Transdukcja wirusa w macicy u myszy

Streszczenie

Źródło: Lutz, D., et al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje transdukcję wirusa poprzez wstrzyknięcie do macicy w zarodkach myszy. Ciężarna mysz jest przygotowywana do operacji, a następnie wykonuje się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia rogów macicy. Mieszanina wirusa zawierającego pożądany gen i barwnika śledzącego jest wstrzykiwana do zarodków w workach macicznych w docelowych miejscach. Rogi macicy są następnie umieszczane z powrotem przed szyciem.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Transdukcja w macicy

:

1. Przygotować kodowanie wirusa związanego z adenowirusem typu 1 (AAV1) dla pożądanego celu (4 x 10¹¹ cząstek wirusa/μL AAV1) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przy pH 7,4. Dodać 0,1 mg/μL Fast Green i przechowywać mieszaninę AAV1-Fast-Green w temperaturze 37 °C.
2. Przygotować cienką końcówkę kapilarną o pożądanym kształcie (8 mm długości, średnicy zewnętrznej 80 μm i średnicy wewnętrznej 50 μm) za pomocą ściągacza do mikropipet (ustawienia: ciśnienie = 500, ciepło = 700, pociągnięcie = 0, prędkość = 80, czas = 200, patrz Tabela materiałów). Złam końcówkę kapilary tak, aby miała 4-5 mm.
3. Zamontuj rurkę aspiratora (44 cm x 0,7 cm) z końcówką kapilarną i zasysaj 15 μl mieszaniny AAV1-Fast-Green do kapilary.
4. Utrzymuj zwierzęta w stałej fizjologicznej temperaturze ciała wynoszącej 37 °C przez cały czas trwania zabiegu.
5. Umieść ciężarną mysz C57Bl/6 (14,5 dnia embrionalnego) w komorze preinkubacyjnej i znieczulij mysz gazowym 4% izofluranem (o objętościowym natężeniu przepływu powietrza 0,6-0,8 l/min).
6. Podskórnie wstrzyknąć buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała).
7. Umieść znieczuloną mysz na podgrzanej płytce chirurgicznej (37 °C).
8. Zakryj oczy lubrykantem.
9. Dopasuj mysz do maski anestezjologicznej (gazowy 1,5% izofluranu o objętościowym natężeniu przepływu powietrza 0,6-0,8 l/min) na płytce operacyjnej i ogol obszar skóry brzucha. Przetrzyj ogolony obszar 3X 75% etanolem, a następnie roztworem betadyny.
   UWAGA: Stale monitoruj oddychanie znieczulonej myszy. Dostosuj stężenie izofluranu zgodnie ze wzorcem wdechu i wydechu myszy.
10. Sprawdź, czy nie ma odruchu podeszwowego, ściskając paliczki tylnej łapy myszy.
11. Otwórz jamę brzuszną, chwytając skórę zakrzywionymi ząbkowanymi kleszczykami do tęczówki (10 cm) i przecinając skórę wzdłuż kresy środkowej prostymi nożyczkami z węglika wolframu (10 cm), a następnie chwytając ścianę otrzewnej prostą pęsetą Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) i przecinając ścianę wzdłuż kresy białej prostymi nożyczkami Vanny (8 cm).
12. Umieść kawałek fenestrowanej folii parafinowej na otworze brzusznym i przymocuj folię na obu końcach za pomocą kleszczy hemostatycznych do mikrokomarów (12,5 cm, zakrzywionych).
13. Odsłoń rogi macicy za pomocą urządzenia przypominającego łyżkę, aby uniknąć uszkodzenia zarodków wewnątrz rogów macicy. Wlej kilka kropli PBS (37 °C) na rogi macicy i sprawdź zarodki pod kątem uszkodzeń lub wad rozwojowych wewnątrz worka macicy.
14. Udokumentuj kolejność i położenie zarodków w rogach macicy. Ostrożnie obracać zarodki wewnątrz worka macicy, aż do osiągnięcia pożądanej pozycji do wstrzyknięcia.
15. Wstrzyknąć 1-2 μl mieszaniny AAV1-Fast-Green, dokonując oględzin miejsca wstrzyknięcia (np. komór mózgu) i penetracji barwnika pod mikroskopem stereoskopowym.
16. Udokumentuj wstrzyknięte zarodki i umieść rogi macicy z wstrzykniętymi zarodkami z powrotem w jamie brzusznej.
17. Wlać kilka kropli PBS (37 °C) do jamy brzusznej. Zamknij jamę, zszywając ścianę otrzewnej (użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 6-0) i skórę (użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 3-0) za pomocą kleszczyków hemostatycznych Halsteda (12,5 cm, zakrzywionych). Alternatywnie, użyj prostego przerywanego wzoru lub szwów/zszywek ze stali nierdzewnej, aby zamknąć jamę brzuszną i skórę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
igła 26Gx 1''	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anestezjologiczne urządzenie do pompy powietrza	Instrumenty Biomedyczne (Univentor)	8323102
Adenowirus serotyp 1 (AAV1)	UKE (wirusowy) Core Facility)	-	Dla odniesień i obszarów docelowych AAV1 patrz: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ a także: Projektant wektorów dostarczania genów: inżynieria molekularna i ewolucja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w celu zwiększonego transferu genów. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar; 25(3):489-99. Rekombinowane wektory wirusa AAV pseudotypowane kapsydami wirusowymi z serotypów 1, 2 i 5 wykazują różną wydajność i tropizm komórkowy po dostarczeniu do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 sierpień; 10(2):302-17. Samokomplementarne wektory rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (scAAV) sprzyjają efektywnej transdukcji niezależnie od syntezy DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 sierpień; 8(16):1248-54.
Pompa powietrza	Instrumenty biomedyczne (Univentor)	Eheim 100
Aspirator Zespoły strojenia	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Maska oddechowa Mysz Anodowane aluminiowe	instrumenty biomedyczne (Univentor)	-
Buprenorfina	Ampułki	temgesic	środek przeciwbólowy
Kapilary	Nauka-Produkty	GB100TF-10	z fillamentem
Pęseta Dumont (#3, 12 cm, prosta, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Golarka elektryczna	Phillips	-
Nici Ethicon (Ethilon, 6-0 i 3-0)		Ethicon-poliamid
Smar do oczu	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	do wizualizacji wstrzykiwanych cieczy
Przełącznik routingu gazu Złącza 4/2 Instrumenty	biomedyczne (Univentor)	8433020
Kleszcze hemostatyczne Halsted Mosquito (12,5 cm, proste)	FST	13011-12
Skrzynka indukcyjna dla myszy z pokrywą przesuwaną poziomo.Wymiary wewnętrzne: DxBxH: 155x115x130 mm.Grubość ścianki: 6 mm	Instrumenty biomedyczne (Univentor)	-
Kleszczyki do przysłony (10cm, zakrzywione, ząbkowane)	FST	14007-14
Nożyczki do irysów (11cm, proste, węglik wolframu)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, ogrzewane elektrycznie, smWymiary zewnętrzne: 257x110x18 mm.Powierzchnia grzewcza: 190x90 mmUsuwanie izofluranu wydostającego się z maski oddechowej odbywa się w dół zgodnie z przepisami	Instrumenty Biomedyczne (Univentor)	-
Izofluran (Attane)	JD medyczne		znieczulenie wziewne Mikroskop
świetlny Basic DM E	Leica-4x		(brak danych 0,1 ∞/-), 10x (brak danych 0,22 ∞/0,17), 40x (brak danych 0,65 ∞/0,17), 100x (brak danych 1,25 ∞/0,17) Cele
mikropipet	Science-Products	P-97
Kleszczyki hemostatyczne do komarów (12,5 cm, zakrzywione)	FST	13010-12
Thermopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Materiał rurki do łączenia wszystkich częściŚrednica zewnętrzna: 6mmŚrednica wewnętrzna: 4mmGrubość ścianki: 1mm	Instrumenty biomedyczne (Univentor)
Nożyczki Vannas (8 cm, proste)	FST	15009-08

do