytkę pokrytą BMM (podstawowa membrana matrycowa) i ogrzej ją kompletną N2B27. Dodaj 10 ml ciepłego DMEM/F12 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść kriowial w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C na 2 minuty.
      1. Przenieś komórki z kriowialu do probówki zawierającej DMEM/F12. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
      2. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 2 ml N2B27 i dodać zawiesinę komórek do jednego dołka płytki pokrytej BMM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

2. Transdukcja NPC MD i analiza zmian metylacji

1. Transdukcja NPC MD
   1. Transdukuj NPC MD przy 70% zbiegu z RNA przewodnika LV (lentiviral vector)/dezaktywowanym Cas9-DNMT3A (enzym metylotransferazy DNA 3A) w MOI (wielokrotność infekcji) = 2. Wymień pożywkę N2B27 16 godzin po transdukcji.
   2. Dodać N2B27 z 5 μg/ml puromycyny, 48 godzin po transdukcji. Hoduj komórki przez 3 tygodnie w N2B27 z puromycyną, aby uzyskać stabilne linie NPC MD. Komórki są gotowe do dalszych zastosowań (DNA, RNA, analiza białek, charakterystyka fenotypowa, zamrażanie i pasażowanie).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wyposażenie
15 mL stożkowe probówki wirówkowe	Corning	430791
6-dołkowe Corning		3516
Wirówka stołowa Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica	DM IRB2
Odczynniki
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Suplement (50X), bez witaminy A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
Suplement N-2 (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

do hodowli komórkowych