Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Streszczenie

Izolację i ekspansję domniemanych neuronalnych komórek macierzystych (NSCs) z mózgu dorosłych myszy opisali po raz pierwszy Reynolds i Weiss w 1992 roku, stosując chemicznie zdefiniowany, bezsurowiczy system hodowli znany jako test neurosfer (NSA). W tym teście większość zróżnicowanych typów komórek obumiera w ciągu kilku dni hodowli, jednak niewielka populacja prekursorów reagujących na czynniki wzrostu ulega aktywnej proliferacji w obecności epidermalnego czynnika wzrostu (EGF) i/lub podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Komórki te tworzą kolonie niezróżnicowanych komórek nazywane neurosferami, które z kolei mogą być poddawane pasażowaniu w celu zwiększenia puli neuronalnych komórek macierzystych. Co więcej, komórki te można indukować do różnicowania, generując trzy główne typy komórek OUN, tj. neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Test ten stanowi nieocenione narzędzie umożliwiające pozyskanie spójnego, odnawialnego źródła niezróżnicowanych prekursorów OUN, które mogą być wykorzystywane w badaniach in vitro, a także w celach terapeutycznych.

W tym filmie zaprezentowano metodę NSA służącą do generowania i ekspansji NSC z obszaru periwentrykularnego dorosłej myszy, a także przedstawiono wskazówki techniczne pozwalające na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer. Procedura obejmuje pobranie mózgu od dorosłej myszy, mikrodysekcję obszaru periwentrykularnego, przygotowanie tkanki oraz hodowlę w NSA. Pobraną tkankę poddaje się najpierw trawieniu chemicznemu z użyciem trypsyny-EDTA, a następnie dysocjacji mechanicznej w pożywce NSC w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, którą na koniec wysiewa się do NSA. Po 7–10 dniach hodowli powstałe pierwotne neurosfery są gotowe do pasażowania, aby uzyskać liczbę komórek wymaganą do przyszłych eksperymentów.

Protokół

Część 1: Podstawowe przygotowania przed przystąpieniem do sekcji:

1. Odpowiednią objętość pełnej pożywki NSC przygotowuje się poprzez zmieszanie NeuroCult NSC Basal Medium oraz NeuroCult NSC Proliferation Supplements w stosunku odpowiednio 9:1. Pożywkę NSC można również przygotować w laboratorium na podstawie składu pożywki wzrostowej NSC opublikowanego w literaturze¹. Jeśli laboratorium nie posiada dużego doświadczenia w przygotowywaniu pożywek, zdecydowanie zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie pożywek, które przed sprzedażą przeszły kontrolę jakości pod kątem wzrostu NSC (co ma miejsce w przypadku NeuroCult, Stem Cell Technolgies).
2. Pożywkę ogrzewa się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
3. Do celów sekcji i przemywania przygotowuje się zimną minimalną pożywkę niezbędną buforowaną HEPES (HEM) z wysokim stężeniem antybiotyków (10%). Alternatywnie, w tym celu można zastosować bazową pożywkę NSC z dodatkiem antybiotyków.
4. 30-40 ml zimnej pożywki HEM zawierającej antybiotyki przelewa się do sterylnych probówek o pojemności 50 ml przeznaczonych do pobierania mózgów.
5. Do utrzymania mózgów podczas sekcji potrzebne są kilka plastikowych szalek Petri o średnicy 10 cm oraz jedna sterylna szalka Petri z szkła o średnicy 10 cm do umieszczenia wypreparowanej tkanki.
6. Narzędzia chirurgiczne niezbędne do usunięcia mózgu (duże nożyczki, małe nożyczki z ostrzem, duże pincety, małe pincety zakrzywione i mała szpatułka) lub do sekcji tkanki (małe pincety, zakrzywione pincety precyzyjne i skalpel) sterylizuje się w sterylizatorze koralikowym w temperaturze 250°C lub za pomocą innych dostępnych metod autoklawowania.
7. Mikroskop sekcyjny przeciera się 70% alkoholem i ustawia wewnątrz komory PC2.

Część 2: Pobieranie mózgu dorosłej myszy i mikrodysekcja:

1. 2-4 dorosłe myszy (w wieku 5-8 tygodni) zostają znieczulone zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem dotyczącym zwierząt, przy użyciu 3-4% izofluranu lub poprzez podanie doprzestrzenne pentobarbitalu (120 mg/kg).
2. Wykonuje się zwichnięcie stawów szyjnych, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu ani stresu.
3. Znieczulona mysz jest kładziona na brzuchu na chłonnym papierze tkankowym, a głowa jest płukana 70% etanolem w celu sterylizacji obszaru.
4. Duże nożyce są wykorzystywane do oddzielenia głowy zwierzęcia tuż powyżej obszaru rdzenia kręgowego szyjnego.
5. Małe nożyczki z ostrzem są wykorzystywane do wykonania pośrodkowego cięcia w kierunku góra-dół (caudal-rostral), aby odsłonić czaszkę.
6. Przecięte brzegi skóry służą do przytrzymania głowy, a następnie każde ostrze małych nożyczek jest umieszczane w każdej z jam oczodołowych, aby wykonać cięcie wieńcowe między orbitami.
7. Wykorzystując otwór wielki (foramen magnum) jako punkt wejścia, wykonuje się cięcie podłużne przez czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego oraz dwa cięcia boczne na połączeniu ścian bocznych z podstawą czaszki. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem mózgu, wykonując niewielkie nacięcia i dbając o to, by kąt ostrzy był jak najmniejszy.
8. Fragmenty czaszki nad każdą półkulą są chwytane i odsuwane na zewnątrz za pomocą zakrzywionej pęsety, aby odsłonić mózg, a następnie przy użyciu małej, zwilżonej szpatułki mózg jest przekładany do probówki 50 ml zawierającej HEM.
9. Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną pobrane.
10. Mózgi są przenoszone do komory PC2 i płukane trzykrotnie wystarczającą objętością zimnego, sterylnego HEM w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń, takich jak krew i sierść. Następnie mózgi są przenoszone do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej HEM.
11. Aby wypreparować obszar okołokomorowy przedmózgowia, szalka z mózgami jest umieszczana pod mikroskopem stereoskopowym przy niskim powiększeniu. Mózgi są następnie ułożone płasko powierzchnią brzuszną do dołu i przytrzymywane od strony ogonowej za pomocą cienkiej, zakrzywionej pęsety. Inna zakrzywiona pęseta jest używana do usunięcia opuszek węchowych.
12. Po usunięciu opuszek węchowych mózgi są obracane, aby odsłonić stronę brzuszną.
13. Wykonuje się cięcie wieńcowe pod kątem 90° na poziomie skrzyżowania wzrokowego, a tylne części mózgów są odrzucane.
14. Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną przecięte.
15. Przy większym powiększeniu przednie części mózgów są obracane tak, aby powierzchnia cięcia była skierowana do góry. Najpierw, za pomocą cienkich, zakrzywionych mikronożyczek lub zakrzywionej, ostrej pęsety, usuwa się i odrzuca przegrodę (septum), a następnie wycina się cienką warstwę tkanki otaczającą ścianę boczną komór, z wyłączeniem miąższu prążkowia i ciała modzelowatego. Wypreparowana tkanka jest zbierana w sterylnej, szklanej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
16. Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji.

Część 3: Przygotowanie tkanek i wysiew komórek:

1. Połączoną tkankę sieka się przez około 1-2 minuty za pomocą ostrza skalpela, aż pozostaną jedynie bardzo małe kawałki.
2. Używa się całkowitej objętości 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA, a całą posiekaną tkankę przenosi się do probówki o pojemności 15 ml. 3 ml trypsyny-EDTA jest wystarczające do prawidłowego trawienia tkanek pobranych od maksymalnie 8 myszy.
3. Probówkę inkubuje się przez 7 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
4. Po zakończeniu inkubacji enzymatycznej probówkę przenosi się z powrotem do komory z wyciągiem i dodaje równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
5. Zawiesinę pipetuje się w górę i w dół, aby zapewnić inaktywację trypsyny, a następnie pelletuje poprzez wirowanie przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.
6. Nadpłyn odrzuca się, a kawałki tkanki resuspendsuje w 150 μl sterylnego podstawowego medium NSC. Po ustawieniu pipety na 200 μl, grudki rozdziela się poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół (3-7 razy), aż do uzyskania gładkiej, mlecznej zawiesiny pojedynczych komórek. Liczba etapów pipetowania zależy bezpośrednio od wielkości cząstek w posiekanej tkance (lepiej siekać tkankę na bardzo małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię aktywności trypsyny). Długotrwała i intensywna dysocjacja mechaniczna może prowadzić do zmniejszenia liczby tworzonych sfer z powodu śmierci neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych.
7. Aby usunąć zanieczyszczenia i nierozdzielone fragmenty, do zdysocjowanej zawiesiny komórek dodaje się podstawowe medium NSC do osiągnięcia całkowitej objętości 10-15 ml. Zawiesinę komórek przepuszcza się przez sito komórkowe 40 μm do probówki o odpowiedniej wielkości, a następnie pelletuje poprzez wirowanie przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.
8. Aby dodatkowo usunąć zanieczyszczenia, zaleca się resuspensję pelletu w 10-15 ml medium NSC i wirowanie zawiesiny komórek przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.
9. Nadpłyn odrzuca się. Następnie komórki resuspendsuje się w odpowiedniej objętości kompletnego medium NSC uzupełnionego o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny.
10. Zdysocjowaną tkankę z jednego mózgu umieszcza się w jednej kolbie T25 (zawierającej 5 ml kompletnego medium). Komórki inkubuje się następnie w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂ przez 7-10 dni, do czasu uformowania się neurosfer. Tkanka pobrana z jednego mózgu zazwyczaj pozwala na wygenerowanie 400-600 neurosfer.

Część 4: Pasażowanie i ekspansja NSC:

1. Gdy neurosfery są gotowe do pasażowania (średnica 150-200 μm), medium z zawieszonymi sferami przenosi się z kolb do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej pojemności i wiruje przy 700 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Nastawnik odlewamy, a sfery resuspendujemy w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Alternatywnie neurosfery można pasażować, stosując metody dysocjacji mechanicznej lub chemicznej opisane w literaturze ^2,3.
3. Zawiesinę komórkową inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 2-3 min, a następnie dodaje równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
4. Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie nieaktywowana.
5. Zawiesinę komórkową wiruje się przy 700 rpm przez 5 min. Następnie odlewa się nadsącz, a komórki resuspenduje w 1 ml medium NSC.
6. 10 μl zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μl błękitu trypanu w celu przeprowadzenia zliczenia komórek.
7. Komórki wysiewa się w stężeniu 5x10⁴ cells/ml w kompletnym medium NSC uzupełnionym o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny do kolby do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Należy użyć 5 ml medium dla kolb T25, 20 ml dla T75 i 40 ml dla T175.
8. Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

W pierwotnej hodowli dorosłych NSC większość komórek obumrze po 2-3 dniach, natomiast komórki prekursorowe reagujące na czynniki wzrostu (w tym komórki macierzyste i progenitorowe) będą proliferować (Rysunek 1) i wytworzą kolonie niezróżnicowanych komórek po 6-8 dniach. W hodowlach tych zazwyczaj występuje znaczna ilość debris, który może przyjąć kulisty kształt i zostać pomylony z neurosferami. Ilość debris jest bezpośrednio zależna od technik mikrodysekcji i przygotowania tkanki. Prawdziwe neurosfery są jasne w fazie (świetliste) i stają się bardziej sferyczne wraz ze wzrostem rozmiaru (patrz wideo). Po 7-10 dniach sfery muszą być okrągłe, ale nie zagęszczone; powinny mieć rozmiar od 150 do 200 μm oraz posiadać sztywne mikrokolce na obwodzie przy dużym powiększeniu (Rysunek 2). Jeśli pozwoli się neurosferom urosnąć zbyt dużym, stają się one ciemne z powodu obumierania komórek w centrum sfer. Duże neurosfery są trudne do dysocjacji i z czasem zaczynają przytwierdzać się do podłoża oraz różnicować.

Rycina 1. Podstawowa hodowla dorosłych NSC 3 dni po wysiewaniu. Strzałki wskazują małe kolonie proliferujących NSC. Powiększenie oryginalne; 20x.

Rysunek 2. Pierwsze przejście neurosfery dorosłego osobnika 7 dni po wysiewaniu. Zwróć uwagę na mikrokolce na obwodzie sfery. Powiększenie oryginalne: 20x.

Dyskusja

Metoda hodowli neurosfer ² zyskała szerokie uznanie w środowisku badawczym nie tylko w zakresie izolacji i badania NSC z OUN ^4-5, ale także w izolacji innych typów domniemanych komórek macierzystych z licznych tkanek, takich jak pierś ⁶ i serce ⁷, a także w identyfikacji komórek macierzystych nowotworów mózgu, piersi i jelita grubego ^8-9, co sugeruje, że ten system hodowli może być stosowany w odniesieniu do wielu populacji somatycznych i nowotworowych komórek prekur...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże podstawowe NeuroCult NSC Basal Medium	Podłoże	Stem Cell Technologies	05700
Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Suplement do podłoża	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsyna-EDTA	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Inhibitor trypsyny z soi	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T6522
Sito do komórek	Sito	BD Biosciences	352340
Kolba T25	Sprzęt hodowlany	Nalge Nunc international	136196
Kolba T80	Sprzęt hodowlany	Nalge Nunc international	178905
EGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	2028-EG
Pen/Strep	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	składnik HEM
*HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H4034	składnik HEM
*Woda destylowana	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
probówki 15 ml	Sprzęt hodowlany	BD Biosciences	352096
probówki 50 ml	Sprzęt hodowlany	BD Biosciences	352070
Precyzyjna pęseta zakrzywiona	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11251‐35
Mała precyzyjna pęseta	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11272‐30
Mała pęseta	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11050‐10
b-FGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	3139-FB
Heparyna	Czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	H4784	rekonstytuowana w PBS
*Aby przygotować HEM, zmieszaj opakowanie MEM 1×10L oraz 160 ml 1M HEPES i uzupełnij objętość do 8.75 L za pomocą wody destylowanej. Ustaw końcowe pH na 7.4 i przechowuj w temperaturze 4°C.