Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Streszczenie

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Protokół

1. Ogólne odczynniki i przygotowanie pożywek do ekstrakcji membranowej

1. Pożywka do hodowli bakterii: Przygotować i wysterylizować 1 l pożywki bulionowej w dokładnie oczyszczonej i autoklawizowanej kolbie o pojemności 2 l.
2. Ogólny bufor do sporządzania zawiesiny (1 M bufor tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris Buffer) pH 7,5; 50 ml): Rozpuścić 6,05 g zasady Tris w 30 ml_H2O. Dostosować pH do 7,5 za pomocą 5 M HCl. Dostosować końcową objętość do 50 ml za pomocą ultraczystego_H2O.
3. Główny zapas dwuwartościowego roztworu chelatacji kationów (0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego, EDTA pH 8; 100 ml): Dodać 18,6 g disodowego tetraoctanu etylenu·2H₂O do 80 ml_H2O. Energicznie wymieszać i dostosować pH do 8,0 wodorotlenkiem sodu (NaOH). Dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystego H₂O.
   UWAGA: Sól disodowa EDTA nie rozpuści się, dopóki pH roztworu nie zostanie dostosowane do ~8,0 przez dodanie NaOH.
4. Bufor osmotyczny A (0,5 M sacharozy, 10 mM Tris pH 7,5; 1 l): Odważyć 171,15 g sacharozy i przenieść ją do butli o pojemności 1 l. Dodać 10 ml 1 M Tris pH 7,5. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l za pomocą ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Lizozym (10 mg/ml; 5 ml): Odważyć 50 mg lizozymu (białka jaja kurzego) i rozpuścić w 5 ml ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Rozcieńczony dwuwartościowy roztwór chelatacyjny kationów (1,5 mM EDTA; 500 ml): Dodać 1,5 ml 0,5 M EDTA (krok 1.3) do 497,5 ml ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Bufor osmotyczny B (0,2 M sacharozy, 10 mM Tris pH 7,5; 2 l): Odważyć 136,8 g sacharozy i przenieść ją do butli o pojemności 2 l. Dodaj 20 ml 1 M Tris pH 7,5. Doprowadzić końcową objętość do 2 l za pomocą ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
8. Kofaktor nukleazy (1 M chlorek magnezu, MgCl₂; 10 ml): Rozpuść 2,03 g MgCl₂·6H₂O w 8 ml ultraczystego_H2O. Dostosuj objętość do 10 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
9. Koktajl roztworu nukleazy zawierający enzymy RNazy i DNazy: Patrz tabela materiałów. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
10. Koktajl inhibitorów proteazy: Patrz tabela materiałów. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
11. Gradientowy roztwór izopikeniczny sacharozy o niskiej gęstości (20% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 20 g sacharozy i przenieść do butli o pojemności 200 ml. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
12. Izopikniczny roztwór gradientowy sacharozy o średniej gęstości (53% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 53 g sacharozy i przenieść do 200 ml cylindra miarowego. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przygotuj ten roztwór w cylindrze z podziałką, aby zapewnić dokładność ze względu na wysoką zawartość procentową sacharozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj, aż sacharoza całkowicie rozpuści się w roztworze. Ten proces może potrwać kilka godzin.
13. Izopikniczny roztwór gradientowy sacharozy o dużej gęstości (73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 73 g sacharozy i przenieść do 200 ml cylindra z podziałką. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystego_H2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przygotuj ten roztwór w cylindrze z podziałką, aby zapewnić dokładność ze względu na wysoką zawartość procentową sacharozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj, aż sacharoza całkowicie się rozpuści. Ten proces może potrwać kilka godzin.
14. Bufor do przechowywania z izolowaną membraną (10 mM Tris Buffer pH 7,5; 1 L): Dodać 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7,5 do kolby o pojemności 1 l i dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ultraczystego_H2O.

2. Przygotowanie bakterii do ekstrakcji membranowej

1. Umieść bakterie z zamrożonych zapasów glicerolu na świeżych płytkach agarowych. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C po rozwinięciu się kolonii. Zaszczepij pojedynczą kolonię w probówce o pojemności 5 ml wypełnionej pożywką bulionową i hoduj bakterie według uznania przez noc.
2. Rozcieńczyć wstecznie nocną kulturę bakteryjną w 1 litrze preferowanej pożywki bulionowej i hodować bakterie, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości optycznej.
   UWAGA: Inokulacja pojedynczej kolonii bakteryjnej w 1 litrze pożywki bulionowej jest zalecana dla zmutowanych genotypów, które są podatne na hamowanie fenotypów wzrostu, ale niektóre bakterie Gram-ujemne po prostu rosną wolniej niż inne. Jeśli nie jest możliwe osiągnięcie wystarczającej gęstości hodowli przez inokulację pojedynczej kolonii, jedną ze strategii synchronizacji wzrostu jest rozcieńczenie wsteczne kultury przez noc do 1 litra pożywki. Skład błony bakteryjnej różni się w zależności od fazy wzrostu kultury (faza logarytmiczna lub stacjonarna). Krzywe wzrostu mierzące zmianę gęstości optycznej kultur bakteryjnych w funkcji czasu powinny być wykonane dla wszystkich szczepów w celu skorelowania gęstości hodowli z fazą wzrostu.
3. Kolby zawierające kultury bulionu umieścić na lodzie. Odczytaj gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) i oblicz objętość hodowli, która odpowiada między 6,0 a 8,0 x 10¹¹ jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU). W przypadku S. Typhimurium odpowiada to 1 litrowi kultury przy OD₆₀₀ między 0,6 - 0,8, ponieważ OD600 1,0 jest równe około 1,0x10⁹ CFU/ml. Dodać tę objętość do probówki wirówkowej i upewnić się, że pozostałe kultury pozostaną na lodzie do czasu, gdy będą miały być użyte.
Bakterie osadzać
4. przez wirowanie w temperaturze 4 °C w temperaturze 7 000-10 000 x g w wirówce szybkoobrotowej o stałym kącie przez 10 minut.
   UWAGA: Wstępnie schłodzić i utrzymywać wirówki w niskiej temperaturze. Próbki należy utrzymywać na lodzie przez cały czas trwania procedury.
5. Zdekantować i ostrożnie wyrzucić supernatant.
   UWAGA: Jeśli frakcje membranowe nie mają być natychmiast ekstrahowane, osad można błyskawicznie zamrozić i/lub przechowywać w temperaturze -80 °C. Zaleca się jednak bezpośrednie przystąpienie do plazmolizy w tym samym dniu, w którym pobierane są komórki, szczególnie w przypadku gatunków nieenterobakteryjnych.

3. Dysocjacja błony zewnętrznej i plazmoliza

1. Rozmrozić granulki komórek na lodzie, jeśli były wcześniej przechowywane w temperaturze -80 °C, i zachować próbki na lodzie do końca procedury. Zawiesić każdą osadkę komórkową w probówce wirówkowej w 12,5 ml buforu A. Dodać mieszadło magnetyczne do zawiesiny komórek.
2. Dodać 180 μl lizozymu 10 mg/ml (końcowe stężenie 144 μg/ml) do każdej zawiesiny komórek. Próbki należy przechowywać na lodzie, mieszając przez 2 minuty.
3. Dodaj 12,5 ml 1,5 mM roztworu EDTA do każdej reprodukcji komórek i kontynuuj mieszanie na lodzie przez dodatkowe 7 minut.
4. Zdekantować zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 9 000-11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Wyrzuć supernatanty do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zatrzymaj granulki na lodzie.
6. Dodać 25 ml buforu B do osadu komórkowego.
7. Dodać 55 μl 1 M MgCl₂, 1 μl odczynnika nukleazy RNazy/DNazy (aby uniknąć problemów z lepkością związanych z bakteriami przechodzącymi plazmolizę przed homogenizacją) i 1 μl koktajlu inhibitorów proteazy do objętości buforu B, który znajduje się na wierzchu osadu komórkowego
8. Ponownie zawiesić osad w mieszaninie buforu B. Energicznie pipetować i wirować, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mieć jednorodny roztwór przed przejściem do kroku 4 tego protokołu. Zawieszone komórki powinny mieć lepki wygląd i konsystencję przypominającą ciasto.
9. Wirować każdą próbkę przez 15 s. Zatrzymać zawiesiny na lodzie i przejść do kroku 4.

4. Homogenizacja i liza pod ciśnieniem
UWAGA: Do lizy można zastosować kilka metod. Sonikacja nie jest idealna ze względu na wytwarzanie ciepła. Można osiągnąć lizę osmotyczną, ale często jest ona nieefektywna. Dlatego zalecamy lizę pod wysokim ciśnieniem. Lizę pod wysokim ciśnieniem można osiągnąć za pomocą różnych przyrządów. Proponujemy maszyny do homogenizacji, takie jak French Press lub Emusliflex. Pracujemy z wieloma typami bakterii Gram-ujemnych, których reakcja na roztwory sacharozy o wysokiej zawartości osmolarnej jest różna. Etap homogenizacji wysokociśnieniowej poprawia wydajność, powtarzalność i wydajność.

1. Schłodzić komorę French Press w temperaturze 4 °C lub włożyć metalową cewkę z homogenizatora na lód.
2. Wlej próbkę do francuskiej celi ciśnieniowej lub cylindra homogenizatora i doprowadź do pożądanego ciśnienia homogenizacji (10 000 psi powinno być wystarczające w przypadku korzystania z prasy francuskiej lub 20 000 psi w przypadku stosowania homogenizatora).
3. Dostosuj natężenie przepływu na wylocie do około jednej kropli na sekundę, utrzymując ciśnienie w przypadku korzystania z prasy francuskiej.
4. Zebrać lizat komórkowy w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, trzymając próbki na lodzie.
5. Powtórzyć kroki 4.2-4.4 trzy do pięciu razy, aby osiągnąć całkowitą lizę, która zwykle objawia się stopniowym wzrostem przezroczystości próbki.
   UWAGA: Komorę próbki należy umyć i wyrównać buforem B pomiędzy próbkami.
6. Utrzymuj lizowane komórki na lodzie.

5. Całkowite frakcjonowanie membranowe

1. Odwirować zlizane próbki bakteryjne o masie 6,169 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pozostałego nienaruszonego materiału komórkowego. (np. nielizowane komórki bakteryjne).
2. Rozprowadzić pozostałą część supernatantu, który teraz zawiera homogenizowane membrany, do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania.
   UWAGA: W razie potrzeby próbki komórek można zrównoważyć przez rozcieńczenie buforem B.
3. Ultraodwirować lizaty komórkowe przy 184 500 x g przez co najmniej 1 godzinę, w temperaturze 4 °C. Ten etap można wykonać przez noc bez wpływu na jakość membran.
4. Odrzucić pozostały supernatant obecny w probówce ultrawirówki i pozostawić granulki membrany na lodzie (rysunek 1).
5. Zawiesić granulki membrany w 1 ml roztworu gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości za pomocą homogenizatora szklano-odbitego. Przenieść homogenat próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura i zachować na lodzie.
   UWAGA: Jeśli pożądana jest tylko analiza całkowitego składu błony, 1 ml roztworu gradientu izopikninowo-sacharozowego o niskiej gęstości zastąpić 1 ml izolowanego buforu do przechowywania membrany. Krok 5.5 jest punktem końcowym izolacji, jeśli pożądane są tylko całkowite próbki błony bakteryjnej. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy wymagana jest dalsza analiza.

6. Ultrawirowanie gradientu gęstości w celu oddzielenia podwójnych membran

1. Zbierz odpowiednią liczbę 13 ml polipropylenowych lub ultraprzezroczystych probówek z otwartym dachem, przeznaczonych do wahadłowego wirnika kubełkowego i ultrawirówki.
2. Trzymaj probówkę w lekko pochylonej pozycji i przygotuj gradient sacharozy, powoli dodając roztwory sacharozy od większej gęstości do niższej gęstości w następującej kolejności: 2 ml 73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 mL 53% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   1. Następnie, Dodać całkowitą frakcję membranową (1 ml), która została ponownie zawieszona w 20% w/v roztworze sacharozy (krok 5.5). Unikaj mieszania frakcji membranowej z roztworem sacharozy, który znajduje się pod nią. Pomiędzy każdą z tych warstw powinny być widoczne podziały.
   2. Na koniec napełnij probówkę roztworem gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości (ok. 6 ml). Polipropylenowe i ultraprzezroczyste rurki z otwartym wierzchem powinny być wypełnione tak bardzo, jak to możliwe (2 lub 3 mm od góry rury) w celu podparcia rury.
3. Korekta dla Acinetobacter baumannii 17978
   1. Dostosuj dostosowany gradient sacharozy do stosowania z różnymi próbkami bakterii. W przypadku A. baumannii, następujący gradient sacharozy zapewnił pełniejsze oddzielenie błon (ryc. 2).2 ml 73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 ml 45% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   2. Następnie dodaj całkowitą frakcję błony (1 ml), która została ponownie zawieszona w 20% w/v roztworze sacharozy (krok 5.5). Unikaj mieszania frakcji membranowej z roztworem sacharozy, który znajduje się pod nią. Pomiędzy każdą z tych warstw powinny być widoczne podziały.
   3. Na koniec napełnij probówkę roztworem gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości (ok. 6 ml). Polipropylenowe i ultraprzezroczyste rurki z otwartym wierzchem powinny być wypełnione tak bardzo, jak to możliwe (2 lub 3 mm od góry rury) w celu podparcia rury.
4. Próbki należy ultraodwirować za pomocą rotora z odchylanym wiadrem o temperaturze 288 000 x g i temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: Dla objętości użytych w poprzednich krokach zalecamy czas wirowania od 16 godzin do 23 godzin.
5. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 około 5 mm od punktu. Za pomocą pipety usuń górną brązową warstwę błony wewnętrznej (IM). Przenieść frakcję IM do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania.
6. Pozostaw około 2 ml roztworu sacharozy powyżej granicy faz 53-73%, aby upewnić się, że dolna biała błona zewnętrzna (OM) nie jest zanieczyszczona krzyżowo frakcją IM. Powtórz procedurę pipetowania od kroku 6.4 dla frakcji OM (rysunek 1).
   UWAGA: Membrany można również zebrać, nakłuwając igłą probówki wirówkowe na dole i zbierając je w postaci frakcji kroplami.
7. Wypełnić pozostałą pustkę probówki ultrawirówkowej buforem do przechowywania z izolowaną membraną i wymieszać przez odwrócenie lub pipetowanie. Próbki należy przechowywać na lodzie.
8. Zebrane teraz umyte i wyizolowane membrany przez ultrawirowanie w temperaturze 184 500 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić membrany przez homogenizację Dounce. Dodaj 500-1000 μl bufora do przechowywania. Próbki należy pobrać do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml.
10. Próbki błony bakteryjnej należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat przedstawiający procedurę izolacji błony bakteryjnej Gram-ujemnej opisaną w tym artykule metod. Przedstawiono procedurę stosowaną do pobierania komórek bakteryjnych i izolowania błony całkowitej, wewnętrznej (IM) i zewnętrznej (OM). Pod...

Materiały