Fotodegradowalna izolacja kolonii bakteryjnych na bazie hydrożelu w układach mikrodołków

Streszczenie

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania kolonii bakteryjnych w układach mikrostudzienek krzemowych. Komórki bakteryjne są najpierw ładowane do mikrostudzienek, zamykane w usieciowanym hydrożelu i hodowane w odrębnych koloniach. Po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego ukierunkowana degradacja hydrożelu umożliwia selektywną ekstrakcję poszczególnych kolonii.

Protokół

1. Szczepy bakteryjne i protokoły hodowli

1. Smugowe kolonie bakterii na płytkach agarowych uzupełnione odpowiednimi pożywkami wzrostowymi. W tym raporcie Bacillus subtilis (szczep 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) jest hodowany na ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM glukozy, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) płytki agarowe uzupełnione 100 μg/ml spektynomycyny i Escherichia coli (szczep 25922, ATCC) na płytkach agarowych ATGN uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny.
   UWAGA: Wcześniejsze doniesienia o kapsułkowaniu i uwalnianiu hydrożelu za pomocą tych materiałów zamiast tego wykorzystywały komórki A. tumefaciens C58
2. Wybierz pożądane kolonie z płytek agarowych ATGN i rozpocznij hodowle przez noc. W przypadku stosowanych tu szczepów E. coli i B. subtilis należy przeprowadzić hodowlę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 215 obr./min w płynnym podłożu ATGN przez 24 godziny. Przechowuj kultury komórkowe w 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.
3. Pobrać kolonie obu szczepów z zapasów glicerolu za pomocą sterylnych pętli inokulacyjnych i inkubować w płynnych pożywkach ATGN przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 215 obr./min.

2. Przygotowanie materiału potrzebnego do wytworzenia hydrożelu

1. Synteza fotodegradowalnego diakrylanu poli(glikolu etylenowego)-o-nitrobenzylu (diakrylanu PEG-o-NB)
   UWAGA: Wewnętrzna synteza diakrylanu PEG-o-NB została dobrze opisana i wcześniej opisana. Alternatywnie, ponieważ synteza jest rutynowa, można ją zlecić na zewnątrz z zakładu syntezy chemicznej.
2. Bufor sieciujący
   1. Weź przepis na wybrane podłoże dla szczepu bakteryjnego i przygotuj pożywkę z 2x składnikami odżywczymi. Dodać fosforan, np. NaH₂PO_4, do pożywki do końcowego stężenia 100 mM. Następnie dostosuj wartość pH do 8 za pomocą 5 M NaOH (aq).
   2. Wysterylizować roztwór buforowy i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Należy pominąć wszelkie metale przejściowe obecne w pożywce, ponieważ metale te katalizują utlenianie tioli do dwusiarczków.
3. PEG-o-NB-diacrylate solution
   1. Na każdy mg podwielokrotnego proszku diakrylanu PEG-o-NB (o masie cząsteczkowej 3,400 Da) dodaj 3,08 μl ultraczystej wody, aby osiągnąć stężenie 49 mM diakrylanu PEG-o-NB (stężenie akrylanu 98 mM).
   2. Zmieszać roztwór, aż będzie dobrze wymieszany i przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
4. 4-ramienny roztwór PEG-tiol
   1. W przypadku 4-ramiennego preparatu PEG-tiol (10 000 Da o masie cząsteczkowej) dodać 4 μl ultraczystej wody na mg proszku, aby osiągnąć stężenie 20 mM (80 mM stężenia tiolu).
   2. Mieszać ten roztwór aż do jego dobrego wymieszania i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

5. Wytwarzanie matryc krzemowych z mikrodołkami

1. Powłoka parylenowa: Użyj standardowego protokołu opisanego w poprzednich artykułach badawczych, aby pokryć płytki krzemowe parylenem.
2. Mikrofabrykacja: Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w literaturze, aby zaprojektować i wytworzyć matrycę mikrostudzienkową (rysunek 1).
   UWAGA: Do wytworzenia matryc mikrodołkowych na płytkach krzemowych pokrytych parylenem zastosowano standardowe techniki fotolitograficzne

.

7. Tworzenie hydrożelu na matrycach mikrostudzienkowych

1. Wysiewanie bakterii w układach mikrostudzienek
   UWAGA: 700 μl zawiesin komórkowych 0,1 OD₆₀₀ (gęstość optyczna przy długości fali 600 nm) wysiewano na podłożach układu mikrostudzienek, a w celu usunięcia komórek z tła zastosowano metodę lift-off parylenu.
2. Przygotować roztwór prekursora hydrożelu, dodając 5,6 μl dikrylanu PEG-o-NB z 12,5 μl soli fizjologicznej ATGN buforowanej fosforanem o pH 8 i mieszając z 6,9 μl czteroramiennego roztworu tiolu PEG.
3. Pobrać pipetę 12,5 μl roztworu prekursora na niereaktywnym, perfluoroalkilowym szkiełku podstawowym i umieścić dwie stalowe przekładki o grubości 38 μm (patrz Tabela Materiałów) po dwóch przeciwnych stronach podłoża z matrycy mikrostudzienkowej zaszczepionej komórkami.
4. Odwrócić szkiełko ze szkła perfluoroalkilowego kropelką roztworu prekursora i umieścić kropelkę na środku podłoża mikrostudzienki. Następnie inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu wytworzenia hydrożelu.
5. Delikatnie wyjmij szkiełko z podłoża mikrostudzienki. Membrana hydrożelowa powinna pozostać przymocowana do podłoża mikrostudzienki.

Wyniki

Rysunek 1: Projektowanie i produkcja układów mikrostudzienek. (A) Do produkcji tablic mikrodołkowych zastosowano standardowe techniki mikrowytwarzania wafle krzemowe. (B) Każdy substrat składał się z 7 x 7 u...

Materiały