Test do oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Streszczenie

Źródło: Pokhrel, A., et al. Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia test kolorymetryczny do pomiaru nieorganicznego polifosforanu (poliP) w próbkach bakteryjnych. Procedura polega na enzymatycznym przekształceniu poliP w wolny fosforan, który następnie reaguje z molibdenianem i kwasem askorbinowym, tworząc kompleks o niebieskim zabarwieniu. Porównując absorbancję tego kompleksu ze standardową krzywą znanych stężeń fosforanów, można dokładnie określić ilościowo zawartość poliP w próbkach bakteryjnych.

Protokół

1. Pobieranie próbek do ekstrakcji polifosforanów

1. Hoduj bakterie w warunkach będących przedmiotem zainteresowania w celu określenia zawartości poliP. W przypadku tego protokołu należy hodować Lactobacillus reuteri przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania w pożywce do indukcji enzymów jabłkowych (MEI) bez cysteiny (MEI-C).
2. Zbierz wystarczającą ilość komórek przez odwirowanie w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać łącznie 50 – 100 μg białka komórkowego (patrz krok 3 poniżej). W przypadku E. coli jest to 1 ml kultury w fazie logarytmicznej w A₆₀₀ 0,2 - 0,4. W przypadku L. reuteri jest to 1 ml kultury przeprowadzonej przez noc. Dostosuj w razie potrzeby dla innych interesujących gatunków.
3. Całkowicie usunąć supernatant z osadów komórkowych.
4. Zawiesić osady komórkowe w 250 μl buforu do lizy GITC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 50 mM Tris-HCl, pH 7) i poddać lizie przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Należy przestrzegać czasu lizy, ponieważ przedłużona inkubacja w wysokiej temperaturze może spowodować degradację poliP przez hydrolizę. Lizaty mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Izotiocyjanian guanidyny jest solą chaotropową i należy obchodzić się z nią w rękawiczkach i utylizować jako odpady niebezpieczne.

2. Pomiar zawartości białka w lizatach komórkowych

1. Przygotuj wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zawierające 0, 0,1, 0,2 i 0,4 mg ^mL-1 BSA w buforze do lizy GITC.
   UWAGA: Ważne jest, aby standardy BSA były ustalane w GITC, ponieważ GITC wpływa na rozwój koloru testu Bradforda. Wzorce BSA mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C.
2. Podwielokrotność 5 μl rozmrożonych, dobrze wymieszanych lizatów komórkowych i wzorców BSA do oddzielenia studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
3. Dodać 195 μl odczynnika Bradford do każdej studzienki i zmierzyć absorbancję przy 595 nm (A₅₉₅) w czytniku płytek (patrz tabela materiałów).
4. Obliczyć ilość białka w każdym basenie przez porównanie z krzywą wzorcową BSA, korzystając ze wzoru y = mx + b, gdzie y wynosi A₅₉₅, x jest μg BSA, m jest nachyleniem krzywej wzorcowej, a b jest punktem przecięcia y krzywej standardowej. Pomnóż otrzymaną wartość przez 0,05, aby określić całkowitą ilość mg białka w każdej próbce.

3. Ekstrakcja polifosforanu

1. Dodaj 250 μl 95% etanolu do każdej próbki poddanej lizie GITC i wymieszaj.
2. Nałożyć tę mieszaninę na kolumnę wirową z membraną krzemionkową i wirować przez 30 s przy 16 100 x g.
3. Odrzuć przepływ, a następnie dodaj 750 μl 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 50% etanolu i odwiruj przez 30 s przy 16 100 x g.
4. Odrzucić przepływowy i odwirowywać przez 2 minuty przy 16 100 x g.
5. Umieść kolumnę w czystej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i dodaj 150 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8).
6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie eluować poliP przez wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 8 000 x g.
   UWAGA: W razie potrzeby eluaty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 tydzień.

4. Trawienie polifosforanu

1. Przygotuj wzorce zawierające 0, 5, 50 lub 200 μM fosforanu potasu w 50 mM Tris-HCl (pH 8).
   UWAGA: Wzorce fosforanu potasu można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
2. Podwielokrotność 100 μl każdego wzorca fosforanowego i wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
3. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą (na próbkę): 30 μl 5x buforu reakcyjnego ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 250 mM octanu amonu, pH 7,5)13, 19 μL_H2Oi 1 μL oczyszczonego ScPPX (1 mg mL-1).
4. Dodać 50 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: W razie potrzeby przetrawione próbki poliP można przechowywać w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.

5. Wykrywanie wolnego fosforanu

1. Przygotuj bazę roztworu detekcyjnego, rozpuszczając 0,185 g winianu antymonu potasu w 200 ml wody, dodając 150 ml 4 N H₂SO₄, a następnie dodając 1,49 g heptamolibdenianu amonu. Mieszać do rozpuszczenia, a następnie doprowadzić do końcowej objętości 456 ml. Przefiltrować roztwór w celu usunięcia cząstek stałych i przechowywać w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do 1 miesiąca.
2. Przygotować roztwór podstawowy 1 M kwasu askorbinowego. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
3. Każdego dnia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 ml zasady roztworu detekcyjnego z 0,88 ml 1 M kwasu askorbinowego. Przed użyciem odczekać, aż roztwór detekcyjne osiągnie temperaturę pokojową.
4. Dodać 50 μl roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorca na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez około 2 minuty, aby umożliwić uzyskanie koloru.
5. Zmierzyć absorbancję przy 882 nm za pomocą czytnika płytek i obliczyć stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu.
   UWAGA: Roztwór detekcyjny zawiera toksyczne sole i mocne kwasy. Nosić rękawice i traktować nadmiar roztworu jako odpad toksyczny.

6. Obliczanie zawartości polifosforanu komórkowego

1. Przelicz stężenia fosforanów oznaczone w kroku 5.5 na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie komórkowym zgodnie z następującym wzorem:
   nmol polyP = 1,5 x (μM fosforan / 10)
   UWAGA: Metoda oparta na krzywej wzorcowej w kroku 5 określa stężenie fosforanu (w μM) w każdej próbce poliP o objętości 100 μl podanej w kroku 4.2. Aby przeliczyć to stężenie na liczbę nmol, 100 μl dzieli się przez 10⁶, aby uzyskać objętość w L, pomnożoną przez stężenie (μmol ^L-1), a następnie pomnożoną przez 1,000 (liczba nmol w μmol). Sprowadza się to do podzielenia stężenia przez 10. Całkowita objętość ekstraktu przygotowanego w kroku 3 wynosi 150 μl, dlatego konieczne jest pomnożenie otrzymanej wartości przez 1,5, aby obliczyć nmol fosforanu obecnego w całym ekstrakcie.
2. Znormalizuj zawartość poliP komórkowego do całkowitego białka komórkowego, dzieląc poliP nmol przez mg białka całkowitego w każdej próbce oznaczonej w kroku 1.4. Poziomy poliP są wyrażane w postaci stężenia poszczególnych wolnych fosforanów pochodzących z poliP.
   UWAGA: W niektórych przypadkach ilość fosforanu pochodzącego z poliP obecna w próbce może wykraczać poza zakres liniowy krzywej wzorcowej fosforanu. Jeżeli poziomy poliP są bardzo wysokie, nadmiar eluatu zawierającego poliP z kroku 3.6 można rozcieńczyć w stosunku 1:10 lub 1:100, w zależności od potrzeb, a następnie ponownie zmierzyć, jak opisano w krokach od 4 do 6.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
E. coli BL21(DE3)	Bulion Millipore Sigma	69450
LB	Fisher Scientific	BP1427-2	Pożywka wzrostowaE. coli
ampicylina	Fisher Scientific	BP176025
chlorek sodu (NaCl)	Fisher Scientific	S27110
chlorek magnezu (MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
Odczynnik Bradford	Bio-Rad	5000205
Bufor Tris	Fisher Scientific	BP1525
kwas solny (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	do regulacji pH roztworów buforowanych trisem
chlorek potasu (KCl)	Fisher Scientific	P217500
glicerol	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS pożywka	mieszanina Teknova	M2101	E. coli pożywka glukozowa
	Fisher Scientific	D161
jednozasadowy fosforan potasu (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	BP362-500
dwuzasadowy fosforan potasu (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500
suszony ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	DF0886-17-0
trypton	Fisher Scientific	BP1421-500
siedmiowodny siarczan magnezu	Fisher Scientific	M63-50
monohydrat siarczanu manganu	Fisher Scientific	M113-500
izotiocyjanian guanidyny	Fisher Scientific	BP221-250
albumina surowicy bydlęcej (bez proteazy)	Fisher Scientific	BP9703100
przezroczyste 96-dołkowe płytki z płaskim dnem	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	dowolne przejrzysta 96-dołkowa płytka będzie działać
Tecan M1000 Nieskończony czytnik płytek	Tecan, Inc.	Nie dotyczy	Każdy czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji przy 595 i 882 nm będzie działał
etanol	Fisher Scientific	04-355-451
kolumny wirujące z membraną krzemionkową	Epoka Life Science	1910-050/250
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1,5 ml probówki do mikrofuge	Fisher Scientific
octan amonu	Fisher Scientific	A637-500
winian potasu antymonu	Fisher Scientific	AAA1088922
4 N kwas siarkowy (H₂SO₄)	Fisher Scientific	SA818-500
heptamolibdenian amonu	Fisher Scientific	AAA1376630
kwas askorbinowy	Fisher Scientific	AC401471000

NC9580154