Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Streszczenie

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Protokół

1. Ogólne odczynniki i przygotowanie pożywek do ekstrakcji membranowej

1. Pożywka do hodowli bakterii: Przygotować i wysterylizować 1 l pożywki bulionowej w dokładnie oczyszczonej i autoklawizowanej kolbie o pojemności 2 l.
2. Ogólny bufor do sporządzania zawiesiny (1 M bufor tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris Buffer) pH 7,5; 50 ml): Rozpuścić 6,05 g zasady Tris w 30 ml_H2O. Dostosować pH do 7,5 za pomocą 5 M HCl. Dostosować końcową objętość do 50 ml za pomocą ultraczystego_H2O.
3. Główny zapas dwuwartościowego roztworu chelatacji kationów (0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego, EDTA pH 8; 100 ml): Dodać 18,6 g disodowego tetra....

Wyniki

Rysunek 1: Schemat przedstawiający procedurę izolacji błony bakteryjnej Gram-ujemnej opisaną w tym artykule metod. Przedstawiono procedurę stosowaną do pobierania komórek bakteryjnych i izolowania błony całkowitej, wewnętrznej (IM) i zewnętrznej (OM). Pod.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 L Butelki wirówkowe, PC/PPCO, super speed, z nakrętką uszczelniającą, Nalgene	VWR	525-0466
1 l Butelka do przechowywania mediów Pyrex z nakrętką wysokotemperaturową	VWR	10416-312
2000 mL Kolba Erlenmeyera, wąska usta	VWR	10545-844
4-20% mini prefabrykowane żele białkowe PROTEAN, 12 dołków	BIORAD	4561095
4x Laemmli bufor do próbek 10 ml	BIORAD	1610747
50 ml sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu	VWR	89049-174
7 mL Homogenizator tkankowy Dounce z dwoma szklanymi tłuczkami	VWR	71000-518
Zespół butelki z poliwęglanu 70 ml	Beckman Coulter Life Sciences	355622
Proszek agarowy	Laboratoryjny	A10752
B10P z sondą pH	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (wersja laboratoryjna)	ThermoFisher Scientific	50136146
Nukleaza benzonazowa	MilliporeSigma	70746-3
EDTA sól disodowa dwuwodna 99,0-101,0%, kryształy, ultraczysty bioodczynnik klasy biologii molekularnej, J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Rotor stałokątowy Fiberlite F13-14 x 50cy	ThermoFisher Scientific	75006526
Kwas solny 6,0 N	VWR	BDH7204
IBI Naukowa wytrząsarka platformy orbitalnej	Fischer Scientific	15-453-211
LB Młynek do bulionu	VWR	214906
Lizozym, Białko jaja, ultra czysty VWR		VWRV0063
Sześciowodny chlorek magnezu	Sigma Aldrich	M2670
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
Proteaza -50, bez EDTA	G Biosciences	786-334
Wodorotlenek sodu ≥99,99%	VWR	AA45780-22
Wirówka Sorval RC 6 Plus	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
	MiliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti wirnik wahliwo-kubełkowy	Beckman Coulter Life Sciences	331362
Tris(hydroksymetylo)aminometan (TRIS, Trometamol) ≥99,9% (sucha masa), ultraczysty bioodczynnik Klasa biologii molekularnej, J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Tytanowy wirnik typu 45 Ti o stałym kącie nachylenia	Beckman Coulter Life Sciences	339160
Ultra-przezroczysta rura, 14 x 89 mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2	VWR	102091-234

pH-metr VWR