Stereotaktyczne wstrzykiwanie hydrożelu do mysiego modelu po udarze

Streszczenie

Źródło: Wilson, K.L., et al. Wstrzyknięcie hydrożelowych rusztowań biomateriałowych do mózgu po udarze. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie hydrożelu do rdzenia udarowego myszy po udarze, podkreślając jego rolę w tworzeniu rusztowania, które naśladuje macierz zewnątrzkomórkową, promuje infiltrację komórkową i wspiera angiogenezę, podkreślając jej potencjał neuroterapeutyczny w rekonwalescencji po udarze.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Wstrzykiwanie hydrożelu lub innych biomateriałów

1. Wykonaj iniekcję biomateriałów w czasie zdefiniowanym przez użytkownika. W tym eksperymencie zastrzyki wykonywano między 5 a 7 dniem po udarze. Wstrzykuje się 2 - 6 μl hydrożelu.
   1. Włącz poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia (37 °C).
   2. Przygotuj autoklawowane nożyczki, kleszcze, bawełnę, maść do oczu weterynarza, klej chirurgiczny lub materiał do szycia, sterylny alkohol i chusteczki z beta-jodem. Przygotuj wiertło do kości za pomocą sterylnych końcówek wiertarskich i szklanych strzykawek Hamilton o pojemności 25 μl z metalowymi igłami 30 G.
   3. Włącz sterylizację kulek do 160 °C, aby umożliwić sterylizację narzędzi między myszami.
   4. Podłącz pompy wtryskowe do urządzenia stereotaktycznego. Ustaw natężenie przepływu na 1 μl/min i ustaw objętość na 4 μl.
   5. Przygotuj czystą klatkę dla myszy po operacji.
2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej o stężeniu izofluranu 4%, aby znieczulić ją, aż spontaniczny ruch ustanie, a jej oddech zacznie się zmniejszać, a tempo oddychania będzie powolne.
   1. Po zaśnięciu, przenieś i przymocuj mysz do urządzenia stereotaktycznego o stężeniu izofluranu 1,5%.
   2. Nałóż maść do oczu weterynarza na oba oczy.
   3. Ogol futro, które mogło odrosnąć z głowy myszy, i aseptycznie przygotuj obszar za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem, a następnie chusteczki z jodem beta. Powtórz trzy razy.
      UWAGA: Jeśli to konieczne, użyj dodatkowej chusteczki nasączonej alkoholem na końcu, aby usunąć cały jod beta, ponieważ powoduje on podrażnienie skóry i prowadzi do swędzenia czaszki myszy po operacji.
3. Używając małych nożyczek i/lub kleszczy, ponownie otwórz skórę nad mózgiem. Użyj bawełny ze sterylną solą fizjologiczną lub PBS (solą fizjologiczną buforowaną fosforanem), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z czaszki. Widoczne będzie biało-żółte kółko (obrys, rysunek 1B) i otwór na zadziory z wiertła. Jeśli martwa tkanka nie jest widoczna, prawdopodobnie nie doszło do udaru. Jeśli otwór zadziorów nie jest wyśrodkowany nad pociągnięciem, nawiercić ponownie, aby go wyśrodkować.
4. Ustawić pompę wtryskową nad myszą i zablokować ją pod kątem 90°. Oczyścić strzykawkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej lub roztworem PBS przed ponownym załadowaniem materiału.
   1. Po oczyszczeniu zdemontuj szklaną strzykawkę, tak aby nie było igły. Ponownie załadować strzykawkę za pomocą pipety wyporowej o pojemności 25 μl z 10 μl hydrożelu (lub innego biomateriału z komórkami lub bez).
   2. Za pomocą tłoka strzykawki wepchnąć żel do końca przedniej części strzykawki. Następnie ponownie złożyć strzykawkę i kontynuować przeciskanie, aż żel zacznie widocznie wydzielać się z igły.
5. Umieścić strzykawkę na pompie. Może być konieczne wyregulowanie tylnej części pompy, aby strzykawka pasowała. Ustaw natężenie przepływu na 30 μl/min, wybierz opcję Wycofanie lub Wstrzyknięcie w zależności od kierunku, w którym ma się poruszać, a następnie naciśnij przycisk Start. Naciśnij Stop, gdy tył pompy znajdzie się we właściwym miejscu.
   1. Przykręć tylną część pompy, aby strzykawka była bezpieczna. Jeśli wcześniej dokonano regulacji, upewnij się, że natężenie przepływu jest ustawione z powrotem na 1 μl/min i jest ustawione na wstrzykiwanie.
6. Przesuń pompę w kierunkach x i y, aby zorientować ją nad otworem. Przesunąć pompę w dół w kierunku z, aż igła strzykawki dotknie górnej części otworu.
7. Zresetuj literę Z na konsoli wyświetlacza cyfrowego. Następnie przesunąć strzykawkę w dół w kierunku z 0,750 mm. Jeśli strzykawka wygina się lub występuje opór, oznacza to, że czaszka albo się zagoiła, albo nie została całkowicie przewiercona i musi zostać ponownie nawiercona.
8. Naciśnij Start na konsoli pompy, aby wstrzyknąć 4 - 6 μl hydrożelu z szybkością 1 μl/min.
9. Ustaw 5-minutowy timer, gdy pompa przestanie wstrzykiwać, aby żel mógł rozpocząć sieciowanie.
10. Po 5 minutach powoli pociągnąć strzykawkę, obracając z-nob. Obserwuj, czy jakiś materiał nie został przypadkowo wyciągnięty lub nie wycieka z otworu. Odblokuj pompkę i odsuń ją od myszy, gdy igła znajdzie się wystarczająco daleko od czaszki.
11. Za pomocą kleszczy, kleju chirurgicznego lub szwów zamknij skórę nad głową. Umieść mysz w czystej klatce i obserwuj jej regenerację. Mysz powinna potrzebować około 5 – 10 minut, aby dojść do siebie po znieczuleniu.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie bregmy i lokalizacja kreski. (A) Płaty ciemieniowe spotykają się u góry, tworząc bregmę. Umiejscowienie lasera było wyśrodkowane 2,0 mm na lewo od bregmy. (B) Wizualne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25uL Strzykawka Hamilton 702RN, bez igły	Fishcer Scientific	14824663	Strzykawki używane do wstrzykiwania biomateriałów
25uL Pipeta wyporowa	Gilson	M-25
Regulowana platforma sceniczna	Kopf Instrumenty	901
C57BL/6 Myszy	Jackson Laboratory	664	8-12 tygodni
Montaż klatki Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Długa, średnica 6mm, 4 sztuki - do mocowania lasera do wacików bawełnianych sterotax
	VWR	89031-288
CP 25 końcówki do pipet	Gilson	F148012
Płyta grzewcza	Kopf Instrumenty	HP-4M
IMPAC 6-Zintegrowane centrum anestezjologiczne dla wielu pacjentów	VetEquip	901808
Kleszcze Jewlers #5	Chemikalia GFS	46085
Kleszcze opatrunkowe Miltex Adson, klasa preparcyjna	Intefra Miltex	V96-118
Mini-pompa o zmiennym przepływie	Thomas Scientific	70730-064	Pompa do perfuzje
Znieczulenie gazu myszy Uchwyt głowy	Kopf Instruments	923-B
Skrzynka kontrolna Nanojet	Chemyx	10050
Nagłówek pompy Nanojet	Chemxy	10051	Podłącz do urządzenia stereotaktycznego do wstrzykiwania biomateriału
Igła RN 30G PT STY 3, 0,5 cala	Fishcer Scientific	NC9459562
Niepękające nauszniki słuchowe 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Maść weterynaryjna	Dr. Foster Smith	9N-76855
Mysz z sondą doodbytniczą	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Strzykawka insulinowa z oznaczeniami 1/2 jednostki 0,5 ml	VWR	10002-726	Do wstrzykiwania różowego bengalskiego
systemu barwienia szkiełek StainTray	Simport Scientific	M920-2	Do barwienia szkiełek
Urządzenie sterotaksyjne	Kopf Instruments	940	Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt
Kleszcze studenckie Adson -1x2 zęby	Fine Science Tools	91127-12
Kleszcze studenckie - proste/szerokie	Chwyty Fine Science Tools	91113-10
Regulator temperatury	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Związek Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Vetbond Tissue Adhessive 3 ml	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931